麥麩中四種蛋白的Osborne法提取分離及性能研究

孫 媛,蔡 迪,向 琴,嚴(yán)汪汪,鐘振聲

(華南理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院,廣東廣州 510640)

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麥麩中四種蛋白的Osborne法提取分離及性能研究

孫 媛1,蔡 迪2,向 琴2,嚴(yán)汪汪2,鐘振聲*

(華南理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院,廣東廣州 510640)

麥麩蛋白是植物蛋白的一種,通過研究麥麩蛋白的組成及性質(zhì)以應(yīng)用于食品工業(yè)。用Osborne法分離提取出清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白4種蛋白,考馬斯亮藍(lán)法測定等電點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)表明:清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白的相對含量分別是48.06%、25.12%、18.70%,8.12%；等電點(diǎn)依次為4.0、5.0、5.8、5.2。電鏡表觀發(fā)現(xiàn),清蛋白和球蛋白分子均連接緊密,清蛋白表面細(xì)致多層,局部有孔；球蛋白表面疏松,表面孔較少。醇溶蛋白和谷蛋白分子連接松散,醇溶蛋白呈不規(guī)則的球狀,谷蛋白表面平滑,分子團(tuán)多。功能性質(zhì)測定結(jié)果表明:四種蛋白中球蛋白的持水性和持油性最大,分別為5.00g/g和2.40g/g；醇溶蛋白的起泡性、起泡穩(wěn)定性和乳化力最強(qiáng),分別為376%、71%和75%。因此,球蛋白適宜作為添加劑應(yīng)用在肉制品中,醇溶蛋白適宜作為添加劑應(yīng)用在奶制品和蛋糕等食品配方中。

麥麩蛋白,等電點(diǎn),功能性質(zhì)

小麥麩皮是小麥加工過程中的副產(chǎn)物,我國每年小麥加工過程中麥麩產(chǎn)生量超過2000萬t,但其中85%以上都被直接作為輔料用于釀造和飼料行業(yè),經(jīng)濟(jì)價(jià)值不高[1]。經(jīng)研究,麩皮中含有較豐富的蛋白質(zhì)、碳水化合物、膳食纖維等功能成分[2-4],若能夠全部被充分利用,將具有很高的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。

目前對植物蛋白的提取研究主要是堿法、酶法、超聲輔助法和Osborne法等。管驍[5]等人用堿溶酸沉法制備燕麥濃縮蛋白,蛋白提取率達(dá)46.73%,純度為74.36%；陳鳳蓮[6]等人對比木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶和堿法分離麥麩中的蛋白質(zhì),得出堿性蛋白酶最優(yōu)的結(jié)論；金梅[7]等人利用α-淀粉酶和超聲波結(jié)合的方法,通過響應(yīng)面法優(yōu)化提取條件從小麥麩皮中分離制備蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)得率為71.37%；R.S.F. DASILVA[8]等人嘗試先用糖酶去除細(xì)胞壁,然后堿溶以得到更多蛋白質(zhì),最后提取率為38.5%。張敏[9]等人和馮明珠[10]等人分別用Osborne法探究米糠和燕麥麩中四種蛋白的提取和功能性質(zhì)。

小麥麩皮中蛋白質(zhì)含量在20%左右(干基計(jì)),其中含有清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白。本文采用Osborne法逐級分離出麥麩中四種蛋白,分別對其理化性質(zhì)和功能性質(zhì)進(jìn)行探究,為麥麩蛋白的精細(xì)高值利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小麥麩皮 廣州華匯公司；考馬斯亮藍(lán)R-250 上海伯奧生物科技有限公司；Tris 北京鼎國生物技術(shù)有限公司；其他試劑 均為分析純。

Scientz-10N 冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技公司；島津UV-2450紫外可見分光光度計(jì) 杭州瑞析科技有限公司；JEOL 6300F掃描電子顯微鏡 日本日立公司；FJ300-SH數(shù)顯高速分散均質(zhì)機(jī) 上海標(biāo)本模具廠；KDN-103F自動定氮儀 上海纖檢儀器公司；TG16-WS臺式高速離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器公司；T.G.L-16gR型高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 麥麩蛋白的分離操作 將麥麩在45℃低溫下烘干至恒重,粉碎后過40目篩,取篩下物作為實(shí)驗(yàn)樣品。按照如下Osborne流程[9]依次提取麥麩中的清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白。

圖1 Osborne法提取麥麩中四種蛋白工藝流程圖Fig.1 Extraction of four proteins from wheat bran by Osborne

1.2.2 提取蛋白前后麥麩全成分分析方法 蛋白質(zhì)含量測定,凱氏定氮法(GB/T5009.5-2010)[11]；碳水化合物測定,酶解滴定法(GB/T5009.9-2003)[12]；脂肪測定,索氏抽提法(GB/T5009.6-2003)[13]；膳食纖維測定,酶-重量法(AACC-32-07)[14]；灰分測定,灼燒法(GB/T5009.4-2010)[15]；水分測定[16],直接干燥法(GB/T5009.3-2010)。

蛋白提取率(%)=原料蛋白含量-去蛋白后蛋白含量/原料蛋白含量×100

1.2.3 四種分離蛋白理化性質(zhì)測定

1.2.3.1 等電點(diǎn)測定 通常測定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的方法有雙縮脲法、福林酚法、考馬斯亮藍(lán)(G-250)法和BCA法。其中考馬斯亮藍(lán)法[17]測定時(shí)間最短,靈敏度高,重現(xiàn)性好,線性關(guān)系好,因此本文選用此方法進(jìn)行蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測定[18]。

取9份10mL蛋白溶液并編號,依次調(diào)節(jié)pH到3～11,8000r/min離心15min,取上清液,分別測定其在595nm處的吸光度大小[17]。根據(jù)蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)處溶解度最小的原理,吸光度最小的pH即為蛋白粗略等電點(diǎn)。然后以粗等電點(diǎn)為中心,0.2為單位向前后擴(kuò)散再取4個(gè)點(diǎn),按照同樣的方法測定吸光度,最終測得吸光度最小的pH即為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。

A=kC+b

其中:A為吸光度；C為蛋白溶液濃度,g/L；k,b為常數(shù)。

1.2.3.2 表觀形態(tài)觀察 樣品過100目篩,取篩下物用雙面膠黏在樣品座上。把樣品座置于離子濺射儀中,在樣品表面蒸鍍1層10～20nm厚的鉑金膜后,在不同放大倍數(shù)下進(jìn)行電鏡觀察并拍攝照片。

1.2.4 四種分離蛋白功能性質(zhì)測定

1.2.4.1 吸水性 取0.25g樣品與25mL蒸餾水于離心管混勻,50℃水浴中攪拌20min使充分溶解,4000r/min下離心15min,棄去上清液后稱沉淀質(zhì)量[19]。按下式計(jì)算:

1.2.4.2 持油性 取0.25g樣品與25mL花生油于離心管混勻,50℃水浴中攪拌20min使充分溶解,4000r/min下離心15min,棄去上清液后稱沉淀質(zhì)量。按下式計(jì)算:

1.2.4.3 起泡性及起泡穩(wěn)定性 配制蛋白含量約為1%的蛋白溶液:取蛋白樣品0.50g,溶于50mL 0.05mol/L(pH8.0)的Tris-HCL溶液。調(diào)溶液pH7,在10000r/min下均質(zhì)2min,置于250mL量筒中,分別在0min和10min時(shí)讀數(shù),根據(jù)產(chǎn)生的起泡頂端與液面的距離即可讀出泡沫的體積,mL。

1.2.4.4 乳化性及乳化穩(wěn)定性 乳化力:取1.2.4.3配制的蛋白溶液,調(diào)溶液pH7,按體積比4∶1加入花生油12.5mL,10000r/min下均質(zhì)1min,靜置1min后取乳化層10mL到離心管,3000r/min離心30min讀體積,mL。乳化穩(wěn)定性:將以上離心管在80℃水浴加熱30min再讀數(shù),mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 Osborne分離法的選用

表1 提取蛋白前后麥麩的成分變化(%,干基計(jì))Table1 Changes of composition before and after protein extraction(%,dry basis)

注:*各個(gè)項(xiàng)目是分別測定的,分別帶入誤差,所以合計(jì)含量出現(xiàn)±5%的總誤差尚可接受。

表2 100g麥麩中分離的四種麥麩蛋白質(zhì)量、純度及分布Table2 Distribution of quality and purity of four proteins in 100g wheat bran

Osborne分離法的原理是根據(jù)各種蛋白質(zhì)在不同溶劑中溶解度不同的性質(zhì),利用最簡單的溶液/沉淀分離手段將可溶性蛋白與不溶性蛋白進(jìn)行分離。盡管該方法發(fā)明已經(jīng)有100多年歷史,尚有改進(jìn)的余地,而且蛋白質(zhì)的總回收率也不高,但是可以將清蛋白(Albumin)、球蛋白(Globulin)、醇溶蛋白(Prolamin)和谷蛋白(G1utelin)四種組分逐一分離開來。本文主要目標(biāo)是研究麥麩中四種蛋白的功能特性,暫時(shí)不考慮蛋白質(zhì)的提取率問題,所以選擇采用最經(jīng)典的Osborne分離法得到四種麥麩分離蛋白樣品,沒有對Osborne分離法進(jìn)行改進(jìn)。

2.2 提取蛋白前后麥麩的成分變化

由表1可知,提取蛋白后碳水化合物和纖維含量相對提高,油脂和灰分百分比下降。蛋白提取率為21.64%。提取率較低是因?yàn)楸疚姆蛛x得到的蛋白只取在等電點(diǎn)下析出的沉淀蛋白,在等電點(diǎn)下仍有一部分蛋白質(zhì)溶解在溶液中沒有被回收。

2.3 四種麥麩蛋白含量分析

由表2可以看出,從麥麩中分離得到的清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白質(zhì)量依次減小,以谷蛋白為參照,清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白的含量分別是6倍、3倍和2.3倍。造成上述差別的原因除了各種蛋白含量不一致外,Osborne分離法的操作具有局限性。清蛋白和球蛋白屬于可溶性蛋白,在水或在稀鹽溶液中溶解比較完全,界面清晰,與其他固體雜質(zhì)分離比較干凈,收率較高,得到的蛋白純度分別達(dá)到67.73%和73.95%；而醇溶蛋白和谷蛋白屬于不溶性蛋白,即使在稀酸或稀堿溶液中也不能完全溶解,與其他固體組分分離不徹底,在等電點(diǎn)沉淀后離心得到的產(chǎn)物呈流動狀,冷凍干燥后仍不結(jié)實(shí),所以收率低,得到的蛋白純度也分別只有30.58%和57.58%。通過實(shí)驗(yàn)可以初步認(rèn)為麥麩蛋白以水溶性蛋白為主,麥麩資源開發(fā)應(yīng)該充分考慮水溶性蛋白的特性和利用領(lǐng)域。

2.4 各分離蛋白的理化性質(zhì)

2.4.1 等電點(diǎn)曲線 由于蛋白質(zhì)表面離子化側(cè)鏈的存在,蛋白質(zhì)帶凈電荷。由于這些側(cè)鏈都是可以滴定的,對于每個(gè)蛋白都存在一個(gè)pH使它的表面凈電荷為零即等電點(diǎn)。

如圖2所示,清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白在pH 4.0,5.0,5.8和5.2處吸光度最小,因此可以推斷它們的等電點(diǎn)依次為4.0,5.0,5.8和5.2。實(shí)驗(yàn)以牛血清蛋白為參比,因四種蛋白提取液中蛋白質(zhì)濃度不同,為簡化操作,等電點(diǎn)的測定相對獨(dú)立,同時(shí)為保證每種蛋白質(zhì)溶液的濃度在標(biāo)準(zhǔn)蛋白的濃度范圍里,4種蛋白質(zhì)的離心上清液取樣量不同,即圖2中四條曲線的吸光度大小與真實(shí)含量無關(guān),相互之間不具可比性。

圖2 四種麥麩蛋白的等電點(diǎn)曲線Fig.2 Four wheat bran proteins’isoelectric point curve

2.4.2 表觀結(jié)構(gòu)形態(tài) 四種蛋白的掃描電鏡圖如圖3，由圖可以看出,清蛋白和球蛋白分子均連接緊密,清蛋白表面細(xì)致多層,呈山脊?fàn)?局部有孔,這會影響到其吸附性；球蛋白表面疏松,局部隆起,表面孔較少。和清蛋白和球蛋白不同,醇溶蛋白和谷蛋白分子連接松散,這可能造成它們和另兩種蛋白可溶性與不可溶性區(qū)別的原因。醇溶蛋白呈不規(guī)則的球狀,局部較為細(xì)致,連接成較大的分子基團(tuán),谷蛋白表面平滑,分子團(tuán)多。蛋白質(zhì)的表面形態(tài)主要影響其功能性質(zhì)如持水持油性,乳化性質(zhì)等,研究蛋白的表面形態(tài)可以對其性質(zhì)做出一定的解釋和依此提出一些可行的利用方案。

圖3 四種蛋白的掃描電鏡圖Fig.3 Scanning electron micrographs of the four proteins

2.5 四種分離蛋白功能性質(zhì)評價(jià)

2.5.1 吸水性 蛋白質(zhì)的吸水性是用來衡量蛋白質(zhì)吸附水的能力大小的指標(biāo)。以大豆分離蛋白(SPI)為對照,由圖4可知,球蛋白的吸水性最強(qiáng),是5.00g/g；清蛋白與大豆分離蛋白的吸水性相近,分別為3.99g/g和3.77g/g；醇溶蛋白和谷蛋白吸水性較小,分別為1.90g/g和1.74g/g。在食品加工業(yè)中來說,蛋白質(zhì)的吸水性大小非常重要,吸水性好的蛋白質(zhì)應(yīng)用廣泛,添加到食品中可以使口感更細(xì)膩。

圖4 四種蛋白的吸水性Fig.4 Absorbent of the four proteins

圖5 四種蛋白的持油性Fig.5 Oil retention of the four proteins

2.5.2 持油性 持油性是指蛋白質(zhì)保持油的能力,蛋白質(zhì)持油性在肉制品、奶制品等食品配方和加工中起著很重要的作用。與持水性一樣,以大豆分離蛋白為對照,由圖5可知,大豆分離蛋白(SPI)的持油性比麥麩蛋白好,為3.08g/g；麥麩四種蛋白中,球蛋白的持油性最好(2.40g/g),清蛋白次之(2.09g/g),谷蛋白與清蛋白的持油性相差不大(1.93g/g),最小的是醇溶蛋白(0.942g/g)。球蛋白、清蛋白和谷蛋白的持油性高,可以作為持油替代品應(yīng)用于食品生產(chǎn)。

2.5.3 起泡性 由圖6可知,醇溶蛋白的起泡性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高過其他蛋白,達(dá)到376%,是清蛋白的1.9倍,球蛋白的3.1倍,谷蛋白的3.5倍,是原料的3.8倍,是參照物蛋清的8.2倍。醇溶蛋白的起泡穩(wěn)定性高達(dá)71%,超過蛋清的穩(wěn)定性52%。綜合可知,醇溶蛋白的起泡性和起泡穩(wěn)定性都是最好的,比參照物蛋清要高出很多,因此醇溶蛋白可以作為一種起泡劑。

圖6 不同蛋白的起泡及起泡穩(wěn)定性Fig.6 Foaming and stability of different proteins

2.5.4 乳化性及乳化穩(wěn)定性 圖7表明,醇溶蛋白的乳化性最好,其次是谷蛋白,原料麥麩的乳化性也有53.5%,高于參照物蛋清的乳化力26%。清蛋白的乳化穩(wěn)定性最好,其次是谷蛋白,醇溶蛋白和球蛋白的乳化穩(wěn)定性相同,略低于蛋清。綜合可知,醇溶蛋白和谷蛋白是比較好的兩種乳化劑。

圖7 四種蛋白的乳化及乳化穩(wěn)定性Fig.7 Emulsification and stability of four proteins

3 結(jié)論

3.1 麥麩清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白的等電點(diǎn)依次為4.0,5.0,5.8,5.2。在回收蛋白總量中,以上四種蛋白的相對比例分別是48.06%、25.12%、18.70%,8.12%。對比燕麥麩、米糠等,不同谷物之間同類蛋白的等電點(diǎn)也略有差異,這與其氨基酸組成及結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。Osborne分離法的麥麩蛋白提取率僅為21.64%,其他谷物提取率也在20%～30%,采用Osborne法分離回收麥麩蛋白不是一種好的選擇,但是這種方法為分步提取谷物蛋白提供了研究價(jià)值[10,19-20]。

3.2 清蛋白和球蛋白分子均連接緊密,清蛋白表面細(xì)致多層,呈山脊?fàn)?局部有孔；球蛋白表面疏松,局部隆起,表面孔較少；醇溶蛋白和谷蛋白分子連接松散,呈不規(guī)則的球狀,這可能造成它們和另兩種蛋白可溶性與不可溶性區(qū)別的原因。四種蛋白性能各異,球蛋白的持水性和持油性最大,分別為5.00g/g和2.40g/g,適宜作為添加劑應(yīng)用在肉制品中；醇溶蛋白的起泡性、起泡穩(wěn)定性和乳化力最強(qiáng),分別為376%、71%和75%,適宜作為添加劑應(yīng)用在奶制品和蛋糕等食品配方中。

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Extraction and characterization of four proteins from wheat bran by Osborne

SUN Yuan1，CAI Di2，XIANG Qin2，YAN Wang-wang2，ZHONG Zhen-sheng*

(Chemistry and Chemical Engineering,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China)

Wheat gluten is a kind of plant protein,studying the composition and properties of wheat gluten so as to be applied to the food industry. Four proteins including albumin,globulin,prolamin and glutenin were extracted from wheat bran by the Osborne method,with Coomassie brilliant blue measuring isoelectric points. Experimental results showed the relative contents of albumin,globulin,prolamin and glutenin were 48.06%,25.12%,18.70%,8.12%,and the isoelectric points were 4.0,5.0,5.8,5.2,respectively. The electron microscopy showed both albumin and globulin molecules were closely connected. Albumin surface meticulous and multilayer,with holes locally. Globulin surface loose and less holes. Prolamin and glutenin molecules were loosely connected. Prolamin appeared irregular globular,while glutenin surface smooth with many molecules. Functional properties showed globulin possessed both the highest waterbinding capacity(5.00g/g)and the best holding oil capacity(2.40g/g),while prolamin held the strongest foaming capacity(376%)and stability(71%),and the highest emulsibility(75%). Therefore,globulin was suiTableas additives in meat products,and Prolamin was suiTableas additives in dairy and cake recipe.

wheat bran proteins;isoelectric point;functional properties

2014-06-16

孫媛(1990-)，女，碩士，主要從事精細(xì)化學(xué)品的提取和表征方面的研究。

*通訊作者:鐘振聲(1955-)，男，學(xué)士，教授，主要從事有機(jī)精細(xì)化學(xué)品的合成、提取和分析表征方面的教學(xué)、研究和技術(shù)開發(fā)工作。

TS201.2

A

:1002-0306(2015)09-0136-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.021