促紅細(xì)胞生成素對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞caspase-3表達(dá)及Omi／HtrA2轉(zhuǎn)位變化和Omi／HtrA2沉默時(shí)對(duì)其的影響

張杰波，劉映峰，繆 緋，劉 芃

（南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東廣州 510282）

在急性心肌梗死患者的再灌注治療中，現(xiàn)階段所采用溶栓或冠脈介入治療，都可能發(fā)生心肌缺血／再灌注 損 傷 （myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）。缺血／再灌注（I／R）的機(jī)制至今仍未完全闡明，臨床上尚無有效的治療方法。促紅細(xì)胞生成素（EPO）的生物多效性已被廣泛證實(shí)，在I／R、炎癥、神經(jīng)創(chuàng)傷等多種生物模型中，EPO具有明顯組織保護(hù)作用，尤其見于MIRI［1-2］。本研究通過體外培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞株，建立H／R細(xì)胞損傷模型，觀察EPO對(duì)細(xì)胞凋亡及Omi／HtrA2轉(zhuǎn)位的影響，并用特異性siRNA干擾片段干擾Omi／HtrA2表達(dá)，以探討Omi／HtrA2在EPO抗凋亡調(diào)控機(jī)制中的核心作用。

1 材料與方法

1．1 材料與試劑 H9C2細(xì)胞株（南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室提供）；胎牛血清、DMEM-高糖培養(yǎng)基、青霉素、PBS磷酸鉀緩沖液、重組人促紅素注射液（CHO細(xì)胞）購(gòu)自山東科興生物制品有限公司；cell-Titer96AQ單溶液細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega Corporation；乳酸脫氫酶（LDH）細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自賽默飛世爾科技公司；cleaved caspase-3多抗、GAPDH 單抗、COX IV 單抗、Omi／HtrA2單抗購(gòu)自Cell Signaling Technology；Pluslight ECL kit（ECL發(fā)光試劑盒）購(gòu)自Forevergen bioscience；線粒體胞質(zhì)分離試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司；HRP標(biāo)記二抗購(gòu)自永諾生物公司。Trizol購(gòu)自Invitrogen；ReverTra Ace qPCR RT Kit購(gòu)自 Toyobo Biochemicals（Japan）；GoTaq?qPCR Master Mix購(gòu)自Promega。

1．2 EPO對(duì)H9C2細(xì)胞缺氧-復(fù)氧的影響

1．2．1 實(shí)驗(yàn)分組 將H9C2細(xì)胞分為：①對(duì)照組（Ctrl）：細(xì)胞用DMEM-高糖培養(yǎng)基正常培養(yǎng)26h，不作任何處理；②缺氧復(fù)氧組（H／R組）：將待處理細(xì)胞、厭氧袋及氧氣指示劑放入?yún)捬豕?，將厭氧罐置于?xì)胞培養(yǎng)箱，待氧氣指示劑從淺紫色變成粉紅色，開始計(jì)時(shí)缺氧時(shí)間，缺氧時(shí)間定為2h，重新將細(xì)胞放置培養(yǎng)箱即為復(fù)氧狀態(tài)，復(fù)氧24h；③H／R＋EPO組（EPO）：同 H／R組缺氧處理2h后，分別加入5、10、20IU／mL的EPO，然后復(fù)氧24h。

1．2．2 細(xì)胞上清液LDH濃度的檢測(cè) 各組細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，提取上清液按照LDH細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒說明書操作測(cè)量細(xì)胞LDH釋放率：

1．2．3 Western blot檢測(cè)cleaved caspase-3表達(dá)提取細(xì)胞蛋白，用Bradford法定量后，采用150g／L聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，50 g／L脫脂牛奶封閉后，將相應(yīng)的一抗cleaved caspase-3（cell signaling ＃9661，1∶1 000），4℃ 過夜后，用TBST每次7min洗2次后，用相應(yīng)稀釋好的二抗（HRP標(biāo)記二抗，1∶5 000，F(xiàn)orevergen）室溫下孵育1～2h，TBST每次7min洗滌3次后，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影（ECL，F(xiàn)orevergen）。用Image J分析目標(biāo)條帶的吸光度值。以GAPDH（HC301，1∶5 000）作為內(nèi)參照，比較不同處理后的蛋白表達(dá)差異。

1．2．4 Western blot檢測(cè)線粒體及細(xì)胞質(zhì) Omi／HtrA2蛋白表達(dá) 選取EPO 20IU／mL組細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，按照線粒體胞質(zhì)分離試劑盒說明書，分離H9C2細(xì)胞胞質(zhì)及線粒體，采用 Western blot檢測(cè)線粒體和胞質(zhì)中Omi／HtrA2蛋白。

1．3 si-HtrA2干擾細(xì)胞及對(duì)缺氧-復(fù)氧的影響

1．3．1 si-HtrA2細(xì)胞轉(zhuǎn)染和干擾效果檢測(cè) si-HtrA2片段及對(duì)照片段［3-4］由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成，干擾序列：5′-GAGGTGATTGGAGTGAACACCATGA-3′，對(duì) 照 序 列：5′-AACAGTCGCGTTTGCGACTGG-3′。

采用小分子干擾脂質(zhì)體法提前48h進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，按Trizol試劑盒提供的操作步驟提取細(xì)胞總RNA，按照RT-PCR試劑盒進(jìn)行cDNA逆轉(zhuǎn)錄及qPCR擴(kuò)增操作。Omi／HtrA2上游引物為5′-AGTGCGAGTGAGGCTACCTA-3′，下游引物為5′-TGG CAACAACAAACTCCCCT-3′；GAPDH 作為內(nèi)參，上游引物5′-GCAAGAGAGAG GCCCTCAG-3′，下游引物5′-TGTGAGGGAGATGCTCAGTG-3′。反應(yīng)結(jié)束后，用 MiniOpticon System and Opticon Monitor軟件進(jìn)行qPCR的相對(duì)定量分析。收集蛋白用Western blot檢測(cè)Omi／HtrA2蛋白表達(dá)水平以驗(yàn)證HtrA2的干擾效果。

1．3．2 Omi／HtrA2干擾處理及對(duì)LDH 和caspase-3的影響 成功轉(zhuǎn)染48h后將細(xì)胞分組：①Ctrl組：轉(zhuǎn)染對(duì)照片段，正常培養(yǎng)26h，不作任何處理；②H／R組：轉(zhuǎn)染對(duì)照片段，缺氧2h，復(fù)氧24h；③si-HtrA2組：轉(zhuǎn)染干擾片段，缺氧2h，復(fù)氧24h。各組細(xì)胞上清液LDH釋放率及cleaved caspase-3表達(dá)的檢測(cè)方法同前文1．2。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD法檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 EPO對(duì)LDH濃度的影響 H／R組細(xì)胞上清液LDH濃度較Ctrl組明顯上升，EPO處理組較H／R組下降，隨著EPO濃度的升高，LDH釋放逐漸下降，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05，圖1）。

圖1 各組細(xì)胞上清液LDH釋放率Fig．1 The release rate of lactate dehydrogenase（LDH）in cell supernatant in all groups

2．2 EPO對(duì)細(xì)胞cleaved caspase-3表達(dá)的影響cleaved caspase-3在H／R組細(xì)胞中表達(dá)較Ctrl組升高（P＜0．05），在EPO處理組中表達(dá)較 H／R組下降，且下降趨勢(shì)具有濃度依賴關(guān)系，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05，圖2）。

圖2 EPO對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞H9C2細(xì)胞的cleaved caspase-3表達(dá)的影響Fig．2 Effect of EPO on the expression of cleaved caspase-3 in cultured H9C2cell line

2．3 EPO對(duì)H9C2細(xì)胞胞質(zhì)及線粒體Omi／HtrA2蛋白表達(dá)的影響 Ctrl組Omi／HtrA2蛋白主要在線粒體（Mito）中表達(dá)，在細(xì)胞胞質(zhì)（Cyto）中表達(dá)較少；H／R組Omi／HtrA2蛋白表達(dá)在胞質(zhì)中表達(dá)較多（向胞質(zhì)發(fā)生轉(zhuǎn)位）；EPO（20IU／mL）組 Omi／HtrA2在線粒體中表達(dá)較多（向胞質(zhì)轉(zhuǎn)位減少），以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05，圖3）。

圖3 各組H9C2細(xì)胞胞質(zhì)及線粒體Omi／HtrA2的相對(duì)表達(dá)水平Fig．3 Expression of Omi／HtrA2was measured in cytoplasm and mitochondria in H9C2

2．4 Omi／HtrA2干擾效果檢測(cè) H／R 組的 Omi／HtrA2蛋白和mRNA表達(dá)與Ctrl組相比無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05，圖4）；干擾Omi／HtrA2組較Ctrl組及H／R組均明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05，圖4）。提示si-HtrA2能有效干擾 Omi／HtrA2表達(dá)。

圖4 Omi／HtrA2干擾時(shí)細(xì)胞Omi／HtrA2蛋白（A）和mRNA（B）表達(dá)的變化Fig．4 Expression of Omi／HtrA2（A）and mRNA （B）

2．5 干擾Omi／HtrA2后H／R細(xì)胞上清液LDH濃度的變化 H／R組細(xì)胞上清液LDH濃度較對(duì)照組明顯上升，si-HtrA2組細(xì)胞較H／R組下降，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05，圖5）。

圖5 干擾Omi／HtrA2后H9C2細(xì)胞培養(yǎng)上清液LDH的釋放率Fig．5 LDH release assay after silencing of Omi／HtrA2in cell supernatant

2．6 Omi／HtrA2干擾對(duì)細(xì)胞cleaved caspase-3表達(dá)的影響 H／R組細(xì)胞表達(dá)cleaved caspase-3較對(duì)照組升高（P＜0．05），si-HtrA2組表達(dá)較 H／R組下降，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05，圖6）。

圖6 各組細(xì)胞cleaved caspase-3的相對(duì)表達(dá)水平Fig．6 Relative expression level of cleaved caspase-3in different groups

3 討 論

細(xì)胞凋亡是MIRI的重要機(jī)制，其凋亡過程受基因調(diào)控，主要由caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程控制。而caspase-3作為該級(jí)聯(lián)反應(yīng)共同的下游關(guān)鍵因子，執(zhí)行死亡程序，被稱為“殺手”蛋白。EPO是在人體腎臟及肝臟分泌的一種耐熱酸性糖蛋白激素，它主要作用于紅系祖細(xì)胞，促進(jìn)其增生、分化和成熟，對(duì)體內(nèi)紅細(xì)胞的分化成熟發(fā)揮至關(guān)重要的作用。但近來研究發(fā)現(xiàn)，EPO具有抗氧化、抗凋亡、抗炎、促進(jìn)上皮細(xì)胞增生等作用［5-7］。在以往的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，EPO被證實(shí)可以減輕急性心肌梗死大鼠模型的心肌梗死面積和透壁程度［8-9］，BULLAR 等［9］在 大 鼠離體心缺 血35 min再灌注2h的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)EPO能夠減少M(fèi)IRI；CAI等［10］在大鼠離體心 MIRI實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)EPO能夠促進(jìn)心臟功能恢復(fù)，減少細(xì)胞凋亡。然而，EPO抗細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制尚不明確。本研究中H9C2細(xì)胞經(jīng)過H／R處理后LDH、caspase-3表達(dá)增加，而EPO可減少H／R細(xì)胞的LDH、caspase-3的表達(dá)，提示EPO對(duì)H／R誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞凋亡有保護(hù)作用。

Omi／HtrA2蛋白是一種新發(fā)現(xiàn)的促凋亡蛋白，在細(xì)胞正常生理情況下存在于線粒體膜間隙，當(dāng)細(xì)胞受到凋亡信號(hào)刺激時(shí)，包含458個(gè)氨基酸殘基的完整Omi／HtrA2通過自我加工，去除N末端133個(gè)氨基酸殘基的跨膜部分，形成成熟的 Omi／HtrA2［11］，穿過線粒體膜進(jìn)入胞質(zhì)，通過與X-連鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性抑制XIAP與caspase-9的結(jié)合，進(jìn)而激活處于下游的caspase-3蛋白表達(dá)。

成熟野生型Omi／HtrA2轉(zhuǎn)位可以有效誘導(dǎo)caspases的活性以及增加XIAP的降解［12］，而利用RNA干擾（RNA interference，RNAi）抑制 Omi／HtrA2的表達(dá)則可以出現(xiàn)相反的現(xiàn)象，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡。CILENTI等［13］發(fā)現(xiàn)，在用順鉑處理的腎細(xì)胞中Omi／HtrA2表達(dá)明顯升高，且伴隨著XIAP的含量降低。用RNAi技術(shù)破壞內(nèi)生性O(shè)mi／HtrA2，順鉑介導(dǎo)的腎細(xì)胞凋亡明顯減少。說明Omi／HtrA2在順鉑介導(dǎo)的腎細(xì)胞凋亡中起到重要作用，通過RNAi阻斷Omi／HtrA2蛋白可減少凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，H／R組caspase-3蛋白及胞質(zhì)中Omi／HtrA2蛋白表達(dá)較Ctrl組明顯增強(qiáng)，EPO組caspase-3蛋白及胞質(zhì)中Omi／HtrA2蛋白表達(dá)水平雖然高于Ctrl組，但較H／R組明顯減少；H／R組細(xì)胞經(jīng)RNAi干擾Omi／HtrA2后，LDH釋放下降，caspase-3蛋白表達(dá)減少，提示當(dāng)胞質(zhì)中Omi／HtrA2蛋白減少，凋亡蛋白酶（caspase）激活受到抑制。這表明EPO在H／R心肌細(xì)胞中可能是通過抑制Omi／HtrA2蛋白從線粒體到胞質(zhì)的轉(zhuǎn)位，抑制caspases酶聯(lián)反應(yīng)，減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生。這為臨床MIRI的治療提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)及干預(yù)靶點(diǎn)。

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