增齡對(duì)大鼠陰莖海綿體內(nèi)CSE及H2S含量變化的影響①

張?zhí)煊?杜從林,遲寶進(jìn),胡存利,羅振國(guó)

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，黑龍江 佳木斯 154003)

增齡對(duì)大鼠陰莖海綿體內(nèi)CSE及H2S含量變化的影響①

張?zhí)煊?杜從林,遲寶進(jìn),胡存利,羅振國(guó)

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：探討不同月齡大鼠陰莖海綿體內(nèi)CSE、H2S含量的變化規(guī)律，進(jìn)一步明確增齡中ED發(fā)生的機(jī)理。方法:選擇2月齡、8月齡、16月齡及24月齡雄性Wistar大鼠各10只，按月齡不同分成四組(A、B、C、D組)。于相同環(huán)境下給予相同飼料喂養(yǎng)四周后第1日給予阿樸嗎啡100μg/kg于每只大鼠的頸項(xiàng)背部皮下注射，然后持續(xù)觀察60min并記錄勃起次數(shù)。第2日在給予電刺激3V和5V、2ms、25Hz下分別測(cè)定每只大鼠的ICP/MAP。切取各組大鼠陰莖海綿體組織，分別測(cè)定H2S和CSE含量。結(jié)果：隨月齡增加，大鼠海綿體內(nèi)H2S和CSE含量均下降，大鼠陰莖勃起次數(shù)減少。結(jié)論：增齡對(duì)于海綿體組織內(nèi)CSE、H2S水平有顯著影響，內(nèi)源性H2S在大鼠陰莖勃起過(guò)程中起促進(jìn)陰莖勃起的作用，陰莖海綿體組織內(nèi)CSE表達(dá)減弱導(dǎo)致H2S含量減少是老年性ED的發(fā)病原因之一。

陰莖海綿體;胱硫醚-γ-裂解酶;勃起功能障礙

隨男性年齡的增加,其陰莖勃起功能逐漸衰退，勃起功能障礙(ED)出現(xiàn)的幾率漸漸增加[1]。增齡與男性勃起功能障礙的關(guān)系是多因素的[2]，因此對(duì)于深入研究勃起障礙的原因可以有助于提高男性人群的生活質(zhì)量。硫化氫(H2S)是一種新發(fā)現(xiàn)的氣體信號(hào)分子，它可以通過(guò)自由擴(kuò)散的方式在細(xì)胞間傳遞信息，從而調(diào)節(jié)血管平滑肌舒張[3～5]。Srilatha等發(fā)現(xiàn)H2S在陰莖勃起的整個(gè)過(guò)程中起到重要的信使傳遞作用[6]?；铙w組織細(xì)胞依靠?jī)煞N關(guān)鍵酶合成H2S：胱硫脒-β-合成酶(CBS)、胱硫脒-γ-裂解酶(CSE)，但在海綿體組織中以后者起主導(dǎo)作用。本課題通過(guò)對(duì)不同月齡大鼠海綿體內(nèi)CSE及H2S水平變化規(guī)律的研究，旨在進(jìn)一步研究年齡增長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)生勃起功能障礙的原因。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 研究對(duì)象：

Wistar大鼠40只，購(gòu)于黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，隨機(jī)選取2、8、16、24月齡雄性、健康、狀態(tài)良好的，每組體重相差50g以?xún)?nèi)，每個(gè)月齡組10只，按相同月齡分為一組，依次記為A、B、C、D組。各組大鼠置于佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的同一實(shí)驗(yàn)室的相同環(huán)境內(nèi)喂養(yǎng)4周，給予相同的飼料和飲水。

1.1.2 儀器及主要試劑：小鼠抗大鼠CSE抗體購(gòu)自于上海陽(yáng)光試劑有限公司，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗小鼠IgG購(gòu)自于上海瑞齊生物科技有限公司，阿撲嗎啡(APO)購(gòu)自于Sigma公司，RM6240型多導(dǎo)生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)、分光光度計(jì)由佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1APO誘導(dǎo)大鼠陰莖勃起：實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前對(duì)大鼠喂養(yǎng)四周，以達(dá)到實(shí)驗(yàn)最佳狀態(tài)。配制APO：將生理鹽水及維生素C溶液加入至5mgAPO中，APO最終配制濃度達(dá)到10μg/mL, 維生素C達(dá)0.2mg/mL。參照Heaton等人[7]的實(shí)驗(yàn)方法，皮下注射APO于每只大鼠的頸部，以100μg/kg的劑量注射。每只大鼠皮下注射APO完畢時(shí)，立即從籠子下方應(yīng)用攝像機(jī)統(tǒng)計(jì)它們勃起次數(shù)和打呵欠情況，時(shí)間持續(xù)30min。若大鼠龜頭充血或陰莖勃起角度大于90°，則記勃起1次，統(tǒng)計(jì)30min內(nèi)出現(xiàn)的次數(shù)。若大鼠有典型的不隨意張大口且同時(shí)伴有大幅度的呼吸情況，則記打呵欠1次。

1.2.2 海綿體內(nèi)壓(ICP)測(cè)定：觀察勃起次數(shù)后，為測(cè)定大鼠海綿體內(nèi)壓，我們參考了李付彪等人[8]的方法，以戊巴比妥鈉對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔麻醉,其注射用劑量為35mg/kg。為監(jiān)測(cè)大鼠動(dòng)脈血壓,手術(shù)采用頸前正中切口切開(kāi)，然后進(jìn)行右側(cè)頸動(dòng)脈血管插管以測(cè)定平均動(dòng)脈壓(MAP)。接下來(lái)沿著大鼠腹中線(xiàn)切開(kāi)大鼠下腹部,于前列腺的右后外側(cè)緊貼前列腺邊緣尋找到陰莖勃起神經(jīng)。然后將陰莖部分坐骨海綿體切除,暴露出右側(cè)陰莖腳，把24G針頭插至海綿體腳內(nèi)，針頭內(nèi)裝有250U/mL肝素，24G針后連接導(dǎo)管，然后導(dǎo)管與壓力轉(zhuǎn)換器相連后同電腦控制儀相連接，來(lái)測(cè)定陰莖海綿體內(nèi)壓(ICP)。ICPmax/MAP的變化用RM6240型多導(dǎo)生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)來(lái)記錄，給予相應(yīng)參數(shù)的電刺激，電刺激參數(shù)為：3V、5V，2ms，25Hz，連續(xù)單刺激持續(xù)1min，停止5min后可重復(fù)電刺激，本實(shí)驗(yàn)分別記錄第1、7分鐘的3V和5V電刺激下的ICPmax/MAP。

1.2.3 陰莖海綿體組織內(nèi)H2S含量及生成率測(cè)定：將大鼠除去包皮、陰莖頭、尿道海綿體等，分離出陰莖海綿體組織，洗凈血液后制成勻漿，取0.5mL勻漿加入10mmol/L的L-半胱氨酸20μL，2mmol/L的5-磷酸吡哆醛20μL、0.9%NaCl溶液30μL于37℃水浴當(dāng)中反應(yīng)，時(shí)間維持30min; 向之前上述反應(yīng)體系內(nèi)加入250μL1%(W/V) 乙酸鋅溶液、250μL10%(W/V)的三氯乙酸溶液，于37℃水浴鍋中水浴維持60min以使反應(yīng)終止;向上一步完成的反應(yīng)體系內(nèi)加入20mmol/L對(duì)苯二銨鹽酸鹽溶液133μL及30mmol/L三氯化鐵溶液133μL，待反應(yīng)時(shí)間持續(xù)20min后，放入波長(zhǎng)為670nm的紫外分光光度計(jì)中進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)它們的吸光度。根據(jù)硫化氫濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)從而計(jì)算海綿體組織內(nèi)的H2S水平。組織內(nèi)H2S含量用nmol/mg表示[9]。

1.2.4 免疫熒光法測(cè)定陰莖海綿體組織CSE的含量：通過(guò)激光共聚焦檢測(cè)利用CSE抗體標(biāo)記的大鼠陰莖海綿體組織，觀察CSE分布特點(diǎn)，采用Image-ProPlus6.0處理軟件測(cè)定各組大鼠陰莖海綿體CSE熒光強(qiáng)度，從而間接計(jì)算出CSE在陰莖組織內(nèi)相對(duì)含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 勃起功能及ICP

不同月齡組大鼠平均勃起次數(shù)、呵欠次數(shù)及ICPmax/MAP(3V、5V)的測(cè)定結(jié)果，見(jiàn)表1。

表1 不同月齡組大鼠平均勃起次數(shù)、呵欠次數(shù)及ICPmax/MAP(3V、5V)的變化

各組相互比較，3V下ICP/MAP示t(A,B)=4.14，t(B,C)=5.47，t(C,D)=6.00；5V下ICP/MAP示t(A,B)=8.36，t(B,C)= 11.35，t(C,D)= 7.78，各組間差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 大鼠海綿體內(nèi)CSE、H2S含量及生成率測(cè)定

不同月齡組大鼠海綿體內(nèi)CSE及H2S水平的變化，見(jiàn)表2。

表2 不同月齡組大鼠陰莖海綿體內(nèi)CSE、H2S含量和生成率的變化

各組相互比較，H2S含量示t(A,B)=5.67，t(B,C)= 5.67，t(C,D)=8.64，CSE(IA)示t(A,B)=5.12，t(B,C)=6.36，t(C,D)=5.08，各組間差異均有顯著性(P<0.05)。

3 討論

勃起功能障礙(ED)為男性一種臨床比較多見(jiàn)的性功能障礙疾病，會(huì)使患者本人及其家屬陷入巨大的痛苦之中。在ED的各項(xiàng)病因中，年齡已被公認(rèn)為是高危因素，隨著年齡的增長(zhǎng)，ED的發(fā)病率逐步增長(zhǎng)。陰莖海綿體內(nèi)的神經(jīng)調(diào)控是通過(guò)神經(jīng)介質(zhì)發(fā)揮效應(yīng)，NO、CO與H2S已被證實(shí)是體內(nèi)重要的細(xì)胞信使分子[10]。目前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)陰莖勃起生理信號(hào)主要的傳導(dǎo)途徑為NO-cGMP途徑，最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的鈣離子減少引起平滑肌的舒張，但是目前增齡過(guò)程中發(fā)生ED的具體機(jī)制尚未明確。近年來(lái)研究已經(jīng)證實(shí)老齡大鼠陰莖海綿體內(nèi)NOS表達(dá)下調(diào)[8]。但增齡過(guò)程中H2S/CSE體系的改變目前國(guó)內(nèi)外研究均較少，因此本實(shí)驗(yàn)采用2月齡、8月齡、16月齡、24月齡的大鼠進(jìn)行H2S/CSE體系的相關(guān)研究，以進(jìn)一步明晰增齡過(guò)程中ED發(fā)生的具體機(jī)制。

目前常用的檢查動(dòng)物勃起功能的方法有雌雄動(dòng)物交配實(shí)驗(yàn)、APO誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)及電刺激陰莖海綿體神經(jīng)測(cè)定ICP實(shí)驗(yàn)等。但是由于交配實(shí)驗(yàn)的影響因素較多，故本實(shí)驗(yàn)采用另外2種方法聯(lián)合檢查。APO誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)?zāi)軌驕y(cè)定動(dòng)物勃起次數(shù)的變化進(jìn)行記錄，屬于從質(zhì)的方面研究動(dòng)物的勃起功能，為了客觀精確的了解陰莖勃起潛能的變化，我們同時(shí)也采用電刺激陰莖海綿體神經(jīng)實(shí)驗(yàn)觀察記錄ICPmax/MAP的變化，從而在量變上評(píng)價(jià)動(dòng)物的陰莖勃起功能。通過(guò)對(duì)不同月齡的大鼠勃起功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨月齡的增加，大鼠勃起次數(shù)依次減少、ICPmax/MAP(3V、5V)逐漸下降，A組(2.60 ±0.84，0.49±0.06，0.67±0.02)最高，D組(0.50 ±0.52，0.19±0.04，0.28±0.03)最低，各組間大鼠的勃起次數(shù)及海綿體內(nèi)壓的數(shù)據(jù)進(jìn)一步行兩兩比較顯示各組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而各組打呵欠次數(shù)雖有差別但無(wú)顯著性(P>0.05)。從而證實(shí)隨著大鼠增齡，其勃起功能逐漸下降。

陰莖勃起有著十分復(fù)雜的機(jī)制，是在神經(jīng)、內(nèi)分泌及心理效應(yīng)等綜合調(diào)控下所產(chǎn)生的血流動(dòng)力學(xué)改變的結(jié)果[11]，在勃起的整個(gè)過(guò)程里，海綿體平滑肌的舒張起到非常主要的作用。研究已經(jīng)證實(shí)，繼NO、CO之后H2S作為第三種內(nèi)源氣體信號(hào)分子，對(duì)于海綿體的舒張起著非常關(guān)鍵的作用。H2S可通過(guò)ATP敏感的K+通道參與調(diào)節(jié)陰莖勃起，已有的ZhaoW等人[5]的研究結(jié)果表明,H2S可以在不需要第2信號(hào)分子參與的條件下，直接增強(qiáng)KATP通道的電流，使血管平滑肌細(xì)胞膜超極化進(jìn)而調(diào)節(jié)血管平滑肌的松弛。Hosoki等人[12]曾經(jīng)在相關(guān)文章報(bào)道過(guò)，小劑量H2S能夠起到增強(qiáng)NO對(duì)于血管平滑肌細(xì)胞的舒張功能。另外H2S還可與睪酮、CO以協(xié)同作用等方式來(lái)舒張陰莖海綿體血管平滑肌。H2S在活體中主要有2種形式存在：H2S和NaHS。NaHS在體內(nèi)與H2S形成了動(dòng)態(tài)平衡。內(nèi)源性H2S在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的產(chǎn)生主要有三種酶催化，是胱硫醚-γ-裂解酶(cystanthionine-γ-lyase，CSE) 、胱硫醚-β-合成(cysta-nthionine- -β-synthetase，CBS) 、半胱氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(cysteineaminotransferase)。CSE主要存在于各種血管組織及平滑肌中，而CBS主要存在于神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)[3]。CSE作為陰莖組織中合成H2S的主要關(guān)鍵限速酶，其活性的高低直接影響著H2S含量的多少。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨著月齡的增長(zhǎng)，大鼠陰莖海綿體平滑肌組織中H2S的含量及生成率逐漸降低，A組為(87.73±3.01, 4.29±0.37)最高，D組為(59.67±1.99, 1.06±0.08)最低，各組數(shù)據(jù)行兩兩比較，其差異均有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)；海綿體內(nèi)CSE含量也依次減少，A(327.77±36.64)>B(255.57±25.35)>C(188.56±23.10)>D(135.43±21.90)組，且各不同組間差別均有顯著性(P<0.05)。這說(shuō)明，增齡過(guò)程中，陰莖海綿體內(nèi)CSE的表達(dá)逐漸減弱，CSE的含量下降，導(dǎo)致陰莖海綿體組織內(nèi)H2S的生成減少，H2S含量降低，最終致使老年大鼠陰莖海綿體血管平滑肌的舒張能力下降，從而引起ED的發(fā)生。 綜上所述，增齡對(duì)于陰莖海綿體組織內(nèi)CSE、H2S水平有顯著影響，內(nèi)源性H2S在大鼠勃起過(guò)程中起促進(jìn)陰莖勃起的作用，增齡過(guò)程中陰莖海綿體組織內(nèi)CSE表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致H2S含量減少是老年性ED的發(fā)病原因之一。但增齡過(guò)程中CSE表達(dá)下調(diào)的具體機(jī)制以及H2S信號(hào)通路在陰莖勃起過(guò)程中的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究探討。

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黑龍江省衛(wèi)生廳課題，編號(hào)：2013-229；佳木斯大學(xué)校級(jí)自然科學(xué)類(lèi)青年項(xiàng)目，編號(hào)：Sq2013-025。

張?zhí)煊?(1972～)男，黑龍江綏化人，在讀碩士研究生，副主任醫(yī)師。

羅振國(guó)(1964～)男，黑龍江寶清人，學(xué)士，教授，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail:luozhenguo8888@163.com。

R697+.1

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1008-0104(2015)04-0137-02

2015-03-25)