高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)篩查人尿中40種世界反興奮劑機(jī)構(gòu)禁用藥物

申 利

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高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)篩查人尿中40種世界反興奮劑機(jī)構(gòu)禁用藥物

申 利

運(yùn)用酸水解-液液萃取及直接液液萃取相結(jié)合的方法對(duì)尿樣進(jìn)行前處理，建立了同時(shí)篩查WADA《禁用清單》中β-阻斷劑和麻醉劑，部分刺激劑及β2-激動(dòng)劑的檢測方法。涵蓋藥物40種，檢出限范圍分布在0.1～10 ng/mL，在低濃度、WADA技術(shù)文件要求最低檢測濃度(MRPL)和高濃度時(shí)相對(duì)回收率分布在1.6%～118.6%。解決了實(shí)驗(yàn)室原有方法不能達(dá)到技術(shù)文件MRPL的問題，在快速篩查尿樣時(shí)效果良好。方法靈敏、簡單、經(jīng)濟(jì)、快速，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；β-阻斷劑；麻醉劑；刺激劑；β2-激動(dòng)劑；多重反應(yīng)監(jiān)測

1 前言

世界反興奮劑機(jī)構(gòu)(以下簡稱“WADA”)每一年度都會(huì)頒布即時(shí)的《禁用清單》，涵蓋的禁用物質(zhì)包括12大類，禁用物質(zhì)原型總數(shù)超過200個(gè)。實(shí)際工作中除檢測禁用物質(zhì)外，還要求檢測其各級(jí)代謝物和相關(guān)化合物及其代謝物，整個(gè)實(shí)驗(yàn)室需定性檢出的化合物總數(shù)超過400個(gè)[12]，這就要求實(shí)驗(yàn)室的初篩應(yīng)盡可能的用一種方法同時(shí)定性檢出較多的藥物。在《禁用清單》中，WADA 規(guī)定禁用β-阻斷劑20個(gè)，麻醉劑11個(gè)，刺激劑66個(gè)，β2-激動(dòng)劑6個(gè)，中國反興奮劑中心檢測實(shí)驗(yàn)室先前檢測這些禁用物質(zhì)是采用了傳統(tǒng)的氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用(GC/MS)技術(shù)[1,7,8,9],方法可滿足以前的要求。近年來，WADA技術(shù)文件[11]對(duì)檢測靈敏度的要求越來越高，新版本對(duì)各類禁用物質(zhì)的最低檢測濃度要求(MRPL)均有很大的提高，有些物質(zhì)的MRPL甚至是原來的1/10。本實(shí)驗(yàn)室原有的檢測方法已不能達(dá)到WADA技術(shù)文件的要求，日常檢測及WADA外部質(zhì)量控制評(píng)估計(jì)劃工作中存在著極大的隱患。本研究即選取40種禁用物質(zhì)作為研究對(duì)象建立新的檢測方法。這些藥物的共同特征為：1)現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)室檢測方法不能全部滿足技術(shù)文件要求；2)原形和/或其代謝物為以結(jié)合型(葡萄糖醛酸甙或硫酸酯)和游離型兩種形式，但主要以結(jié)合形式在尿中存在[2]；3)分子極性較大，不易揮發(fā)，GC/MS檢測需先進(jìn)行衍生化，尿樣前處理步驟繁瑣。

近年來，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC/MS)日漸成熟，在分析化學(xué)領(lǐng)域取得了大范圍的應(yīng)用，越來越多的興奮劑檢測實(shí)驗(yàn)室采用液質(zhì)方法[3-5]進(jìn)行這幾類物質(zhì)的檢測。但WADA各實(shí)驗(yàn)室禁用物質(zhì)分類和尿樣前處理步驟各行其道，所用儀器也不盡相同[4,6,10]。為了保持我實(shí)驗(yàn)室在興奮劑檢測領(lǐng)域的檢測資格和技術(shù)領(lǐng)先地位，保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，進(jìn)行液質(zhì)檢測方法的研究十分必要。本研究選取了所有β-阻斷劑和麻醉劑，以及7個(gè)刺激劑和3個(gè)β2-激動(dòng)劑作為研究對(duì)象，充分利用了實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的儀器和試劑，運(yùn)用鹽酸水解-液液萃取及直接液液萃取相結(jié)合的方法對(duì)尿樣進(jìn)行前處理，利用高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，建立了同時(shí)篩查WADA禁用清單中β-阻斷劑和麻醉劑，部分刺激劑及β2-激動(dòng)劑的檢測方法。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器和設(shè)備

6410 Triple Quad LC-MS：美國Agilent公司產(chǎn)品；色譜柱：Agilent Zorbax XDB-C18色譜柱(2.1 mm×50 mm×3.5 μm)，美國Agilent公司產(chǎn)品；電子天平：瑞士Mettler Toledo公司產(chǎn)品；Dri-block DB-3D氮?dú)獯蹈裳b置：美國Techne公司產(chǎn)品；低速離心機(jī)：美國Thermo公司產(chǎn)品；低溫恒溫液浴循環(huán)兩用槽：杭州雪中炭恒溫技術(shù)有限公司產(chǎn)品；超純水機(jī)：美國Millipore公司產(chǎn)品；振蕩器：德國Gmbh&Co.KG公司產(chǎn)品； Finnpipette系列取液器：美國Thermo-Finnpipette公司產(chǎn)品。電熱鼓風(fēng)干燥箱：國產(chǎn)。

2.2 試劑與材料

標(biāo)準(zhǔn)品來源見表1。

表1 本研究實(shí)驗(yàn)對(duì)象及禁用物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品來源一覽表Table 1 The Subjects and Source of Reference Standards

注：乙腈、甲醇、甲酸胺、甲酸(色譜純):DIKMA TECHNOLOGY Inc.美國。L-半胱氨酸(L-Cysteine)及其余均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

2.3 陽性尿的配制

準(zhǔn)確稱取各種禁用物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品1 mg，配制成1 mg/mL甲醇溶液作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，再以甲醇為溶劑倍比稀釋成10 ng/μL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液備用。按照表1中各類禁用物質(zhì)的MRPL要求，準(zhǔn)確量取標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分4組配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，量取該溶液，加入3 mL空白尿樣，按照各自的MRPL配成混合控制尿樣。

2.4 實(shí)驗(yàn)方法

2.4.1 樣品前處理

1.尿樣3 mL,加10 μL內(nèi)標(biāo)甲醇溶液(甲基睪酮，10 ng/μL)，加入約50 mg L-半胱氨酸和0.2 mL濃鹽酸(約14 mol/L)，100℃水解30 min，冷卻后加0.25 mL 12 mol/L NaOH溶液中和，再加入約1.5 g固體緩沖劑(NaHCO3/K2CO3=3/2,w/w,pH=9.6)和3 mL提取液(乙醚/異丙醇=9/1,v/v)萃取，留取有機(jī)相備用。

2.尿樣3 mL,加10 μL內(nèi)標(biāo)甲醇溶液(甲基睪酮，10 ng/μL)，加入約1.5 g固體緩沖劑和3 mL提取液萃取，留取有機(jī)相備用。

3.合并1和2的有機(jī)相，60℃氮?dú)饬飨麓蹈?，用初始流?dòng)相溶解定容至500 μL，進(jìn)樣10 μL 于LC-MS/MS。

2.4.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.色譜條件：Agilent Zorbax XDB-C18色譜柱(2.1 mm×50 mm×3.5 μm)；柱溫40 ℃；流動(dòng)相采用pH 3.5的甲酸胺緩沖液(A)和乙腈(B)進(jìn)行梯度洗脫；洗脫梯度：0～1 min:95%A～5%B，1～7 min:30%A～70%B；7～8 min:0%A～100%B，9 min:0%A～100%B。流速0.4 mL/min，運(yùn)行9 min，平衡4.5 min；進(jìn)樣量10 μL。

2.質(zhì)譜條件：多反應(yīng)離子監(jiān)測(MRM)；離子化方式：電噴霧(ESI)；離子極性：正離子模式；毛細(xì)管電壓：4 000 V；干燥器溫度：330 ℃；干燥器流速：10.0 L/min；定性分析采用離子對(duì)(母離子和兩個(gè)子離子)信息比較和保留時(shí)間比較。

3 結(jié)果與討論

3.1 質(zhì)譜條件的選擇

根據(jù)此類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征，選擇正離子模式。通過對(duì)各個(gè)禁用物質(zhì)單標(biāo)溶液分別進(jìn)樣進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描，確定其準(zhǔn)分子離子峰，并分別優(yōu)化每種物質(zhì)的錐孔電壓。分別以其準(zhǔn)分子離子峰為母離子，通過不同的碰撞電壓產(chǎn)生碎片進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，選擇豐度較高的兩個(gè)碎片離子作為定性特征離子，同時(shí)優(yōu)化其碰撞能量。鑒于采集的離子對(duì)較多，為了保證檢出靈敏度，質(zhì)譜檢測在0～5 min，5～9 min進(jìn)行分段采集(表2)。

表2 本研究禁用物質(zhì)檢測的色譜及質(zhì)譜條件一覽表Table 2 HPLC-MS/MS Conditions

3.2 色譜條件的優(yōu)化

綜合文獻(xiàn)[3,5]以及實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇乙腈/水作為流動(dòng)相體系。在流動(dòng)相中添加緩沖鹽調(diào)節(jié)系統(tǒng)的pH值。由于本研究的目的側(cè)重用較短的時(shí)間盡量分析較多的物質(zhì)和較多的樣品，而涉及的禁用物質(zhì)分子量大小分布范圍較寬，保留情況各不相同，所以，通過不同的洗脫梯度比較，確定了乙腈的起始濃度為5%，最終濃度為100%，運(yùn)行時(shí)間為9 min的梯度洗脫條件，通過調(diào)節(jié)不同時(shí)間段內(nèi)的流動(dòng)相配比，盡量使40種禁用物質(zhì)達(dá)到比較良好的分離。由于興奮劑檢測工作要求快速出結(jié)果，所以，選用了較短的色譜柱，較短的運(yùn)行時(shí)間，而初篩采用的MRM模式減少了各個(gè)禁用物質(zhì)定性離子間的相互干擾，即使在色譜分離不理想的情況下，也能得到較好的分析結(jié)果(表2)。

3.3 尿樣前處理方法的選擇

文獻(xiàn)報(bào)道[2]本研究涉及的3種β2-激動(dòng)劑幾乎全部以硫酸酯結(jié)合形式存在于尿中，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，從尿中提取前需進(jìn)行酸水解方可游離出檢測物質(zhì)。試驗(yàn)中涉及的麻醉劑和刺激劑及β-阻斷劑在尿中排泄時(shí)的結(jié)合方式為葡萄糖醛酸甙結(jié)合，實(shí)驗(yàn)表明，酸水解、酶水解均可較好地游離出檢測物，為了同時(shí)檢出這些物質(zhì)，最后選擇成本較低，操作簡單的酸水解方法。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，bisoprolol,atenolol，pindolol，timolol,esmolol,dextromoramide,methadone,oxycodone,pethidine等禁用物質(zhì)在強(qiáng)酸條件下可能被破壞，所以，采用了另取一份尿樣直接提取后與水解后提取的樣品合并的方法，兼顧到了所有涉及到的物質(zhì)，結(jié)果較為理想。

3.4 方法的回收率和檢出限

1.按照每種藥物的20% MRPL，MRPL和500% MRPL配制相應(yīng)濃度的控制尿樣各10份，按照前述方法進(jìn)行前處理，與等量的標(biāo)準(zhǔn)品溶液平行進(jìn)樣，提取各個(gè)藥物的豐度較高的子離子積分得到峰面積，比較得出提取回收率(平均值，表3)。

2.配制一系列較低濃度的控制尿樣，按照前述方法進(jìn)行前處理，提取后進(jìn)樣，提取豐度較低的子離子，根據(jù)信噪比計(jì)算得出禁用物質(zhì)的尿中檢出限(S/N=5，表3)。

表3 本研究藥物的回收率和檢出限一覽表Table 3 The Limits of Detection and the Recoveries at Different Concentrations

續(xù)表 3

注：* Benzoylecgonine為cocaine的主要代謝物，為尿中的必要檢測物質(zhì)，本方法對(duì)此物質(zhì)的提取回收率極低，但由于其良好的質(zhì)譜響應(yīng)，使得2%的回收率仍能獲得4 ng/mL的尿中檢出限，滿足檢測初篩要求，如果初篩檢測尿樣中發(fā)現(xiàn)此物質(zhì)疑似陽性，進(jìn)行確證時(shí)本實(shí)驗(yàn)室采取不同的提取方法。這也符合WADA的技術(shù)文件要求。

部分禁用物質(zhì)在20% MRPL濃度時(shí)的MRM圖見圖1。

圖1 本研究20% MRPL 濃度下部分禁用物質(zhì)的MRM示意圖Figure 1. The MRM Chromatograms of Several Prohibited Substances at 20% MRPL Concentration

3.5 精密度

選取了benzoylecgonine,ethamivan,fentanyl,metoprolol,nadolol,propranolol和terbutaline等7種較為易得的禁用物質(zhì)進(jìn)行方法的精密度實(shí)驗(yàn)，這7種物質(zhì)保留時(shí)間和提取回收率分布在不同區(qū)域，也是陽性率較高或檢出較為困難的禁用物質(zhì)。配置20% MRPL濃度、MRPL濃度和500% MRPL濃度的控制尿樣，分別由2名實(shí)驗(yàn)人員各取5份平行進(jìn)行分析，提取豐度較高的子離子積分得到峰面積，計(jì)算其CV得到日內(nèi)精密度。按照日內(nèi)精密度的操作方法，每天進(jìn)行1次實(shí)驗(yàn)，共3天，計(jì)算CV 得到日間精密度。結(jié)果均小于15%，符合技術(shù)文件要求，證明本檢測方法穩(wěn)定可靠。

3.6 基質(zhì)干擾

收取50份空白尿樣，按照本研究中方法進(jìn)行化學(xué)前處理及LC-MS/MS檢測分析，觀察待測離子窗口，所有窗口均無明顯干擾。

3.7 實(shí)際樣品檢測

目前，本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)采用此方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室的所有常規(guī)樣品進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)本研究開發(fā)的LC-MS/MS方法檢測陽性質(zhì)控樣品結(jié)果準(zhǔn)確無誤，離子清晰易見，陰性樣品在所有窗口均無明顯干擾。到目前為止，檢測樣品超過2萬例，檢出包括WADA 外部質(zhì)量評(píng)估計(jì)劃樣品在內(nèi)的陽性樣品數(shù)10例，初篩結(jié)果靈敏度高，干擾小，圖譜清晰。

4 結(jié)論

本研究建立的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)檢測40種WADA禁用物質(zhì)的方法，選擇性好，靈敏度高。與原有的氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用方法比較，具有以下優(yōu)勢：1)靈敏度大幅提高，完全滿足了WADA最新的最低檢測要求(MRPL)；2)無需進(jìn)行衍生化，前處理方法簡化，時(shí)間縮短了1 h以上，降低了工作量，減低了工作人員因?yàn)榻佑|衍生化試劑而潛在的健康威脅；3)對(duì)每一個(gè)樣品而言，儀器分析時(shí)間縮短了10 min，這對(duì)興奮劑檢測工作的時(shí)效性十分重要；4)方法選擇性好，無干擾，結(jié)果一目了然，降低了結(jié)果處理的工作強(qiáng)度；5)消除了實(shí)驗(yàn)室檢測工作中的重大隱患。

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Simultaneous Detection of 40 WADA Prohibited Substances in Human Urine by High Performance Liquid Chromatography-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry

SHEN Li

A high performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry method was developed for a simultaneous detection of 40 prohibited substances,covered β-blockers and narcotics,some stimulants and β2-agonists which are included in the prohibited list issued by the World Anti-Doping Agency (WADA).After the pretreatment with acid hydrolysis,extraction and enrichment procedures,the urine sample was injected to the LC-MS/MS.The limits of detection were between 0.1～10 ng/mL according to different substances.The spiked recoveries at low concentration,WADA Minimum Required Performance Levels (MRPL) and high concentration were within the range of 1.6% to 118.6%.This method was a simple,fast,effective and reliable solvent to our laboratory and now has been successfully applied to the routine analysis and the External Quality Assessment Scheme set out by WADA.

highperformanceliquidchromatography-massspectrometry;β-blockers;narcotics;stimulants;β2-agonist;multiplereactionmonitoring

1000-677X(2015)05-0066-05

10.16469/j.css.201505009

2014-12-02；

2015-03-16

國家體育總局重點(diǎn)領(lǐng)域研究課題(2013B002)。

申利(1969-)，女，河北石家莊人，副研究員，碩士，主要研究方向?yàn)榕d奮劑檢測新方法，Tel：(010)84376803，E-mail：shenli@chinada.cn。

國家體育總局 反興奮劑中心，北京 100029 China Anti-doping Agency,Beijing 100029,China.

G804.7

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