聯(lián)合應(yīng)用白介素-4突變體及白介素-5可溶性受體對(duì)哮喘小鼠支氣管肺泡灌洗液及血清中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1、活化素-A水平的影響

孟祥珍　韓月肖　張方琪　李志奎

聯(lián)合應(yīng)用白介素-4突變體及白介素-5可溶性受體對(duì)哮喘小鼠支氣管肺泡灌洗液及血清中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1、活化素-A水平的影響

孟祥珍韓月肖張方琪李志奎

支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘)是由多種細(xì)胞(如嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞等)和細(xì)胞組分共同參與的氣道慢性炎癥性疾病，這種慢性炎癥導(dǎo)致了氣道重塑的病理修復(fù)，并最終導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性和氣流受限[1-2]。

哮喘的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，目前為止還不完全清楚。經(jīng)典理論認(rèn)為輔助性T細(xì)胞1型(Thl)/輔助性T細(xì)胞2型(Th2)的比例失衡，尤其是Th2及其產(chǎn)物(IL-4、IL-5、IL-13)分泌亢進(jìn)是哮喘的主要發(fā)病機(jī)制。IL-4、IL-5在哮喘發(fā)病機(jī)制中扮演著非常重要的角色,本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)IL-4突變體(interleukin-4 mutant, IL-4MT)和IL-5可容性受體(soluble interleukin-5 receptor α, sIL-5Rα)對(duì)小鼠的氣道炎癥有明顯的緩解作用。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1 (transforming growth factor-β1, TGF-β1)、活化素-A (activin-A, Act-A)均是TGF-β超家族的成員，可由多種炎性細(xì)胞和結(jié)構(gòu)性細(xì)胞分泌，比如嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等。研究發(fā)現(xiàn)，Act-A是免疫應(yīng)答方面的重要調(diào)節(jié)因子，并且在哮喘發(fā)病機(jī)理、肺纖維化及氣道重塑的進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[3-10]。TGF-β1作為纖維化和免疫調(diào)節(jié)的重要細(xì)胞因子，在哮喘氣道重塑方面也發(fā)揮著關(guān)鍵作用[11]。本實(shí)驗(yàn)聯(lián)合應(yīng)用IL-4突變體(拮抗IL-4/IL-13)及IL-5可溶性受體α(拮抗IL-5)對(duì)哮喘小鼠進(jìn)行靶向干預(yù)，旨在觀察其對(duì)哮喘小鼠BALF及血清中TGF-β1 、Act-A水平的影響，并探討其作用機(jī)理。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

50只6～8周齡的清潔級(jí)BALB/c雌性小鼠，體質(zhì)量(21±3)g，購(gòu)于第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，無(wú)卵蛋白飼料喂養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境為溫度為(18±4)℃，濕度為57%±10%。

二、試劑和儀器

OVA (美國(guó)Sigma公司)，氫氧化鋁(河南新鄉(xiāng)華蘭生物公司)，生理鹽水， IL-4MT(Q116D,Y119D)及sIL-5Rα(由本課題組與北京義翹神州生物技術(shù)有限公司合作研發(fā)，51 084-M08B，51 154-M08B)，ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，BSA-CW電子天平(德國(guó)賽多利斯集團(tuán))，402型超聲霧化器(上海四菱醫(yī)療器械廠)，低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Backman公司)，全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析儀(美國(guó)Thermo公司)。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1. 動(dòng)物分組：50只實(shí)驗(yàn)小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法按每組10只隨機(jī)分為5個(gè)組，即對(duì)照組、哮喘組、IL-4MT治療組、sIL-5Rα治療組及聯(lián)合治療組。

2．哮喘模型的建立與干預(yù)：各組小鼠(對(duì)照組除外)分別于第0、7、14 天腹腔注射20 μg OVA和20 mg氫氧化鋁凝膠0.9%氯化鈉混合液 200 μl致敏，而對(duì)照組小鼠腹腔注射相同體積的0.9%氯化鈉溶液。第21至27天將各組小鼠(對(duì)照組除外)置于封閉容器中，超聲霧化吸入5% OVA生理鹽水誘發(fā)哮喘，每次30 min，每天一次。其中IL-4MT治療組、sIL-5Rα治療組及聯(lián)合治療組小鼠分別于激發(fā)前30 min腹腔注射IL-4MT 100 μg、sIL-5Rα100 μg及聯(lián)合應(yīng)用IL-4MT、sIL-5Rα各100 μg進(jìn)行干預(yù)，而對(duì)照組和哮喘組小鼠于激發(fā)前30 min給予腹腔注射相同體積生理鹽水，共7 d，對(duì)照組小鼠用生理鹽水進(jìn)行激發(fā)。

3．樣本采集：各組小鼠在末次激發(fā)24 h后眼球取血，于4 ℃靜置30 min后，以離心半徑 8 cm，3 000 r/min離心15 min留取血清，將血清凍存于-20 ℃冰箱中待檢。各組小鼠處死后進(jìn)行氣管插管，0.8 ml生理鹽水灌洗雙肺，停留并按摩肺部片刻后緩慢回收支氣管肺泡灌洗液(bronchial alveolar lavage fluid, BALF)，重復(fù)三次，4 ℃，以離心半徑 8 cm，3 000 r/min離心15 min，收集上清液，置于-20 ℃冰箱中冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

4．細(xì)胞因子的測(cè)定：采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)檢測(cè)各組小鼠BALF及血清中TGF-β1、Act-A水平，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書的步驟進(jìn)行。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié)果

一、 BALF、血清中TGF-β1(活化)的水平

與對(duì)照組相比，哮喘組BALF及血清中TGF-β1(活化)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為10.619；21.380，P值均<0.01)。與哮喘組比較，IL-4MT治療組、sIL-5Rα治療組及聯(lián)合治療組BALF及血清中TGF-β1(活化)水平顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為2.926，5.746，8.375；6.528，4.480，14.745，P值均<0.01)；聯(lián)合治療組與IL-4MT治療組、sIL-5Rα治療組比較，BALF及血清中TGF-β1(活化)水平進(jìn)一步下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為6.387，2.423；10.7000，1.835，P值均<0.05)，提示聯(lián)合治療的效果更好，見(jiàn)表1。

表15組小鼠BALF及血清中TGF-β1(活化)的水平

組 別TGF-β1(BALF)TGF-β1(血清)對(duì)照組76.94±10.73489.74±40.32哮喘組162.51±23.12a1130.21±79.94aIL-4MT治療組135.88±13.54bc934.90±53.41bcsIL-5Rα治療組110.76±16.40bc862.35±49.52bc聯(lián)合治療組95.94±9.86b685.33±50.86b

注：與對(duì)照組比較，aP<0.01；與哮喘組比較，bP<0.01；與聯(lián)合治療組比較，cP<0.05；TGF-β1：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1；BALF：支氣管肺泡灌洗液

二、 BALF、血清中Act-A的水平

與正常組相比，哮喘組BALF及血清中Act-A水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為31.772，27.153，P值均<0.01)。與哮喘組比較，IL-4MT治療組、sIL-5Rα治療組及聯(lián)合治療組BALF及血清中Act-A水平顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為11.425，9.618，17.017；8.044，5.394，18.753，P值均<0.01)；聯(lián)合治療組與IL-4MT治療組、sIL-5Rα治療組比較，BALF及血清中Act-A水平進(jìn)一步下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為4.409，8.185；10.417，12.920，P值均<0.01)，提示聯(lián)合治療的效果更好，見(jiàn)表2。

表25組小鼠BALF及血清中Act-A 水平

組 別Act-A(BALF)Act-A(血清)對(duì)照組272.87±21.98550.17±50.86哮喘組863.98±54.78a1341.43±69.94aIL-4MT治療組597.53±49.97bc1076.50±56.33bcsIL-5Rα治療組656.09±41.95bc1158.21±73.12bc聯(lián)合治療組512.76±36.15b794.56±50.46b

注：與對(duì)照組比較，aP<0.01；與哮喘組比較，bP<0.01；與聯(lián)合治療組比較，cP<0.01；BALF：支氣管肺泡灌洗液；Act-A：活化素-A

討論

哮喘是嚴(yán)重影響人類健康的最常見(jiàn)的慢性疾病之一，兒童和成年人均可發(fā)病。哮喘的發(fā)病率在全球呈逐年上升趨勢(shì)，約有3億人患病[12]。眾所周知，氣道重塑是哮喘疾病的重要特征之一，研究表明氣道重塑是哮喘患者肺功能下降的主要原因之一[13]。機(jī)體受變應(yīng)原刺激后，Th2細(xì)胞因子如IL-4、IL-5、IL-13分泌量增加，多種炎癥細(xì)胞如嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等參與其中，釋放多種炎性介質(zhì)，從而引起氣道的慢性炎癥，最終導(dǎo)致氣道的高反應(yīng)性和和氣道重塑[13]。

TGF-β超家族是一組具有廣泛生物學(xué)作用的蛋白質(zhì)家族，包括細(xì)胞的增殖，組織分化、重塑和形態(tài)形成，細(xì)胞的遷移和凋亡，免疫應(yīng)答等。TGF-β1、Act-A均是TGF-β超家族的成員，可由炎癥細(xì)胞及氣道結(jié)構(gòu)性細(xì)胞分泌，刺激氣道上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及成纖維細(xì)胞的增生，是氣道重塑的重要調(diào)節(jié)因子[14]。

文獻(xiàn)報(bào)道IL-5的過(guò)表達(dá)可誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞、TGF-β1的增多，促進(jìn)氣道重塑[15]。相反，在IL-5缺乏的哮喘小鼠模型中，變應(yīng)原刺激誘發(fā)的過(guò)敏反應(yīng)明顯減弱，BALF和支氣管周圍組織中的嗜酸性粒細(xì)胞量下降，表達(dá)TGF-β1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量減少[16]。而在培養(yǎng)的人支氣管上皮細(xì)胞中IL-4與IL-13均可誘導(dǎo)TGF-β1成劑量依賴型增加。IL-13可誘導(dǎo)TGF-β1的表達(dá)，而IL-13過(guò)表達(dá)引起的氣道重塑主要由TGF-β介導(dǎo)，協(xié)同促進(jìn)氣道重塑[17]。有文獻(xiàn)報(bào)道在哮喘兒童的BALF及血清中TGF-β1的水平較正常人均明顯增高[18]。 同樣，IL-13可以調(diào)節(jié)Act-A的分泌， IL-13基因敲除小鼠Act-A的濃度可明顯降低，從而減輕嚴(yán)重的過(guò)敏性氣道炎癥, 提示IL-13-Act-A 軸可能是哮喘氣道重塑的機(jī)制之一[19]。IL-13基因敲除小鼠可減少IL-4和IL-5的產(chǎn)生，不排除IL-4與IL-5可能會(huì)對(duì)Act-A的分泌產(chǎn)生影響。Act-A同時(shí)也可以誘導(dǎo)TGF-β1的產(chǎn)生，共同促進(jìn)氣道重塑。Act-A的水平在哮喘患者的BALF及血清中較正常人均可明顯增高[19-20]。

本研究結(jié)果表明對(duì)照組小鼠的BALF及血清中存在一定水平的TGF-β1和Act-A，但哮喘組小鼠BALF及血清中的TGF-β1、Act-A水平較對(duì)照組明顯增高。與哮喘組比較，IL-4MT及sIL-5Rα能一定程度地降低哮喘小鼠TGF-β1、Act-A的水平，而聯(lián)合應(yīng)用IL-4MT及sIL-5Rα則降低其水平更加顯著。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)應(yīng)用IL-4突變體和IL-5可溶性受體阻斷IL-4、IL-5及IL-13與其受體的結(jié)合，拮抗IL-4、IL-5及IL-13，降低了TGF-β1、Act-A在BALF及血清中的水平，對(duì)減輕哮喘小鼠的氣道重塑有一定的作用。其作用機(jī)制尚有待今后更深入的研究。

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(本文編輯：黃紅稷)

孟祥珍，韓月肖，張方琪，等. 聯(lián)合應(yīng)用白介素-4突變體及白介素-5可溶性受體對(duì)哮喘小鼠支氣管肺泡灌洗液及血清中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1、活化素-A水平的影響[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2015， 8(3)： 275-278.

·論著·

【摘要】目的探討聯(lián)合應(yīng)用白介素-4突變體(IL-4MT)及白介素-5可溶性受體(sIL-5Rα)對(duì)哮喘小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)及血清轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)、 活化素-A(Act-A)水平的影響。方法50只雌性BALB/c小鼠被隨機(jī)分為對(duì)照組、哮喘組、IL-4MT治療組、sIL-5Rα治療組、聯(lián)合IL-4MT及sIL-5Rα治療組(簡(jiǎn)稱聯(lián)合治療組)；哮喘組和各治療組分別給予卵蛋白(OVA)致敏和激發(fā)。其中，各治療組(IL-4MT治療組、sIL-5Rα治療組、聯(lián)合治療組)分別于激發(fā)前30 min腹腔注射IL-4MT 100 μg、sIL-5Rα 100 μg及IL-4MT、sIL-5Rα各100 μg進(jìn)行干預(yù)，對(duì)照組和哮喘組給予生理鹽水代替；末次激發(fā)后收集小鼠BALF、血清；用ELISA法比較各組(BALF)及血清中TGF-β1、Act-A的水平變化。結(jié)果與對(duì)照組比較，哮喘組小鼠BALF及血清中的TGF-β1、 Act-A水平顯著升高(P<0.01)；與哮喘組比較，各治療組BALF及血清中TGF-β1、 Act-A水平明顯下降(P<0.01)；與單獨(dú)治療組相比，聯(lián)合治療組BALF及血清中的TGF-β1、 Act-A水平下降地更明顯(P<0.05)。結(jié)論聯(lián)合應(yīng)用IL-4MT及sIL-5Rα可明顯降低哮喘小鼠BALF及血清中TGF-β1、Act-A水平，在減輕哮喘小鼠氣道重塑方面可能發(fā)揮了重要作用。

【關(guān)鍵詞】支氣管哮喘；白介素-4突變體；白介素-5可溶性受體α；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1；活化素-A

Effects of interleukin-4 mutant combined with soluble interleukin-5 receptor α on transforming growth factor-β1 and activin-A levels in bronchial alveolar lavage fluid and serum of asthmatic miceMengXiangzhen,HanYuexiao,ZhangFangqi,LiZhikui.DepartmentofRespiratoryandCriticalCareMedicine,XijingHospitaloftheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an710032,China

Correspondingauthor：LiZhikui,Email：lizhikui@fmmu.edu.cn

【Abstract】ObjectiveTo observe the effects of interleukin-4 mutant(IL-4MT) combined with soluble interleukin-5 receptor α(sIL-5 Rα) on transforming growth factor-β1(TGF-β1) and activin-A(Act-A) levels in bronchial alveolar lavage fluid (BALF) and serum of asthmatic mice. MethodsFifty female BALB/c mice were randomly divided into 5 groups: the normal control group, the asthma group, the IL-4MT treatment group, the sIL-5Rα treatment group, the combination of IL-4MT and sIL-5Rα treatment group. Mice in asthma group and treatment groups were sensitized and challenged by OVA. Mice in treatment groups were respectively injected intraperitoneally with IL-4MT 100 μg, sIL-5Rα 100 μg and the combination of IL-4MT 100 μg and sIL-5Rα 100 μg 30 mins before challenged, while mice in normal group and asthma group received equal volume of saline. Then the levels of TGF-β1 and Act-A in BALF and serum were measured by ELISA. ResultsCompared with the normal group, the levels of TGF-β1 and Act-A in both BALF and serum of the asthma group were remarkably higher (P<0.01). Compared with the asthma group, treatment groups can effectively reduce the levels of TGF-β1 and Act-A (P<0.01). Compared with single treatment, the combined treatment group were more effective (P<0.05). ConclusionIL-4MT and sIL-5Rα could reduce TGF-β1 and Act-A levels in BALF and serum of asthmatic mice, which could be a useful therapeutic strategy to alleviate the airway remodeling of asthma.

【Key words】Bronchial asthma;Interleukin-4 mutant;Soluble interleukin-5 receptor α;Transforming growth factor-β1;Activin-A

收稿日期：(2015-01-12)

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：中圖法分類號(hào)： R563 A

通訊作者：李志奎，Email：lizhikui@fmmu.edu.cn

基金項(xiàng)目：作者單位： 710032 西安，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科

DOI：10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2015.03.001