竹葉黃酮的酶促酰化、分離與結(jié)構(gòu)鑒定

孫元奎,馬 祥,劉 柳,逯與運(yùn),晏日安

(暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系,廣東廣州 510632)

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竹葉黃酮的酶促?；⒎蛛x與結(jié)構(gòu)鑒定

孫元奎,馬 祥,劉 柳,逯與運(yùn),晏日安*

(暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系,廣東廣州 510632)

研究了固定化脂肪酶B(Novozmy 435)在低水分含量的叔戊醇溶劑中催化竹葉黃酮與硬脂酸的?；磻?yīng)。反應(yīng)條件:竹葉黃酮與硬脂酸酸摩爾比1∶5,脂肪酶用量50g/L,機(jī)械攪拌轉(zhuǎn)速200r/min,反應(yīng)溫度50℃,反應(yīng)時間72h。后經(jīng)液液萃取,薄層層析(TLC,UV 254nm),硅膠柱層析分離純化,薄層層析展開劑配比為氯仿/甲醇/冰乙酸(7∶1∶0.05,v/v/v),柱層析洗脫劑配比為氯仿/甲醇/冰乙酸(10∶1∶0.05,v/v/v)；洗脫液合并相同組分,得到兩種黃酮苷?；飭误w。對純化后的組分采用紅外光譜(IR)、質(zhì)譜(ESI-MS)、核磁共振(1H-NMR、13C-NMR)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和表征,確定產(chǎn)物分別為異牡荊苷-6″-硬脂酸酯和異葒草苷-6″-硬脂酸酯,說明反應(yīng)表現(xiàn)出高度選擇性。

固定化脂肪酶B,竹葉黃酮,酰化,薄層層析,硅膠柱層析

竹葉黃酮是我國近年來研究和開發(fā)的一種新型植物黃酮制劑,具有中國本土資源特色和自主知識產(chǎn)權(quán)。竹葉黃酮主要是4種碳苷黃酮:葒草苷、異葒草苷、牡荊苷、異牡荊苷[1]。近年的研究表明,竹葉黃酮具有較好的抗自由基、抗氧化、抗突變和保護(hù)心腦血管等多種醫(yī)療功效[2-4]。因此,目前對竹葉黃酮類物質(zhì)的制備與功能作用的研究已成為一個熱點。

天然黃酮類化合物一般以游離態(tài)或糖苷的形式存在,脂溶性較差,限制了其在食品中的應(yīng)用[5-6]。?；屈S酮苷中糖基或其母核上的羥基官能團(tuán)與脂肪酸的酯化過程,分為生物酶法和化學(xué)法兩種[7]。黃酮類化合物經(jīng)過?；揎椇?其親脂性明顯提高,并且可以改善它們的生物利用度。與化學(xué)?；啾?酶促酰化穩(wěn)定性好,選擇性專一,反應(yīng)條件溫和,更符合綠色化學(xué)的要求。目前,?；饕褂玫纳锩甘枪潭ɑ久窧[8-9],并且脂肪酶B對黃酮苷糖基上的6″-羥基表現(xiàn)出高度的選擇性[10-11]。本文以硬脂酸為?；w對竹葉黃酮進(jìn)行?；揎?應(yīng)用薄層層析、硅膠柱層析分離純化后得到兩種?；a(chǎn)物,采用高效液相色譜分析兩?；a(chǎn)物得到較好分離,采用IR、ESI-MS、1H-NMR、13C-NMR等方法對其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定,確定兩種?；a(chǎn)物為異牡荊苷-6″-硬脂酸酯和異葒草苷-6″-硬脂酸酯,是兩種新合成化合物。同時測定并比較了兩種?；a(chǎn)物的正辛醇/水體系分配系數(shù),結(jié)果表明兩種產(chǎn)物親脂性明顯提高。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮竹葉抗氧化物(竹葉黃酮總含量約為40%) 深圳金色盆地生物科技有限公司；異葒草苷、葒草苷、異牡荊苷、牡荊苷對照品 法國Extrasynthese公司；435脂肪酶(固定化南極假絲酵母脂肪酶) 諾維信(中國)投資有限公司；硬脂酸 上海晶純實業(yè)有限公司；4A分子篩 天津福晨化學(xué)試劑廠；柱層析硅膠(200～300目)、薄層層析板 青島海洋化工廠；乙酸乙酯、乙腈、正己烷 天津市富宇精細(xì)化工有限公司；氘代二甲基亞砜(DMSO) 美國劍橋同位素公司。

RE-52AAB型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海嘉鵬科技有限公司；SHZ-DIII型循環(huán)水式真空泵 鞏義寧于華儀器有限責(zé)任公司；DZF-6030A型真空干燥箱 上海一恒科學(xué)技術(shù)有限公司；Essentia LGE-UV高效液相色譜儀 日本島津公司；EQUINOX-55型紅外光譜儀 布魯克光譜儀器公司；4000Q Trap質(zhì)譜儀 AB SCIEX公司；AVANCEIII型核磁共振波譜儀(500MHz) 瑞士布魯克公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 竹葉黃酮HPLC分析 精密稱取干燥至恒重的異葒草苷、葒草苷、異牡荊苷、牡荊苷標(biāo)品適量,用甲醇溶解并定容至50mL；將鮮竹葉抗氧化物樣品置于50℃烘箱中干燥至恒重,精密稱取樣品1.0g用甲醇定容至50mL。色譜分析時,稀釋10倍,經(jīng)0.45μm濾膜濾過,取2μL進(jìn)樣。色譜條件:Synthesis C18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm)；流動相:乙腈/0.5%冰醋酸(14∶86,v/v)；流速1mL/min,檢測波長340nm,柱溫:40℃[12]。

1.2.2 竹葉黃酮的酰化 將竹葉黃酮置于50℃真空干燥箱50min,放于干燥器中備用；將已活化的4A分子篩(300～400℃,3h)放入叔戊醇中,分子篩/叔戊醇=1∶10(g/mL),靜置24h,反應(yīng)前抽濾使用。取500mL叔戊醇于1000mL三口燒瓶中,后加入5.02g竹葉黃酮,6.40g硬脂酸(竹葉黃酮/硬脂酸≈1∶5(mol/mol),50℃下常壓回流,200r/min機(jī)械攪拌。原料充分溶解后,加入435脂肪酶25.00g,開始反應(yīng)。反應(yīng)24h后加入4A分子篩25.06g,之后每24h加入10.00g分子篩,繼續(xù)反應(yīng)48h[13-14]。反應(yīng)結(jié)束后抽濾濾液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),得8.24g混合物。

1.2.3 ?；a(chǎn)物的純化與分離 反應(yīng)產(chǎn)物用乙腈/正己烷(2∶5,v/v)溶解,于50℃下萃取20min,分液,取乙腈層旋轉(zhuǎn)蒸干；后將蒸干物用乙酸乙酯/水(2∶5,v/v)溶解,于60℃下萃取20min,分液,取乙酸乙酯層旋轉(zhuǎn)蒸干,得2.18g粗產(chǎn)物[15]。TLC確定較優(yōu)的展開劑比例:氯仿/甲醇/冰乙酸(7∶1∶0.05,v/v/v),將確定的展開劑比例適當(dāng)調(diào)低極性用于硅膠柱層析(200～300目,35mm×700mm玻璃柱)分離,洗脫劑:氯仿/甲醇/冰乙酸(10∶1∶0.05,v/v/v),恒定流速洗脫,每20mL收集一份洗脫液。洗脫液經(jīng)歸類,旋蒸除去溶劑,得兩單體產(chǎn)物。

1.2.4 ?；a(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定

1.2.4.1 高效液相色譜分析 ?；磻?yīng)后的混合物和經(jīng)硅膠柱層析分離得到的兩酰化產(chǎn)物分別進(jìn)行高效液相色譜分析,流動相為乙腈(A)和水(B)。色譜條件:COSMOSIL 5C18-MS-Ⅱ色譜柱(4.6ID×250mm)；采用梯度洗脫的方法,流動相配比為0min:A∶B=60∶40(v/v),20min:A∶B=100∶0(v/v),35min:A∶B=100∶0(v/v)；流速:1mL/min；柱溫:40℃；檢測器:紫外檢測器；檢測波長:340nm[16]。

1.2.4.2 紅外光譜分析 柱層析獲得的兩分離單體直接涂抹在紅外測定儀的透光鏡上測量,掃描范圍4000～500cm-1。

1.2.4.3 分離產(chǎn)物的ESI-MS,1H-NMR和13C-NMR測定條件 柱層析兩分離單體采用色譜級甲醇溶解,溶液濃度為10mg/mL。質(zhì)譜條件:電噴霧ESI離子源,電子能量70eV,傳輸線溫度275℃,離子源溫度200℃,采用負(fù)離子模式,激活電壓1.5V,質(zhì)量掃描范圍0～1000m/z。以四甲基硅為內(nèi)標(biāo)、氘代二甲基亞砜(DMSO-d)為溶劑,1H-NMR和13C-NMR在30℃采用500MHz頻率分別對分離純化的兩單體進(jìn)行掃描。

1.2.5 ?；a(chǎn)物的親脂性 100μmol的物質(zhì)溶解于10mL的正辛醇(水飽和)中,加入10mL的水(正辛醇飽和),2000r/min下離心10min,靜置分液,分別旋轉(zhuǎn)蒸干,測定正辛醇層和水層中物質(zhì)含量,計算分配系數(shù),平行測定3次,取平均值[17]。結(jié)果以logP表示,方程式如下:

P=C0/Cw

C0:平衡時物質(zhì)在正辛醇相中的濃度。Cw:平衡時物質(zhì)在水相中的濃度。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)采用Origin8.0和MestReNova軟件處理解析,結(jié)構(gòu)式采用Chemdrw10.0版本繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 竹葉黃酮的HPLC分析

鮮竹葉抗氧化物(竹葉黃酮總含量約為40%)用甲醇溶解定容,經(jīng)0.45μm濾膜濾過除雜,進(jìn)行高效液相色譜分析。由圖1標(biāo)準(zhǔn)品定位可知,1為異葒草苷,2為葒草苷,3為牡荊苷,4為異牡荊苷。由圖2可知,經(jīng)HPLC分析,竹葉黃酮中的四種黃酮苷得到了較好分離。按外標(biāo)法以峰面積計算,四種竹葉黃酮的含量分別為:異葒草苷58.51%,葒草苷16.79%,牡荊苷4.34%,異牡荊苷18.36%；即四種黃酮苷的含量異葒草苷>異牡荊苷>葒草苷>牡荊苷。

圖1 四種黃酮苷標(biāo)品的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of four Flavonoid Glycosides 注:1:異葒草苷;2:葒草苷；3:牡荊苷;4:異牡荊苷,圖2同。

圖2 竹葉黃酮的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of Flavonoid Glycosides from Bamboo Leaf

2.2 高效液相色譜分析

酰化產(chǎn)物混合物經(jīng)液液萃取,去除未反應(yīng)的黃酮苷和脂肪酸等雜質(zhì)；后經(jīng)硅膠柱層析分離純化,TLC檢測歸類,得兩種酰化產(chǎn)物。由圖3、圖4可知,反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過水和正己烷的多次萃取除雜之后,保留時間在16～25min間有明顯的吸收峰,其中23.19min峰為異牡荊苷-6″-硬脂酸酯,21.35min峰為異葒草苷-6″-硬脂酸酯,其余峰經(jīng)質(zhì)譜鑒定均非目標(biāo)產(chǎn)物。由于葒草苷和異葒草苷以及牡荊苷和異牡荊苷為兩對同分異構(gòu)體,黃酮苷糖基上均有6″-羥基,理論上講,產(chǎn)物不應(yīng)只有兩種已?；狞S酮苷。但目前通過硅膠柱層析分離和高效液相色譜分析,只分離純化得到以上兩種?；a(chǎn)物。

圖3 ?；a(chǎn)物的高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of reaction product注:1:異葒草苷-6″-硬脂酸酯；2:異牡荊苷-6″-硬脂酸酯,圖4同。

圖4 異牡荊苷-6″-硬脂酸酯和異葒草苷-6″-硬脂酸酯的高效液相色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of isoorientin-6″-stearate and isovitexin-6″-stearate

2.3 異牡荊苷-6″-硬脂酸酯和異葒草苷-6″-硬脂酸酯的紅外圖譜分析

純化?；a(chǎn)物的紅外圖譜如圖5所示:分析可知,吸收峰3391.32cm-1和3401.94cm-1分別為酚羥基、糖基上的羥基峰；羰基的伸縮振動區(qū)域在1900～1500cm-1,吸收峰1653.53cm-1和1651.14cm-1為黃酮羰基峰；1600～1450cm-1區(qū)域是芳環(huán)的骨架振動區(qū),吸收峰1450,1500,1600cm-1附近為苯環(huán)骨架振動峰,以上均與黃酮類化合物吸收峰一致[18]；而2924,2854cm-1左右峰為烷烴飽和C-H伸縮振動的特征吸收峰,1726.33,1717.96cm-1為酯基的特征吸收峰,1249.02,1270.95cm-1處為酯基中C-O伸縮振動吸收峰[19],綜合紅外圖譜分析,符合竹葉黃酮酯化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特征。

圖5 異牡荊苷-6″-硬脂酸酯和異葒草苷-6″-硬脂酸酯的紅外圖譜Fig.5 FT-IR spectra of isoorientin-6″-stearate and isovitexin-6″-stearate

2.4 異牡荊苷-6″-硬脂酸酯和異葒草苷-6″-硬脂酸酯的ESI-MS分析

?；a(chǎn)物用甲醇溶解,ESI-MS二級圖譜如圖6所示,已知異牡荊苷硬脂酸酯和異葒草苷硬脂酸酯的分子量M=698、714；M1=697.7、713.6分別為去氫[M-H]-峰,M2=679.8、695.7分別為去水[M1-18]-([M1-H2O]-)峰,M3=413.3、429.4分別為去硬脂酸[M1-284]-([M1-C18H36O2]-)峰；?；a(chǎn)物黃酮苷部分異牡荊苷和異葒草苷分子量M4=432、448,M5=341.3、357.5分別為[M4-H-90]-([M4-H-C3H6O3]-)峰,M6=311.3、327.3分別為[M4-H-120]-([M4-H-C4H8O4]-)峰,M7=269.0、285.4為苷元芹菜素和木犀草素離子[M4-163]-([M4-C6H11O5]-)峰,以上碎片峰與文獻(xiàn)黃酮碳苷的裂解特征一致[20]。

圖6 異牡荊苷-6″-硬脂酸酯(A)和異葒草苷-6″-硬脂酸酯(B)的ESI-MS二級圖譜Fig.6 Second class ESI-MS chromatogram of isoorientin-6″-stearate (A) and isovitexin-6″-stearate(B)

2.5 異牡荊苷-6″-硬脂酸酯和異葒草苷-6″-硬脂酸酯的1H-NMR和13C-NMR分析

圖7 異牡荊苷-6″-硬脂酸酯和異葒草苷-6″-硬脂酸酯的1H-NMR圖譜Fig.7 1H-NMR spectra of isoorientin-6″-stearate and isovitexin-6″-stearate

為進(jìn)一步表征并區(qū)分兩分離單體的結(jié)構(gòu),將純化后的單酯溶于氘代二甲基亞砜(DMSO-d),核磁共振儀掃描。由圖7、圖8及表1、表2的1H-NMR、13C-NMR分析可知,酯基上的-αCH2-C=O為δ1H=2.25,酯基上的-βCH2-為δ1H=1.45、1.48,酯基上的-(CH2)8-在δ1H=1.16、1.22,酯基上的CH3-為δ1H=0.83,δ13C=173.36、173.39為C=O,說明?；磻?yīng)成功。此外,與異葒草苷和異牡荊苷1H-NMR、13C-NMR對比分析[21],確定酰化物物為異牡荊苷硬脂酸酯和異葒草苷硬脂酸酯；同時,6″位的碳的化學(xué)位移向低場偏移(δ13C=61.57、61.61→64.68、64.69),按文獻(xiàn),同樣說明?；恢迷?″-羥基上[13]。最終確定分離得到的?；餅楫惸登G苷-6″-硬脂酸酯和異葒草苷-6″-硬脂酸酯,結(jié)構(gòu)式如下:

圖8 異牡荊苷-6″-硬脂酸酯和異葒草苷-6″-硬脂酸酯的13C-NMR圖譜Fig.8 13C-NMR spectra of isoorientin-6″-stearateand isovitexin-6″-stearate

表1 異牡荊苷-6″-硬脂酸酯和異葒草苷-6″-硬脂酸酯的1H-NMR分析Table1 1H-NMR data of isoorientin-6″-stearate and isovitexin-6″-stearate

表2 異牡荊苷-6″-硬脂酸酯和異葒草苷-6″-硬脂酸酯的13C-NMR分析Table2 13C-NMR data of isoorientin-6″-stearate and isovitexin-6″-stearate

圖9 異牡荊苷-6″-硬脂酸酯和異葒草苷-6″-硬脂酸酯的結(jié)構(gòu)式Fig.9 Structures of isoorientin-6″-stearate and isovitexin-6″-stearate

2.6 異牡荊苷-6″-硬脂酸酯和異葒草苷-6″-硬脂酸酯的親脂性分析

異牡荊苷和異葒草苷在正辛醇/水體系lgP通過Chemdraw 7.0軟件分析分別為-0.72、-1.11,而經(jīng)實驗測定異牡荊苷-6″-硬脂酸酯和異葒草苷-6″-硬脂酸酯logP分別為9.36、8.74,表明經(jīng)過?；笪镔|(zhì)的親脂性得到了較大提高。

3 結(jié)論

本文以固定化脂肪酶B催化竹葉黃酮與硬脂酸反應(yīng),合成并純化得到了兩個竹葉黃酮的新單酯產(chǎn)物。采用薄層層析和硅膠柱層析對?；a(chǎn)物進(jìn)行分離純化,經(jīng) IR、ESI-MS、NMR鑒定,確定兩組分別為異牡荊苷-6″-硬脂酸酯異葒草苷-6″-硬脂酸酯,測定并比較了兩種?；a(chǎn)物的正辛醇/水體系分配系數(shù),結(jié)果表明兩種產(chǎn)物親脂性明顯提高,達(dá)到預(yù)期目標(biāo)。

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Enzymatic acylation,isolation and identification of flavonoid glycosides from bamboo leaves

SUN Yuan-kui,MA Xiang,LIU Liu,LU Yu-yun,YAN Ri-an*

(Department of Food Science and Engineering,Jinan University,Guangzhou 510632,China)

ImmobilisedCandidaAntarcticalipase B(Novozmy 435)was used to acylate flavonoid glycosides from bamboo leaves intert-amyl alcohol,with stearic acid as acyl donors at low moisture content. The optimum reaction condition was as follows:a molar ratio of flavonoid glycosides from bamboo leaves to Stearic acid of 1∶5,50g/L lipase,stirring speed was 200r/min,50℃ and reaction time was 72h. After Liquid-liquid extraction,the products of esterification reactions were subjected to thin-layer chromatography(TLC,UV 254nm),a silica gel column(700mm×35mm,i.d.),the developing solvent ratio was chloroform/methanol/acetic acid(7∶1∶0.05,v/v/v),and eluted with chloroform/methanol/acetic acid(10∶1∶0.05,v/v/v). Then combine fractions had the same value of retardation factor Rf,two types of acylated flavonoids were obtained. The purified products were analyzed by IR,ESI-MS,1H-NMR and13C-NMR and the two types of acylated flavonoids were isoorientin-6″-stearate and isovitexin-6″-stearate. The enzyme showed strong selectivity for acylation of glycosides.

immobilised lipase B;flavonoid glycosides;Acylation;TLC;Silica gel chromatography

2014-07-23

孫元奎(1988-)，男，碩士研究生，研究方向：食品添加劑的制備與應(yīng)用

*通訊作者:晏日安(1962-)，男，博士，教授，研究方向：食品添加劑的制備與應(yīng)用。

廣東省自然科學(xué)基金(S2013010012931)。

TS202.3

A

:1002-0306(2015)09-0096-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.012