ADAM33對人肺成纖維細(xì)胞增殖、周期、凋亡的影響及IL-4對其表達(dá)影響的研究

陶　韜　趙麟豐　王　彥　廖秀清

ADAM33對人肺成纖維細(xì)胞增殖、周期、凋亡的影響及IL-4對其表達(dá)影響的研究

陶韜1趙麟豐1王彥2廖秀清1

解整合素-金屬蛋白酶33(a disintegrin and metalloprotease 33, ADAM33)是一個與哮喘有關(guān)的基因，主要表達(dá)在肺成纖維細(xì)胞和支氣管平滑肌細(xì)胞，在上皮細(xì)胞和T細(xì)胞中無表達(dá)[1]。ADAM33多態(tài)性與哮喘嚴(yán)重程度、易感性、氣道高反應(yīng)性、氣道重塑、肺功能下降等相關(guān)[2-5]。成纖維細(xì)胞是氣道黏膜下的主要結(jié)構(gòu)細(xì)胞之一，氣道長期慢性炎癥可導(dǎo)致其增生，使其產(chǎn)生大量細(xì)胞外基質(zhì)沉積于基底膜，從而導(dǎo)致管腔狹窄，對外界刺激反應(yīng)性增強?，F(xiàn)已證實其可導(dǎo)致哮喘上皮下纖維化形成，并使氣道反應(yīng)性增高，具有促進氣道重塑的作用。白細(xì)胞介素-4(interleukin-4, IL-4)為主要的Th2型細(xì)胞因子，可增強轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor-β1, TGF-β1)的作用，促進上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[6]。IL-4和ADAM33多態(tài)性與哮喘均有關(guān)，但二者之間的關(guān)系卻罕見報道。本實驗用IL-4刺激MRC-5，觀察IL-4對ADAM33表達(dá)的影響，并探討ADAM33對MRC-5增殖、周期和凋亡的影響，旨在為探討以氣道重塑為主疾病的發(fā)病機制提供新的實驗依據(jù)。

材料與方法

一、主要材料

人肺成纖維細(xì)胞MRC-5購自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院，人IL-4購自PeproTech公司，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司，RNAi MAX脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒購自Invitrogen公司，RNA提取試劑盒購自O(shè)mega公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR熒光定量PCR試劑盒購于TaKaRa公司，兔抗ADAM33抗體購自Gene Tex公司，蛋白定量試劑盒購自Pierce公司，蛋白印跡發(fā)光液、PVDF膜購自Millipore公司，Western blotting相關(guān)試劑購自碧云天公司，MTS試劑購自Promega公司，細(xì)胞周期檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自Sigma公司。ADAM33引物、GAPDH引物、ADAM33-siRNA-575、NC-siRNA序列參見我們的前期研究[7]。

二、研究方法

1. 細(xì)胞培養(yǎng): 用含10% FBS的DMED培養(yǎng)基將人肺成纖維細(xì)胞MRC-5培養(yǎng)在37 ℃、含有5% CO2的培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞處于生長對數(shù)期時消化細(xì)胞，稀釋細(xì)胞使細(xì)胞密度為1×105個/ml，2×105個種于6孔板。6 h后分別加入IL-4，使終濃度為1 ng/ml、10 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml，以未刺激組細(xì)胞為對照，48 h后提取RNA和蛋白。重復(fù)實驗3次。

2. 實時熒光定量PCR法檢測ADAM33 mRNA表達(dá)情況

(1) 總RNA提取及cDNA合成：IL-4刺激MRC-5 48 h后提取總RNA，按照試劑盒說明書進行，分光光度計檢測濃度和純度。然后對D(260)/D(280)值在1.8～2.0的RNA進行去除基因組DNA反應(yīng)和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，體系與條件均按說明書進行。將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋10倍，-20 ℃保存。

(2)實時熒光定量PCR：將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA作為模板進行PCR擴增，擴增體系按試劑盒說明書進行。擴增條件：先在95 ℃條件下預(yù)變性10 min，然后95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40循環(huán)，插入溶解曲線。所有標(biāo)本重復(fù)3次。

3. Western Blotting法檢測ADAM33 蛋白表達(dá)情況： IL-4刺激MRC-5 48 h后提取細(xì)胞總蛋白，取提取物50 μg，變性后在8% SDS-PAGE膠上進行電泳，以80 V濃縮膠和100 V分離膠分離細(xì)胞蛋白，切膠，然后在250 mA電流下轉(zhuǎn)膜90 min，封閉2 h，按1︰500的濃度加入兔抗ADAM33，在搖床上4 ℃孵育過夜，洗膜10 min×3 ，與二抗在室溫下反應(yīng)1.5 h，洗膜10 min×3，ECL化學(xué)發(fā)光顯色、曝光。以GAPDH(1︰800稀釋)為對照。凝膠成像儀采集圖像，Quantity One圖像分析軟件進行條帶灰度值分析，目的蛋白的相對表達(dá)量即為目的蛋白灰度值與內(nèi)參灰度值的比值。

4. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染: 以每孔1.5×105的細(xì)胞數(shù)量接種至6孔板，同時以終濃度為50 ng/ml的IL-4刺激MRC-5。24 h后進行瞬時轉(zhuǎn)染，設(shè)干擾組、陰性對照組和空白對照組，按轉(zhuǎn)染試劑盒說明書將ADAM33-siRNA-575和NC-siRNA轉(zhuǎn)染至MRC-5。

5. 實時熒光定量PCR和Western Blotting法檢測抑制率: 轉(zhuǎn)染48 h后提取總RNA和蛋白，實時熒光定量PCR和Western Blotting法檢測抑制率，操作步驟同前。

6. MTS法檢測ADAM33對MRC-5增殖活力的影響: 轉(zhuǎn)染12 h后重懸細(xì)胞，按照2×103個/孔鋪于96孔板，每孔100 μl，每個時間點每組復(fù)空3個，分別于0、24、48、72 h加入10 μl MTS，孵育2 h，酶標(biāo)儀測定各孔490 nm波長處的光密度(A490值)。根據(jù)A490值繪制細(xì)胞生長曲線，細(xì)胞增殖抑制率=(1-干擾組A490/ 陰性對照組A490)×100%。

7. 流式細(xì)胞術(shù)檢測ADAM33對MRC-5周期的影響: 轉(zhuǎn)染48 h后，洗滌細(xì)胞，70%乙醇重懸，4 ℃過夜，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的周期分布。獨立重復(fù)實驗3次。

8. 流式細(xì)胞術(shù)檢測ADAM33對MRC-5凋亡的影響: 轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細(xì)胞，按Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒說明書操作，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡情況。獨立重復(fù)實驗3次。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié)果

一、IL-4對ADAM33 mRNA表達(dá)的影響

用IL-4刺激MRC-5 48 h后，ADAM33 mRNA在0 ng/ml、1 ng/ml、10 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml的相對表達(dá)量分別為(1.010±0.173)、(1.928±0.605)、(5.202±1.673)、(8.398±2.252)、(9.037±1.250)，1 ng/ml組與0 ng/ml組相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；而10 ng/ml組、50 ng/ml、100 ng/ml與0 ng/ml組相比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；表達(dá)量分別約為0 ng/ml組的5.15倍、8.31倍和8.95倍，見圖1。

注：a：P>0.05，與0 ng/ml組相比較；b：P<0.05，

二、IL-4對ADAM33蛋白表達(dá)的影響

Western blotting法測定結(jié)果顯示，ADAM33蛋白在0 ng/ml、1 ng/ml、10 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml的相對表達(dá)量分別為(0.19±0.01)、(0.28±0.06)、(0.50±0.08)、(0.69±0.04)、(0.83±0.03)，1 ng/ml組與0 ng/ml組相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而10 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml分別與0 ng/ml組相比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表達(dá)量分別約為0 ng/ml組的2.63倍、3.63倍和4.37倍，見圖2。

圖2　不同濃度IL-4對人肺成纖維細(xì)胞ADAM33 蛋白

三、ADAM33-siRNA對人肺成纖維細(xì)胞ADAM33的抑制率

轉(zhuǎn)染48 h后，熒光定量PCR法顯示，干擾組表達(dá)量(0.239±0.017)明顯低于陰性對照組(1.026±0.282)和空白對照組(1.002±0.069)，P<0.05，干擾組與陰性對照組相比表達(dá)下調(diào)約76.7%；Western blotting顯示，干擾組ADAM33蛋白的表達(dá)量明顯低于陰性對照組和空白對照組(P<0.05)；空白對照組和陰性對照組在mRNA水平和蛋白水平相比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

注：A:干擾組；B:陰性對照組；C:空白對照組

四、ADAM33對人肺成纖維細(xì)胞增殖的影響

通過MTS法對MRC-5增殖情況進行檢測，干擾組A490值與陰性對照組相比較，在24、48和72 h明顯降低(P<0.05)，細(xì)胞增殖的抑制率分別為27.3%、36.6%、19.2%，見表1，圖4。

表1　ADAM33對人肺成纖維細(xì)胞增殖的影響

注：a：P<0.05，與陰性對照組相比較

圖4　ADAM33對人肺成纖維細(xì)胞增殖的影響

五、ADAM33對人肺成纖維細(xì)胞周期的影響

轉(zhuǎn)染48 h后，干擾組S期占的比例(31.69±4.14)%明顯低于陰性對照組(47.19±0.99)%，干擾組G0/G1期占的比例(50.77±3.41)%明顯高于陰性對照組(34.92±3.84)%，而G2/M期的的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，表明ADAM33-siRNA將細(xì)胞周期阻滯在S期，見表2、圖5。

表2　ADAM33對MRC-5周期的影響

注：a:P<0.05，與陰性對照組相比較；b:P>0.05，與陰性對照組相比較

圖5　ADAM33對人肺成纖維細(xì)胞周期的影響

六、ADAM33對人肺成纖維細(xì)胞凋亡的影響

Annexin V/PI雙染結(jié)果示，與陰性對照組相比，干擾組細(xì)胞的凋亡率明顯升高，分別為：(28.49±8.79)%、(8.43±5.11)%(P<0.05)，見圖6。

圖6　ADAM33對人肺成纖維細(xì)胞凋亡的影響

討論

哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病，以Th2型細(xì)胞免疫反應(yīng)為主，是一種由遺傳和環(huán)境相互作用的復(fù)雜疾病，以氣道高反應(yīng)性和氣道重塑為特點。有多種細(xì)胞(包括成纖維細(xì)胞)和細(xì)胞因子參與哮喘的發(fā)生發(fā)展過程，嚴(yán)重危害人類的健康，但其發(fā)病機制仍不完全清楚。氣道重塑主要表現(xiàn)為支氣管壁增厚，上皮細(xì)胞增生，上皮下基底膜增厚，成纖維細(xì)胞增生，支管平滑肌細(xì)胞肥大和增生，彈性蛋白破壞后細(xì)胞間質(zhì)的重塑和血管增多等一系列的病理變化，其中成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞增生是導(dǎo)致哮喘氣道重構(gòu)的主要病理改變[8-9]。

2002年，Van Eerdewegh等[1]首次發(fā)現(xiàn)ADAM33基因定位在人20p13，推測其可能與哮喘和氣道高反應(yīng)性有關(guān)。ADAM33主要表達(dá)在肺成纖維細(xì)胞和支氣管平滑肌細(xì)胞，但在上皮細(xì)胞和T細(xì)胞中無表達(dá)。最近亦有研究發(fā)現(xiàn)ADAM33蛋白還表達(dá)于氣道上皮細(xì)胞[2]。ADAM33是一個高度多態(tài)性基因，目前大多數(shù)研究也集中于此，但對其機制研究較少。大多數(shù)研究結(jié)果表明ADAM33的多態(tài)性與哮喘嚴(yán)重程度、易感性、氣道高反應(yīng)性、氣道重塑、肺功能下降等相關(guān)[2-5]，但亦有不同的結(jié)果[10]。在不同地區(qū)、不同種族，ADAM33單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)分布也不完全相同[11-12]。Lind 等[13]對美籍波多黎各人和墨西哥人進行研究，均未發(fā)現(xiàn)其多態(tài)性與哮喘嚴(yán)重程度相關(guān)。Raby等[14]發(fā)現(xiàn)17種ADAM33 SNPs與西班牙哮喘兒童相關(guān)，但在白人和非洲裔美國人中沒有一種SNP與哮喘相關(guān)。在對SNP眾多的研究中，沒有有發(fā)現(xiàn)哪一種SNP與所有哮喘患者相關(guān)的報道，故其在哮喘中的作用尚需大量研究來驗證。

IL-4為主要的Th2型細(xì)胞因子，在哮喘患者中呈高表達(dá)，其在慢性氣道炎癥中起重要作用[6,15]。IL-4和ADAM33與哮喘均有關(guān)，但二者之間的關(guān)系卻罕見報道。Jie等[16]以不同濃度的IL-4和/或IL-13刺激MRC-5，發(fā)現(xiàn)IL-4和IL-13均能促進ADAM33表達(dá)，呈濃度依耐性和時間依賴性。本實驗亦發(fā)現(xiàn)IL-4也可引起MRC-5 ADAM33表達(dá)上調(diào)，并呈濃度依賴性。前期研究我們已經(jīng)篩選出抑制率最高的ADAM33-siRNA，本實驗對ADAM33進行干擾后發(fā)現(xiàn)干擾組細(xì)胞增殖率、S期占的比例明顯低于陰性對照組，細(xì)胞凋亡率明顯高于陰性對照組，表明ADAM33-siRNA將MRC-5細(xì)胞周期阻滯在S期，有促增殖、抗凋亡的作用，為進一步研究哮喘氣道重塑的機制打下了基礎(chǔ)。

以上結(jié)果表明，ADAM33很可能參與了氣道重塑，然而，目前還沒有針對氣道重塑的有效治療手段，對ADAM33的研究在這方面或?qū)⒂型〉猛黄?。?xì)胞因子IL-4可促進ADAM33表達(dá)，二者之間的關(guān)系值得進一步研究，未來仍需更多的研究來明確ADAM33在氣道重塑中的作用機制。

參考文獻(xiàn)

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(本文編輯：王亞南)

陶韜，趙麟豐，王彥，等. ADAM33對人肺成纖維細(xì)胞增殖、周期、凋亡的影響及IL-4對其表達(dá)影響的研究[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2015， 8(3)： 303-307.

·論著·

【摘要】目的探討解整合素-金屬蛋白酶33(ADAM33)對人肺成纖維細(xì)胞MRC-5增殖、周期、凋亡的影響，以及白介素-4(IL-4)對其表達(dá)的影響。 方法分別以1 ng/ml、10 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml濃度的IL-4刺激MRC-5，以未刺激組細(xì)胞為對照，實時熒光定量PCR法檢測ADAM33 mRNA的表達(dá)情況，Western blotting法檢測蛋白表達(dá)情況；設(shè)計并合成ADAM33-siRNA，瞬時轉(zhuǎn)染MRC-5，MTS法檢測增殖情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和凋亡。結(jié)果當(dāng)不同濃度的IL-4刺激MRC-5時，ADAM33 mRNA和蛋白的表達(dá)均呈濃度依賴性，1 ng/ml組與0 ng/ml組相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；10 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml與0 ng/ml組相比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；ADAM33-siRNA明顯抑制了ADAM33在MRC-5中的表達(dá)；MTS結(jié)果顯示，在24、48、72 h，干擾組的增殖明顯低于陰性對照組，抑制率分別為27.3%、36.6%、19.2%；干擾組S期占的比例(31.69±4.14)%明顯低于陰性對照組(47.19±0.99)%(P<0.05)；干擾組的細(xì)胞凋亡率(28.49±8.79)%明顯高于陰性對照組(8.43±5.11)%(P<0.05)。結(jié)論ADAM33可促進人肺成纖維細(xì)胞增殖，而細(xì)胞因子IL-4可促進其表達(dá)，它們可能在氣道重塑中起著重要的作用。

【關(guān)鍵詞】ADAM33；支氣管哮喘；氣道重塑；人肺成纖維細(xì)胞

Effect of ADAM33 on human lung fibroblasts′s proliferation, cycle, apoptosis and the effect of IL-4 on its expressionTaoTao1,ZhaoLinfeng1,WangYan2,LiaoXiuqing1.1DepartmentofRespiratoryDiseases,FulingCentralHospital,Fuling408000,China;2InstituteofRespiratoryDiseases,XinqiaoHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,China

Correspondingauthor：LiaoXiuqing,Email: 98116lxq@163.com

【Abstract】ObjectiveTo investigate the proliferation, cycle and apoptosis of a disintegrin and metalloprotease 33 (ADAM33) on human lung fibroblasts (MRC-5) , and the effect of interleukin-4 (IL-4) on its expression. Methods1 ng/ml, 10 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml concentrations of IL-4 stimulated MRC-5, respectively, and the unstimulated cells as the control group. real-time PCR detect the expression of ADAM33 mRNA , Western blotting assay detect its protein expression; designed and synthesized ADAM33-siRNA, transiently transfected into MRC-5, real-time quantitative PCR and Western blotting methods to detect the inhibition rate of siRNA; then,transiently transfected into MRC-5, MTS assay detected proliferation, flow cytometry detected the cycle and apoptosis. ResultsWhen different concentrations of IL-4 stimulated MRC-5, the expression of ADAM33 mRNA and protein showed a concentration-dependent manner , 1 ng/ml group was compared with 0 ng/ml group , the difference was not statistically significant (P>0.05),10 ng/ml, 50 ng/ml and 100 ng/ml were compared with 0 ng/ml group , the difference were statistically significant (P<0.05); MTS results were shown in 24 h, 48 h, 72 h, the proliferation of interference group was significantly lower than the negative control group, the inhibition rates were 27.3%, 36.6%, 19.2%, respectively; The proportion of S phase in interference group was (31.69±4.14)%, which was significantly lower than the negative control group (47.19±0.99)% (P<0.05); and the interference group apoptosis rate(28.49±8.79)% was significantly higher than the negative control group(8.43±5.11)%(P<0.05). ConclusionADAM33 can promote human lung fibroblasts proliferation, and cytokine IL-4 can promote its expression , they may play an important role in airway remodeling.

【Key words】ADAM33;Asthma;Airway remodeling;Human lung fibroblasts

收稿日期：(2014-11-20)

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：中圖法分類號： R562.2+5 A

通訊作者：廖秀清, Email：98116lxq@163.com

基金項目：作者單位： 408000 涪陵，重慶市涪陵中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科1；;400037 重慶，第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院全軍呼吸內(nèi)科研究所2

DOI：10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2015.03.007