常溫等離子體誘變選育高效耐鎘硫酸鹽還原菌

朱曉麗，張建霞，徐雅雅，姚 倩，李 夢，董立萍

(西北大學(xué) 城市與環(huán)境學(xué)院, 陜西 西安 710127)

?

·環(huán)境科學(xué)·

常溫等離子體誘變選育高效耐鎘硫酸鹽還原菌

朱曉麗，張建霞，徐雅雅，姚 倩，李 夢，董立萍

(西北大學(xué) 城市與環(huán)境學(xué)院, 陜西 西安 710127)

從鎘污染土壤中分離出35株硫酸鹽還原菌(SRB),采用優(yōu)化的硫酸鋇沉淀法測定其硫酸鹽還原活性,篩選出3株在缺氧和有氧條件下硫酸鹽還原活性均較高的菌株,采用常溫等離子體誘變技術(shù)對篩選的菌株進(jìn)行誘變處理,篩選出一株硫酸鹽還原活性高且耐受Cd生長能力強的誘變株WK 2-5-2,該菌株在液體培養(yǎng)基中能夠耐受100mg/L Cd2+生長,菌數(shù)達(dá)到4.12×107CFU/mL,比其原始菌株WK 2-5的數(shù)量增加了約100倍。該菌株在缺氧和有氧條件下的硫酸鹽還原活性分別為99.17%和78.37%,比其相應(yīng)的原始菌株WK 2-5的硫酸鹽還原活性分別增加了1.49%和43.88%。通過測定WK 2-5-2的16S rRNA序列,該菌株與路德維希腸桿菌(Enterobacter ludwigii EN-119)同源性達(dá)到100%,初步鑒定該菌株為路德維希腸桿菌。該菌株具有應(yīng)用于鎘污染土壤或水體修復(fù)的潛力。

硫酸鹽還原菌；鎘污染土壤；等離子體誘變

硫酸鹽還原菌(Sulfate-Reducing Bacteria, 簡稱SRB)是一類形態(tài)各異、營養(yǎng)類型多樣,能夠利用硫酸鹽或者其他氧化態(tài)硫化物作為電子受體來氧化有機物的細(xì)菌或古菌[1]。

SRB能夠?qū)h(huán)境中的SO42-轉(zhuǎn)化為S2-,S2-與金屬離子相互作用生成沉淀,從而達(dá)到固定重金屬的目的[2]。SRB修復(fù)重金屬污染的原理包括[3]:① SRB代謝過程產(chǎn)生的S2-與廢水中的重金屬離子反應(yīng),促進(jìn)形成硫化物重金屬沉淀可用下面的式(1)、式(2)和式(3)表示,其中CH2O代表有機質(zhì),Me2+代表二價金屬陽離子;② SO42-轉(zhuǎn)化為S2-而使被處理廢水的pH提高[4],有利于重金屬離子形成氫氧化物沉淀;③ SRB代謝過程中生成CO2,部分重金屬還可以和CO32-反應(yīng)生成不溶性的碳酸鹽而去除[5]。

SO42-+2CH2O→S2-+2CO2+2H2O，

(1)

S2-+2CO2+2H2O→H2S+2HCO3，

(2)

Me2++H2S→MeS ↓+2H+。

(3)

目前,SRB已被廣泛應(yīng)用于酸性重金屬廢水的治理[6-7],而利用SRB治理土壤重金屬污染的相關(guān)報道甚少。因此,研究SRB用于土壤重金屬污染的修復(fù)具有十分重要的意義。

在所有Cd的化合物中,CdS的溶解度最低,其次是Cd3(PO4)2[8],因此,目前采用形成CdS沉淀修復(fù)Cd污染已逐漸取代了之前采用形成Cd(OH)2或CdCO3修復(fù)Cd污染的方法。但是,自然界野生的硫酸鹽還原菌抗重金屬生長能力較弱。呂琴等的研究表明:重金屬污染對土壤中硫酸鹽還原菌的種群數(shù)量和硫酸鹽還原活性具有明顯的抑制作用,隨著重金屬污染量的增加,抑制作用越強;當(dāng)加入的Cd2+為1.5mg/kg時,不同稻田土壤SRB種群數(shù)量和硫酸鹽還原活性分別下降32%～45%和15%～30%[9]。范文宏等采用從大慶油田采油驅(qū)注水中分離的一株SRB固定土壤中的Cd,土壤中可交換態(tài)Cd和碳酸鹽結(jié)合態(tài)Cd的含高,但當(dāng)土壤中Cd的總量達(dá)到40 mg/kg時,SRB的生長和硫酸鹽還原活性明顯降低[10],另外,由于表層土壤和植物根際土壤氧的濃度較高,而較深層土壤為缺氧環(huán)境,因此,用于土壤修復(fù)的SRB在有氧和缺氧條件下均需具有較高的硫酸鹽還原活性,從而才能夠達(dá)到有效固定土壤Cd污染的目的。由此可見,篩選出在有氧和缺氧條件下均需具有較高的硫酸鹽還原活性且耐高濃度鎘生長的SRB菌株,對其應(yīng)用于鎘污染土壤的修復(fù)具有重要的意義。

本研究擬采用常溫等離子體誘變技術(shù)對分離的SRB進(jìn)行誘變選育,篩選出具有較高抗鎘生長能力的和在缺氧、有氧環(huán)境下具有較高硫酸鹽還原能力的誘變菌株,以期用于鎘污染土壤或水體的修復(fù)治理。

1 實驗材料與方法

1.1 樣品來源

用于分離SRB菌株的土樣采自陜西寶雞某鉛鋅礦尾礦山下,長期受尾礦淋溶水污染的土壤,取樣土層為0～20cm表層土或尾礦山下植物根際土,從尾礦山下采集4份土樣,其編號分別為WK1,WK2,WK3,WK4;尾礦山下綠蒿根際土樣,編號分別為LH1,LH1;尾礦山下白菜根際土樣,編號分別為BC1,BC2;尾礦山下玉米根際土樣,編號分別為YM1,YM2。

1.2 培養(yǎng)基成分及其配制方法

SRB富集培養(yǎng)基組成為:K2HPO40.5 g,(NH4)2SO42.5 g,NaHCO30.5 g,CaCl20.2 g,MgSO41.0 g,酵母膏 1.5 g,乳酸鈉 2.0 mL,蒸餾水1 000 mL。pH 7.0～7.2,121℃滅菌20 min。(NH4)2Fe(SO4)2,L-半胱氨酸鹽分別用無菌蒸餾水配制為10 mg/mL和50 mg/mL,用0.25 μm的無菌過濾器過濾后,臨用前分別以5 mL/100 mL和1 mL/100 mL的比例加入已滅菌的培養(yǎng)基中。

1.3 SRB的分離純化

將所采土樣分別按照2%的比例加入裝有100 mL SRB液體培養(yǎng)基的150mL三角瓶中,用液體石蠟封面,35℃靜置培養(yǎng)2～3d,培養(yǎng)瓶中出現(xiàn)大量黑色沉淀且具有臭雞蛋氣味,即為富集好的SRB菌液。采用稀釋涂布雙皿夾層法分離純化SRB，35℃,培養(yǎng)3～4d。挑選平板上較大的黑色單菌落接入SRB液體富集培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至對數(shù)期,重復(fù)以上的操作,直至固體培養(yǎng)基上長出的為純菌落。

1.4 SRB硫酸鹽還原活性的測定

分別測定SRB在缺氧和有氧條件下的硫酸鹽還原活性。將上述分離得到的SRB分別加入SRB富集液體培養(yǎng)基中,共分為2組,一組用液體石蠟封面,另一組不用液體石蠟封面,靜置于生化培養(yǎng)箱中,35℃,培養(yǎng)7d后,采用優(yōu)化的硫酸鋇比濁法[11]。

1.5 DBD誘變選育高效耐鎘SRB

分別配制不加(NH4)2Fe(SO4)2的SRB富集液體和固體培養(yǎng)基,加入50mg/L和100mg/L的鎘(以氯化鎘的形式加入)。采用DBD誘變處理上述篩選的SRB,選育高效耐鎘SRB[12]。將誘變后的菌株接種于含Cd2+的上述SRB液體培養(yǎng)基中,采用混合平板疊皿法計數(shù)，在缺氧和有氧條件下測定其硫酸鹽還原活性。篩選出在缺氧和有氧條件下硫酸鹽還原活性和耐鎘生長能力最強的菌株。

1.6 SRB的初步鑒定

將上述篩選的菌株接種在SRB富集液體培養(yǎng)基中,35℃靜置培養(yǎng)至對數(shù)期,6 000 r/min離心收集菌體,用Biospin Bacteria Genomic DNA Extraction Kit 試劑盒分離純化基因組DNA,采用16S rRNA序列分析法鑒定其種屬。采用通用引物27FP1(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)和1429R(5′-GGTTACCTTGTTACGACT T-3′)。目標(biāo)條帶送北京三博遠(yuǎn)志公司測序。通過美國國家生物技術(shù)信息中心 NCBI 數(shù)據(jù)庫http://ncbi.nlm.nih.gov/blast進(jìn)行核酸序列的在線比對,采用Mega4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與討論

2.1 硫酸鹽還原菌的分離純化結(jié)果

土壤懸液富集培養(yǎng)24h后,培養(yǎng)瓶中出現(xiàn)大量黑色沉淀且具有臭雞蛋氣味,將富集培養(yǎng)液進(jìn)行涂布疊皿夾層培養(yǎng), 36～48h后培養(yǎng)基上長出大小不同的黑色圓形菌落(如圖1),按照其大小、生長形態(tài)等特征從平皿中分離純化出35株SRB。

2.2 SRB硫酸鹽活性測定

分離的35株SRB在缺氧和好氧條件下硫酸鹽還原活性見表1。

從表1可以看出,在缺氧條件下,除WK 3-6,WK 2-7和LH1-2這3株菌的硫酸鹽還原能力較低外(硫酸鹽還原率<90%),其他32株SRB的硫酸鹽還原率均>90%。在有氧條件下,SRB的硫酸鹽還原活性明顯降低,WK 2-5，SW3-3，WK 3-7的硫酸鹽還原活性較強,其硫酸鹽還原活性均>45%。因此,選擇這3株菌進(jìn)行下一步的誘變處理。

表1 SRB硫酸鹽還原活性Tab.1 Sulfate-reducing activity of SRB

2.3 DBD誘變選育高效耐鎘SRB

WK 2-5 ，SW3-3和WK 3-7經(jīng)DBD誘變處理后,從含Cd2+的固體平板上挑選出9株菌落較大的菌株,其在液體培養(yǎng)基中耐鎘生長能力和硫酸鹽還原活性見表2。從表2可以看出,誘變菌株與其相應(yīng)的原始菌株相比,其抗鎘生長能力增強,僅有個別菌株耐受能力下降。其中,WK 2-5-2在含Cd2+的液體培養(yǎng)基中生長最佳,在含50 mg/L Cd2+和100 mg/L Cd2+的液體培養(yǎng)基中菌數(shù)分別達(dá)到8.1×108CFU/mL和4.2×107CFU/mL,與其相應(yīng)的原始菌株WK 2-5相比,其抗鎘生長能力顯著增強。WK2-5-2在有氧條件下硫酸鹽還原率為78.37%,比原始菌株WK2-5的硫酸鹽還原活性提高了43.88%,且在含較高濃度Cd2+的培養(yǎng)中生長良好。因此,選出WK2-5-2進(jìn)行下一步的鑒定。

表2 誘變和野生菌株鎘耐受及其硫酸鹽還原活性Tab.2 Cd-tolerant ability and sulfate reducing activity of mutants and theirs related wild strains

2.4 菌株的初步鑒定

根據(jù)NCBI的比對結(jié)果,Accession No. JQ308612菌株WK 2-5-2與路德維希腸桿菌 (Enterobacter ludwigii EN-119)同源性達(dá)到99%,因此,確定菌株SW2-1-5為路德維希腸桿菌。菌株WK 2-5-2的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。

圖2 SW2-1-5的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 The phylogenetic tree of SW2-1-5

3 結(jié)果和討論

自然界的野生菌株在生產(chǎn)實踐中往往存在生長緩慢、效率低、不能長期保存等諸多缺陷[13],而且在污染環(huán)境中,野生菌株的生長常受到抑制,不能滿足污染修復(fù)的需要。為此,需要采用多種方法來打破菌種的正常代謝,提高其生長能力和抗性能力等,要達(dá)到此目的,主要措施就是需要進(jìn)行菌種的誘變選育,如進(jìn)行物理和化學(xué)誘變等。但物理誘變和化學(xué)藥劑誘變對人體基本上都有致癌、致突變和致畸等遠(yuǎn)期效應(yīng),因此這些傳統(tǒng)的理化誘變方法在其制備、運輸?shù)葘嶋H應(yīng)用中存在諸多不便。

等離子體誘變技術(shù)是一種設(shè)備簡單、安全無污染的新型物理誘變技術(shù)。Farr[14]等和Marnett[15]認(rèn)為等離子體放電過程中產(chǎn)生的活性物質(zhì),如活性氧分子和羥基自由基,能與DNA分子中的堿基和戊糖發(fā)生反應(yīng)引起DNA分子鏈的斷裂,DNA分子的改變是生物體產(chǎn)生誘變體的前提。

本文采用介質(zhì)阻擋等離子體誘變技術(shù)對篩選的3株SRB進(jìn)行誘變處理,篩選出一株硫酸鹽還原活性高且耐鎘生長能力強的菌株WK 2-5-2與原始菌株相比,其抗鎘生長能力顯著增強,在含50mg/L Cd2+和100mg/L Cd2+的液體培養(yǎng)基中菌數(shù)比其他野生菌株分別增加了100～1 000倍。此外,WK2-5-2在有氧和缺氧條件下硫酸鹽還原率達(dá)到78.37%和99.17%,比原始菌株WK2-5的硫酸鹽還原活性分別提高了43.88%和1.49%。因此，WK2-5-2具有應(yīng)用于鎘污染土壤或水體修復(fù)的潛力。誘變菌株硫酸鹽還原性能的提高,其原因可能是誘變改變了與APS還原酶和亞硫酸鹽還原酶相關(guān)的某些基因,促進(jìn)APS還原酶和亞硫酸鹽還原酶活性提高,使其更容易還原硫酸鹽,也有可能是由于等離子體誘變對硫酸鹽還原菌的細(xì)胞膜產(chǎn)生了一定的破壞作用,使得細(xì)胞膜的通透性有所增加,更易從外界環(huán)境吸收營養(yǎng)物質(zhì),進(jìn)而提高了APS還原酶和亞硫酸鹽還原酶活性,但其抗Cd生長能力和硫酸鹽還原活性增強的確切原因尚需進(jìn)一步研究。

致謝：本研究得到了陜西省教育廳(編號:08JK453)陜西省榆林市省市聯(lián)合資助項目,榆林市科技局產(chǎn)學(xué)研項目,國家大學(xué)生創(chuàng)新實驗計劃項目(編號:201210697005,201310697025)資助。在此一并表示感謝。

[1] 潘嘉川, 邵宗澤, 曹宏斌, 等. 硫酸鹽還原菌的分離純化方法[J].微生物學(xué)雜志, 2007, 2(5): 79-83.

[2] SHEORAN A S, SHEORAN V, CHOUDHARY R P. Bioremediation of acid-rock drainage by sulphate-reducing prokaryotes: A review[J].Minerals Engineering, 2010, 23: 1073-1100.

[3] MCMOHAN M J L, DAUGULIS A J. Enhancement of biogenic sulphides production in a packed-bed bioreactor via critical inoculum design and carrier material selection[J].Biotechnology and Bioengineering, 2008,100 (5), 855-863.

[4] 陳野. 硫酸鹽還原菌腐蝕的影響因素及其防治方法[D].山東：大連理工大學(xué)，2004.

[5] DRURY W J. Treatment of acid mine drainage with anaerobic solid substrate reactors[J].Water Environment Research, 1999, 71: 1244-1250.

[6] ALVAREZ M T, CRESPO C, MATTIASSON B. Precipitation of Zn(II), Cu(II) and Pb(II) at bench-scale using biogenic hydrogen sulfide from the utilization of volatile fatty acids[J].Chemosphere,2007,66:1677-1683.

[7] GALLEGOS-GARCIA M, CELIS L B, RANGEL-MéNDEZ R. Precipitation and recovery of metal sulfides from metal containing acidic wastewater in a sulfidogenic down-flow fluidized bed reactor[J].Biotechnol. Bioeng., 2009,102:91-99.

[8] BAI H J, ZHANG Z M, YANG G E, et al. Bioremediation of cadmium by growing Rhodobacter sphaeroides:Kinetic characteristic and mechanism studies[J].Bioresource Technology, 2008, 99:7716-7722.

[9] 呂琴,陳中云,閔航. 重金屬污染對水稻田土壤硫酸鹽還原菌種群數(shù)量及其活性的影響[J].植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報, 2005,11(3):399-405.

[10] 范文宏, 姜維, 王寧. 硫酸鹽還原菌修復(fù)污染土壤過程中鎘的地球化學(xué)形態(tài)分布變化[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報,2008, 28(11): 2291-2298.

[11] kOLMERT A, WIKSTROM P, HALLBERG K B. A fast and simple turbidimetric method for the determination of sulfate in sulfate-reducing bacteria culture[J].Journal of Microbiological Methods, 2000, 41 (3): 179-184.

[12] ZHU X L, DONG L P, LIU J Q, et al. Screening and mutation induction by DBD Plasma of Potassium-solubilizing bacteria[J].Advanced Materials Research, 2014 (884-885):516-521.

[13] 李榮杰. 微生物誘變育種方法研究進(jìn)展[J].河北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009, 13(10):73-76,78.

[14] FARR S B, KOGOMA T. Oxidative stress responses in Escherichia coli and Salmonella typhimurium[J].Microbiology and Molecular Biology Reviews, 1991, 55:561-585.

[15] MARNETT L J. Oxyradicals and DNA damage[J].Carcinogenesis, 2000, 21:361-370.

(編 輯徐象平)

Screening of sulfur efficient and Cd-tolerant sulfate reducing bacteria by DBD Plasma mutation

ZHU Xiao-li, ZHANG Jian-xia, XU Ya-ya, YAO Qian, LI Meng， DONG Li-Ping

(College of Urban and Environmental Sciences， Northwest University， Xi′an 710127， China)

From Cd-contaminated soil, 35 Sulfate reducing bacteria were separated and purified. The Sulfate reducing activity of these strains were determined using a modified barium Sulfate precipitation method. Three strains were selected by their high Sulfate reducing activities under anaerobic and aerobic environment. The three strains were treated with Dielectric barrier discharge (DBD) plasma mutation. A strain named WK 2-5-2 with high Sulfate reducing activity and ability of Cd-tolerance was selected. WK 2-5-2 could grow well and its number reached up to 4.12×107CFU/ml in liquid medium containing 100mg/l Cd2+.The sulfate reducing activity of WK 2-5-2 was 99.17% and 78.37% under anaerobic and aerobic environment respectively and was increased by 1.49% and 43.88% than its original strain WK 2-5.Then 16S rRNA sequence of the strain was detected and identified asEnterobacterLudwigiiby its 100% sequence homology withEnterobacterLudwigiiEN-119. WK 2-5-2 could be used in bioremediation of Cd-contaminated soil or wastewater.

Sulfate reducing bacteria; Cadmium contaminated soil; dielectric barrier discharge (DBD) plasma mutation

2014-04-11

國家自然科學(xué)基金資助項目(31200083)；陜西省科技計劃基金資助項目(2011JY015)；國家科技部惠民基金資助項目(2012GS610203)

朱曉麗，女，陜西西安人，西北大學(xué)副教授，從事土壤修復(fù)領(lǐng)域的研究。

S151.9+4

：ADOI：10.16152/j.cnki.xdxbzr.2015-02-024