大鼠股骨骨折后腎髓質(zhì)淺層細(xì)胞的凋亡及三七總皂苷的保護(hù)作用

姚 懿，陳丑彥，唐發(fā)兵，孫少華

（1．蘭州大學(xué)第一醫(yī)院病理研究所，甘肅蘭州 73000；2．定西市人民醫(yī)院普外科，甘肅定西 734000）

近年來，隨著道路交通事故及各種機(jī)械傷、墜落傷等高能量損傷發(fā)生率的不斷上升，骨折病例明顯增多。由于下肢起著全身的負(fù)重支撐作用，所以在受外界暴力作用時有很大幾率出現(xiàn)下肢骨折。骨折后機(jī)體由于應(yīng)激反應(yīng)，會出現(xiàn)一系列相應(yīng)的病理生理學(xué)改變。腎臟作為兼有代謝和內(nèi)分泌功能的全身重要臟器，是損傷后各種影響相互作用的一個靶器官。有研究結(jié)果表明，三七總皂苷（panax notoginseng saponins，PNS）通過升高Bcl-2／Bax比值、抑制Bax的過度表達(dá)，可發(fā)揮抑制細(xì)胞過度凋亡的作用［1］。本實驗采用股骨閉合骨折的動物模型，通過分析凋亡調(diào)控基因Bcl-2和Bax的變化，并結(jié)合觀察TUNEL染色細(xì)胞凋亡情況，探討PNS對腎臟髓質(zhì)淺層損傷的影響和保護(hù)性作用。

1 材料與方法

1．1 實驗動物 實驗選用清潔級健康 Wistar大鼠102只，雄性，平均體質(zhì)量（200±10）g，由蘭州大學(xué)動物實驗中心提供。

1．2 實驗儀器及試劑 顯微鏡及顯微照相系統(tǒng)為Olympus BX51及DP71型；電子天平由上海天平儀器廠生產(chǎn)制造；20～200μL及0～10μL微量加樣器由Labsystem公司生產(chǎn)。注射用PNS（云南植物藥業(yè)有限公司）；Bcl-2、Bax原位雜交檢測試劑盒，Bcl-2、Bax免疫組化檢測試劑盒，TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒，即用型SABC免疫組化染色試劑盒，均購自武漢博士德生物工程有限公司；DAB顯色試劑盒由福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司生產(chǎn)。

1．3 方法

1．3．1 股骨干閉合骨折模型的建立 用40mg／L水合氯醛（8mg／kg）對實驗大鼠進(jìn)行腹腔麻醉，麻醉起效后將大鼠仰臥位放置，選取一側(cè)后肢，用電鉆將克氏針（直徑1mm）鉆入骨髓腔，外展內(nèi)旋位固定大鼠下肢于造模支架的鐵砧凹槽上（間距15mm），以截骨刀下緣置于該大腿股骨干中1／3，取砝碼（700g）至約10cm高處，讓其以自由落體方式打擊鈍骨刀進(jìn)而撞擊股骨干中1／3造成骨折。股骨干骨折移位程度可以通過觀察撞擊后克氏針變形角度來掌握。

1．3．2 實驗分組 將實驗大鼠隨機(jī)分為單純骨折組（36只）、骨折治療組（36只）、正常對照組（30只）。前兩組在實施骨折造模后于1、6、12、24、36、48h各處死6只，正常對照組分別在1、6、12、24、36、48h處死5只。治療組于骨折后立即給予PNS 70mg／kg［3］腹腔注射一次，單純骨折組給予腹腔注射同等劑量的生理鹽水一次，對照組不做任何處理。所有實驗大鼠均以頸椎脫臼處死。

1．3．3 組織標(biāo)本的制備、檢測及圖像處理 實驗大鼠處死后，即刻解剖動物，提取腎臟，用中性甲醛及40g／L多聚甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)切片（厚4μm），進(jìn)行 HE染色、免疫組化及原位雜交、TUNEL染色，觀察骨折后腎髓質(zhì)淺層組織形態(tài)和細(xì)胞凋亡變化及各項指標(biāo)的表達(dá)情況。根據(jù)KRAAN等［4］標(biāo)準(zhǔn)，使用配備有Olympus光學(xué)顯微鏡的DP71圖像采集器采集圖片后，用Image Pro-plus 6．0圖像分析軟件分別對免疫組化及原位雜交染色切片所采集的圖像進(jìn)行陽性面積、IA值及吸光度進(jìn)行測量。

1．4 統(tǒng)計學(xué)分析 以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示所有采集到的計量數(shù)據(jù)，統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 20．0統(tǒng)計軟件進(jìn)行，多組間的比較采用方差分析，檢驗水準(zhǔn)取0．05。

2 結(jié) 果

2．1 各組大鼠腎臟髓質(zhì)淺層的組織病理學(xué)變化 把腎髓質(zhì)冠狀切面根據(jù)腎臟損傷情況及解剖結(jié)構(gòu)自外向內(nèi)分為：髓質(zhì)淺層和髓質(zhì)深層。本研究室僅對髓質(zhì)淺層進(jìn)行研究。在單純骨折組中可見腎小管上皮細(xì)胞輕度顆粒變性情況出現(xiàn)在髓質(zhì)淺層；遠(yuǎn)曲小管的上皮細(xì)胞形態(tài)無異常（圖1A）；間質(zhì)小血管可見輕度擴(kuò)張出血。在骨折治療組中，近曲小管顆粒變性減輕，遠(yuǎn)曲小管結(jié)構(gòu)正常，而這些變化隨著時間改變而減輕的趨勢明顯（圖1B）。

2．2 各組大鼠腎髓質(zhì)淺層TUNEL染色結(jié)果 單純骨折組中，腎髓質(zhì)淺層凋亡細(xì)胞在石蠟切片中可清楚地顯示其呈散在分布，凋亡細(xì)胞核呈棕黃色，胞質(zhì)一般不著色或淡著色 （圖2A）；骨折治療組腎髓質(zhì)淺層可見凋亡細(xì)胞數(shù)量少于單純骨折組，呈零星分布，凋亡細(xì)胞核呈棕黃色（圖2B）。

圖1 大鼠骨折后6h腎臟髓質(zhì)組織的HE染色Fig．1 Pathological changes of the rat kidney at 6hafter fracture（HE，×400）A：單純骨折組；B：骨折治療組。圖2 大鼠骨折后6h腎臟髓質(zhì)組織TUNEL染色Fig．2 TUNEL staining of the rat kidney at 6hafter fracture（TUNEL，×200）A：單純骨折組；B：骨折治療組。

2．3 骨折后腎髓質(zhì)淺層組織Bcl-2、Bax的表達(dá)Bcl-2免疫組化陽性表達(dá)見于胞質(zhì)。單純骨折組Bcl-2表達(dá)在1～36h的各時間段均高于正常對照組（P＜0．001，P36h＝0．010），至48h其陽性表達(dá)接近于正常范圍；骨折治療組的Bcl-2陽性表達(dá)在1～48h各時段均較正常對照組高（P＜0．001，表1）。

Bax免疫組化陽性表達(dá)見于胞質(zhì)。單純骨折組Bax陽性表達(dá)在1～12h的各時段均低于正常對照組（P＜0．001）；在12h后陽性表達(dá)已呈現(xiàn)升高的走向，24、36、48h各時段陽性表達(dá)均較正常對照組高（P＜0．001）；骨折治療組在1～48h各時段Bax陽性表達(dá)均較正常對照組低 （P＜0．001，P1h＝0．005）。Bax在骨折后1h時陽性表達(dá)較單純骨折組高（P＜0．001），而在12～48h的表達(dá)明顯較單純骨折組低（P＜0．001，表1）。

表1 骨折后腎髓淺層組織Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)Tab．1 The IOD value of Bcl-2and Bax immunohistochemical expressions in the rat kidney medulla after fracture（±s）

表1 骨折后腎髓淺層組織Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)Tab．1 The IOD value of Bcl-2and Bax immunohistochemical expressions in the rat kidney medulla after fracture（±s）

A：單純骨折組；B：骨折治療組；C：正常對照組；與正常對照組相比，＊P＜0．05；與治療組相比，＃P＜0．05。

組 別 骨折后時間（h）1 6 12 24 36 48 A Bcl-2 15．11±3．35＃＊ 25．99±6．38＊ 26．32±3．29＃＊ 16．81±2．01＃＊ 13．46±1．89＃＊ 9．04±2．26＃Bax 19．34±0．95＃＊ 23．84±3．03＊ 24．68±1．63＃＊ 68．27±0．78＃＊ 71．29±1．67＃＊ 57．17±0．83＃＊B Bcl-2 31．16±3．26＊ 22．69±5．05＊ 37．25±1．43＊ 27．72±4．30＊ 25．29±5．12＊ 13．95±2．80＊Bax 32．10±1．86＊ 25．90±2．31＊ 6．54±0．26＊ 11．75±1．33＊ 13．45±1．62＊ 14．89±0．37＊C Bcl-2 8．05±0．94 8．85±0．64 9．05±0．54 8．45±0．74 7．95±1．07 7．65±1．34 Bax 35．44±0．66 36．03±0．40 35．06±0．75 34．96±0．98 36．43±0．36 35．50±0．60

2．4 骨折后腎髓質(zhì)淺層組織Bcl-2、Bax mRNA的表達(dá) 單純骨折組Bcl-2mRNA表達(dá)在1～48h各時間段較正常對照組均顯著升高（P＜0．001），各時間段的表達(dá)整體呈下降趨勢。骨折治療組在1～48h各時段Bcl-2mRNA表達(dá)均較正常對照組明顯升高（P＜0．001）。Bcl-2mRNA表達(dá)在1h及6h低于單純骨折組（P1h＝0．009、P6h＝0．000），而陽性表達(dá)在12～36h各時間段均較單純骨折組高（P＜0．001，其中P12h＝0．007、P24h＝0．004），陽性表達(dá)發(fā)展至48h低于單純骨折組（P＝0．030，表2）。

單純骨折組，Bax mRNA表達(dá)在6h低于正常對照組（P＝0．012），而在其余各時間段Bax mRNA表達(dá)均較正常對照組明顯升高（P＜0．001）。骨折治療組在1～12h各時段Bax mRNA的表達(dá)均較正常對照組高（P＜0．001），該時間段后mRNA表達(dá)呈下降趨勢，在24h和36h已基本接近于正常對照組，陽性表達(dá)在48h時明顯較正常對照組低（P＜0．001）。Bax mRNA表達(dá)在1～12h各時段均較單純骨折組高，其中在骨折后1h及6h數(shù)據(jù)組間比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0．001），陽性表達(dá)在24～48h各時段均較單純骨折組顯著降低（P＜0．001，表2）。

表2 骨折后腎髓質(zhì)淺層組織Bcl-2mRNA及Bax mRNA的表達(dá)Tab．2 The IA value of Bcl-2mRNA and Bax mRNA expressions in the rat kidney medulla after fracture（IA value，±s）

表2 骨折后腎髓質(zhì)淺層組織Bcl-2mRNA及Bax mRNA的表達(dá)Tab．2 The IA value of Bcl-2mRNA and Bax mRNA expressions in the rat kidney medulla after fracture（IA value，±s）

A：單純骨折組；B：骨折治療組；C：正常對照組。與正常對照組相比，＊P＜0．05；與治療組相比，＃P＜0．05。

組別骨折后時間（h）1 6 12 24 36 48 A Bcl-2 60．57±2．15＃＊ 56．18±1．69＃＊ 42．99±2．18＃＊ 37．64±3．28＃＊ 36．78±2．59＃＊ 33．04±1．54＃＊Bax 31．64±1．08＃＊ 21．22±1．13＃＊ 38．57±1．61＊ 68．18±1．94＃＊ 44．94±1．71＃＊ 42．58±1．55＃＊B Bcl-2 57．48±1．46＊ 45．86±3．15＊ 48．38±3．53＊ 42．05±2．45＊ 50．25±2．05＊ 30．33±2．13＊Bax 52．66±2．20＊ 31．04±1．91＊ 41．35±1．81＊ 26．99±1．14 26．99±1．14 14．69±1．62＊C Bcl-2 18．22±0．67 18．92±0．55 19．01±0．42 17．82±0．84 17．53±0．97 19．20±0．41 Bax 24．82±2．50 25．63±2．10 23．52±3．10 25．07±2．05 24．98±2．40 26．67±1．90

3 討 論

骨折的診療、康復(fù)以及手術(shù)方式和內(nèi)外固定的選擇是目前對骨折的研究重點，而對骨折造成的重要器官并發(fā)癥的研究不多，特別是對在骨折創(chuàng)傷中出現(xiàn)的腎臟細(xì)胞凋亡現(xiàn)象的研究在國內(nèi)外鮮有報道。本文即對骨折所導(dǎo)致的腎損傷的原因、機(jī)制及PNS的保護(hù)作用作了探討。

3．1 骨折所誘發(fā)的腎臟髓質(zhì)細(xì)胞凋亡的機(jī)制 下列因素可能是骨折后所產(chǎn)生的腎臟細(xì)胞凋亡現(xiàn)象的原因：首先，機(jī)體的代償機(jī)制在骨折后開始反應(yīng)，大量的鈣、磷會從血液進(jìn)入尿液被排出體外，細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度的增加可激活Ca2＋／Mg2＋依賴的核酸內(nèi)切酶、核轉(zhuǎn)錄因子、谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶等，這些酶及核轉(zhuǎn)錄因子均可誘發(fā)細(xì)胞凋亡。其次，骨折所造成的創(chuàng)傷應(yīng)激反應(yīng)是誘發(fā)細(xì)胞凋亡的一個關(guān)鍵因素。這些影響直接或間接導(dǎo)致了一系列的組織和器官的損害。此外，因為骨折后伴隨著髓腔內(nèi)骨髓及脂肪組織的嚴(yán)重?fù)p傷，小脂肪滴可通過破裂的血管進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)從而造成脂肪栓塞。同時，大量失血導(dǎo)致組織器官不能得到有效灌注，可以使組織細(xì)胞產(chǎn)生脂肪酶。脂肪栓子中的脂肪被脂肪酶分解成成甘油和游離脂肪酸等物質(zhì)。有研究表明，游離脂肪酸可產(chǎn)生誘導(dǎo)多種細(xì)胞凋亡的作用［5-7］，包括胰島β細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、卵巢顆粒細(xì)胞［8］和睪丸間質(zhì)細(xì)胞［9］。與骨折同時發(fā)生的還有局部軟組織由于出血、腫脹，受損會釋放出大量酸性代謝產(chǎn)物、血管活性物質(zhì)和組織毒素等物質(zhì)，這些代謝產(chǎn)生的毒性產(chǎn)物會進(jìn)一步造成重要臟器和組織的損傷。

3．2 骨折后腎臟細(xì)胞凋亡調(diào)控基因Bcl-2及Bax表達(dá)的變化 骨折在大多數(shù)時候不會引起腎臟組織直接損傷，骨折后腎臟的損傷主要是在神經(jīng)和體液素因素、創(chuàng)傷應(yīng)激反應(yīng)、局部組織損傷等原因引起的有害物質(zhì)及代謝產(chǎn)物入血后進(jìn)入腎臟等因素的影響下引起，因此它并不表現(xiàn)有顯著局部分布特性。健康成年人在安靜狀態(tài)下，每分鐘流過兩腎的血量約相當(dāng)于心輸出量的1／4左右，而腎臟僅占體重約0．5%，可見腎臟是機(jī)體供血量最豐富的器官，所以當(dāng)骨折伴有大量失血時，腎臟組織缺血失氧的表現(xiàn)會尤為突出。由于血容量減少和血流量速度減緩，一些體內(nèi)的新陳代謝的產(chǎn)物不能被及時排出，這些代謝物可以誘發(fā)細(xì)胞凋亡的發(fā)生［5-7］。骨折創(chuàng)傷后，細(xì)胞凋亡程序會被機(jī)體立即啟動，它保證了機(jī)體的正常代謝功能和維持腎功能得以正常進(jìn)行。

在細(xì)胞凋亡過程中，Bcl-2基因起著至關(guān)重要的抑制細(xì)胞凋亡作用。有研究表明，大鼠大腦在受到創(chuàng)傷后出現(xiàn)Bcl-2的表達(dá)明顯升高，反映出機(jī)體損傷后出現(xiàn)過度凋亡［10］。本實驗結(jié)果表明，腎組織中抑凋亡因子Bcl-2蛋白表達(dá)及mRNA的轉(zhuǎn)錄在骨折后均會出現(xiàn)明顯上調(diào)。Bcl-2mRNA的轉(zhuǎn)錄在肢體骨折后一開始即較正常對照組顯著升高，但在整個過程中呈整體下降的趨勢；而蛋白的表達(dá)在開始呈上升趨勢，在12h后則呈下降趨勢，48h后恢復(fù)到正常水平。這說明在骨折創(chuàng)傷后機(jī)體的抑制細(xì)胞凋亡機(jī)制即已經(jīng)啟動，從實驗過程可以看出抑制作用在骨折后12h最為顯著。由此可以得知，骨折后前12h腎髓質(zhì)淺層細(xì)胞凋亡處于高峰期，12h后隨著機(jī)體調(diào)節(jié)和代償功能的跟進(jìn)，腎髓質(zhì)淺層細(xì)胞凋亡情況逐漸減緩。

Bax是最重要的促凋亡基因之一，廣泛分布于人體組織和細(xì)胞中，而且Bax也是調(diào)節(jié)Bcl-2活性的主要因子［11］。本研究結(jié)果顯示，骨折后Bax蛋白表達(dá)的上調(diào)以12h后最為顯著。腎臟組織中Bax蛋白表達(dá)和mRNA轉(zhuǎn)錄在骨折創(chuàng)傷后的各個時間段中無區(qū)域性差異。表明在骨折后12h內(nèi)機(jī)體主要反應(yīng)是保護(hù)腎臟組織免受損傷，而在12h后，機(jī)體為了清除腎髓質(zhì)淺層骨折損傷后產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，在骨折12h之后，Bax蛋白的表達(dá)呈逐漸升高的趨勢。由此可見，骨折創(chuàng)傷對腎髓質(zhì)淺層Bax表達(dá)有明顯影響。

通過以上Bcl-2和Bax蛋白各自表達(dá)的規(guī)律，說明Bcl-2／Bax比值在骨折后腎皮質(zhì)深層細(xì)胞凋亡的調(diào)控過程中始終處于一個相對的動態(tài)平衡之中，這對于預(yù)防細(xì)胞凋亡和清除受損與衰老細(xì)胞發(fā)揮著主要作用［11］?？傊钦蹖δI髓質(zhì)淺層Bcl-2和Bax的表達(dá)有明顯影響。

3．3 PNS對腎臟髓質(zhì)組織損傷的保護(hù)作用 由于壞死組織及代謝產(chǎn)物等入血滯留于腎臟而導(dǎo)致的腎損傷是骨折對機(jī)體腎臟影響的主要原因，故及時有效地清除在腎臟和血液中蓄積的代謝性產(chǎn)物及有害物質(zhì)對維持機(jī)體和腎臟正常的生理功能具有十分重要的意義。中藥三七的活性成分主要為PNS。相關(guān)研究表明，三七總皂苷具有擴(kuò)張血管，改善血液循環(huán)以及活血化瘀的效果可以有效改善骨折時大量出血引起的腎臟血流量減少及對機(jī)體的創(chuàng)傷刺激。WYLLIE等［12］的研究表明，Bcl-2和Bax的相關(guān)蛋白可形成異源二聚體，Bax之間可形成同源二聚體，異源二聚體抑制凋亡，Bax同源二聚體則促進(jìn)凋亡，因此認(rèn)為Bcl-2與Bax比率可調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡，調(diào)高Bax／Bcl-2促進(jìn)凋亡，降低Bax／Bcl-2則抑制凋亡。在本實驗中，Bax的表達(dá)在骨折后6h內(nèi)可以看到骨折治療組明顯較單純骨折組高，而Bax表達(dá)在6h以后則呈明顯降低趨勢。Bax mRNA轉(zhuǎn)錄的變化趨勢與蛋白表達(dá)基本上相一致，僅有骨折治療組Bax mRNA較長時間地持續(xù)高表達(dá)，在12h內(nèi)的表達(dá)顯著高于單純骨折組。骨折治療組腎臟組織Bcl-2蛋白的表達(dá)在創(chuàng)傷后1h即已顯著升高，并在36h內(nèi)持續(xù)處于較高的水平，直至48h時才逐漸出現(xiàn)降低，但依然較正常水平顯著增高。骨折治療組Bcl-2mRNA的轉(zhuǎn)錄在創(chuàng)傷后的1h亦呈顯著升高，其轉(zhuǎn)錄表達(dá)量隨著時間的推移逐漸下降。由此可以看出，三七總皂苷有將抑凋亡因子Bcl-2的表達(dá)及mRNA轉(zhuǎn)錄顯著上調(diào)的作用，同時起著顯著下調(diào)促凋亡因子Bax的表達(dá)及mRNA轉(zhuǎn)錄的作用。研究結(jié)果進(jìn)一步表明，三七總皂苷對骨折后腎臟組織中抑凋亡因子Bcl-2蛋白的表達(dá)及mRNA轉(zhuǎn)錄在1～6h發(fā)揮下調(diào)作用，而在12～36h發(fā)揮上調(diào)作用，此作用在各時間段均無顯著的組織結(jié)構(gòu)區(qū)域性差別。

如上所述，三七總皂苷通過上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，下調(diào)Bax過度的表達(dá)，有效調(diào)節(jié)Bcl-2／Bax比值，抑制過度凋亡，使腎髓質(zhì)淺層細(xì)胞凋亡處于符合生理需求的狀態(tài)，發(fā)揮保護(hù)腎臟損傷的作用［13］，同時又有利于骨折的愈合。所以，三七總皂苷對腎臟的保護(hù)作用非常明顯，尤其是對骨折后腎臟功能恢復(fù)具有重要意義。

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