病理性礦化促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展的研究進(jìn)展

盧偉誠(chéng) 閆艦飛 覃文聘 牛麗娜 焦 凱

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是關(guān)節(jié)炎中發(fā)生率最高的一種，患者通常會(huì)出現(xiàn)關(guān)節(jié)疼痛、僵硬和腫脹等臨床表現(xiàn)。該疾病會(huì)給患者帶來極大的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。與此同時(shí)OA的發(fā)病因素和致病機(jī)制極為復(fù)雜，包括高齡、肥胖、遺傳和系統(tǒng)性疾病在內(nèi)的諸多因素均可對(duì)疾病發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生重大影響，因而除對(duì)癥治療以及手術(shù)干預(yù)外，尚無有效的治療方法可真正治愈OA[1]。關(guān)節(jié)退變是OA最典型的病理特征之一，病變往往會(huì)侵襲至整個(gè)關(guān)節(jié)組織，包括軟骨、軟骨下骨、半月板、滑膜、韌帶和外周肌肉在內(nèi)均有發(fā)生病變的可能[2]。

多項(xiàng)研究顯示，軟骨和關(guān)節(jié)軟組織的病理性礦化是OA發(fā)病過程中的一個(gè)重要特征：(1)回顧以往的臨床研究，OA患者起病往往伴隨著軟骨、半月板等組織的病理性礦化。而且隨著檢測(cè)技術(shù)敏感度的提高，病理性礦化在OA患者中的檢出率也不斷升高，兩者的密切聯(lián)系不斷得到證實(shí)。(2)關(guān)節(jié)組織病理性礦化的程度往往與OA患者的疾病進(jìn)展密切相關(guān)，影像學(xué)發(fā)現(xiàn)病情嚴(yán)重的病理性礦化患者往往會(huì)伴有較為嚴(yán)重的關(guān)節(jié)軟骨破壞。(3)體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明，鈣鹽晶體能夠?qū)е萝浌墙M織發(fā)生退行性改變，包括軟骨細(xì)胞的表型改變以及炎性介質(zhì)的大量產(chǎn)生等。(4)阻斷或降低病理性礦化的程度可一定程度上緩解病情，如通過基因敲除以及藥物阻斷等手段可顯著降低疾病的嚴(yán)重程度[3]。因此，病理性礦化可能在OA發(fā)病過程中扮演了關(guān)鍵角色，研究其形成機(jī)制對(duì)于OA的治療具有重要的意義。

堿性磷酸鈣(basic calcium phosphate，BCP)和焦磷酸鈣二水合物(calcium pyrophosphate dihydrate，CPPD)在關(guān)節(jié)組織的病理性礦化中最為常見，其中BCP主要包括羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)、磷酸八鈣、磷酸三鈣等[4]。HA除參與組成關(guān)節(jié)組織的病理性礦化之外，還存在于血管組織的鈣化斑塊中，而CPPD可見于動(dòng)脈血管壁、皮膚和乳腺的異常礦化組織中。正常生理情況下組織中礦化的促進(jìn)因素和抑制因素處于動(dòng)態(tài)的平衡，因此生理性礦化只限于特定時(shí)期的特定部位，但當(dāng)這一平衡受到某種刺激被打破后就有可能會(huì)形成病理性礦化。本文將圍繞鈣平衡紊亂、磷代謝失調(diào)和基質(zhì)囊泡(matrix vesicle，MV)異常釋放3方面，對(duì)近年來有關(guān)OA病理性礦化的形成機(jī)制展開綜述。

一、鈣平衡紊亂

OA軟骨細(xì)胞中存在著鈣穩(wěn)態(tài)失衡的情況，鈣作為礦化物的主要組成元素，其穩(wěn)態(tài)的失衡可能是形成OA病理性礦化的重要促進(jìn)因素。

1.軟骨細(xì)胞中主要的Ca2+通道和受體：軟骨細(xì)胞相關(guān)的Ca2+通道和受體主要包括膜聯(lián)蛋白V(annexin V)、Ca2+敏感受體(calcium-sensing receptor, CaSR)和瞬時(shí)受體電位離子通道(transient receptor potential vanilloid 4, TRPV4)等，這些通道和受體主要分布在細(xì)胞膜表面以及高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器膜系統(tǒng)表面，有研究稱處于軟骨成骨發(fā)育過程中的軟骨細(xì)胞以及OA中的軟骨細(xì)胞表面的Ca2+通道和受體表達(dá)量均顯著提高，這一相似的表現(xiàn)或提示這兩者間存在著類似的礦化趨勢(shì)和礦化前的鈣調(diào)控[5]。膜聯(lián)蛋白V是磷脂雙分子層中Ca2+選擇性離子通道的重要組成部分，在軟骨細(xì)胞分泌的MV上表達(dá)量較高，具有調(diào)控MV內(nèi)部Ca2+濃度的作用。TRPV4介導(dǎo)了細(xì)胞內(nèi)的Ca2+信號(hào)通路，研究顯示條件性敲除小鼠軟骨細(xì)胞中的TRPV4相關(guān)基因能夠緩解OA的疾病進(jìn)展[6]。CaSR屬于G蛋白偶聯(lián)受體C家族一員，是細(xì)胞感受外界Ca2+濃度變化的重要受體，主要分布于成熟期和肥大軟骨細(xì)胞的細(xì)胞膜，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜表面。Zhang等[5]研究發(fā)現(xiàn)，OA軟骨細(xì)胞的CaSR表達(dá)量顯著上升，條件性靶向敲除OA模型鼠軟骨細(xì)胞的Casr基因或者向模型鼠的關(guān)節(jié)區(qū)注射CaSR的拮抗劑都能夠顯著降低關(guān)節(jié)區(qū)軟骨組織的病變程度以及鈣化程度，并且還發(fā)現(xiàn)OA軟骨細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡所介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞的終末分化同樣在OA軟骨組織的鈣化形成以及疾病進(jìn)展中發(fā)揮了重要的作用。

2.異常的外力刺激對(duì)于軟骨細(xì)胞內(nèi)Ca2+平衡的影響：Ca2+內(nèi)流以及細(xì)胞質(zhì)Ca2+濃度增加是細(xì)胞受到外力刺激后早期的行為表現(xiàn)之一，而這些改變的發(fā)生均離不開位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面的CaSR，其結(jié)合域能夠感知細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Ca2+濃度變化[5,7]。細(xì)胞在受到流體剪切力之后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜表面的CaSR的表達(dá)量顯著上升并伴隨線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的腫脹，同時(shí)軟骨細(xì)胞的終末分化和組織鈣化相關(guān)蛋白的表達(dá)水平也顯著提升。在這種情況下通過使用CaSR的拮抗劑能夠有效抑制軟骨細(xì)胞終末分化的趨勢(shì)。給予小鼠關(guān)節(jié)區(qū)異常的應(yīng)力刺激后，其軟骨細(xì)胞CaSR表達(dá)上調(diào)同時(shí)也能夠產(chǎn)生類似OA的組織鈣化表現(xiàn)，如關(guān)節(jié)軟骨變薄以及軟骨基質(zhì)中Ⅱ型膠原和蛋白多糖的含量顯著下降，但是在Casr基因敲除的小鼠關(guān)節(jié)施加同樣的力學(xué)刺激后，類似的病理改變明顯減輕[5]。以上結(jié)果顯示，異常外力所介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度改變可能在病理性礦化的形成中發(fā)揮了重要的作用。

3.全身的Ca2+平衡異常對(duì)于病理性礦化形成的影響：某些系統(tǒng)性疾病往往伴隨著體液中Ca2+平衡的紊亂，進(jìn)而造成細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的丟失，這有可能成為病理性礦化的一個(gè)重要促進(jìn)因素。臨床中罹患OA的患者常常會(huì)伴發(fā)甲狀旁腺功能亢進(jìn)，提示Ca2+調(diào)節(jié)異常可能在OA的發(fā)病進(jìn)程中起到重要作用。甲狀旁腺通過分泌甲狀旁腺素(parathyroid hormone, PTH)動(dòng)員骨鈣入血，促進(jìn)腎小管和胃腸系統(tǒng)對(duì)鈣的重吸收，使血鈣濃度增加，進(jìn)而調(diào)控骨骼、胃腸道和腎臟內(nèi)鈣分布的平衡，其中甲狀旁腺細(xì)胞(parathyroid cell，PTC)可以對(duì)血清Ca2+濃度的細(xì)微變化做出反應(yīng)，并能迅速調(diào)節(jié)PTH的分泌以維持體液中Ca2+濃度的平衡。有研究顯示PTC中CaSR基因突變時(shí)會(huì)降低其對(duì)血清Ca2+濃度變化反應(yīng)的敏感程度，從而使其不能及時(shí)調(diào)控血鈣平衡，極易誘發(fā)病理性礦化[8]。

二、焦磷酸鹽(pyrophosphate, PPi)和磷酸鹽(phosphate, Pi)平衡對(duì)于病理性礦化形成的影響

細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)中PPi和Pi平衡異常是病理性礦化形成的重要促進(jìn)因素，軟骨和骨的細(xì)胞外基質(zhì)中的PPi濃度主要受到以下3種酶的調(diào)控，即焦磷酸水解酶(nucleoside triphosphate pyrophospho-hydrolase，NTPPH)、無機(jī)焦磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體(inorganic PPi transport regulator，ANK)和組織特異性堿性磷酸酶(tissue-nonspecific alkaline phosphatises, TNAP)[9]。

1.PPi和Pi平衡主要調(diào)控酶：NTPPH包括NTPPH-1(PC-1)、NTPPH-2(autaxin)和NTPPH-3(B10)等類型，其中PC-1主要位于軟骨細(xì)胞分泌的MV膜的表面，可通過水解細(xì)胞外基質(zhì)中的ATP及其類似物進(jìn)而提高細(xì)胞外基質(zhì)中的PPi濃度[10]。在先天性血管鈣化的患兒基因檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)其PC-1基因發(fā)生突變。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)將小鼠Pc-1特異性敲除會(huì)造成其關(guān)節(jié)半月板和韌帶的大量鈣化。這些證據(jù)都表明NTPPH異常引起的PPi和Pi平衡紊亂在病理性礦化的形成中發(fā)揮了重要的作用。ANK作為一種跨膜蛋白可將胞內(nèi)PPi轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外進(jìn)而提高細(xì)胞外基質(zhì)中PPi的濃度，有研究顯示OA患者軟骨中ANK的表達(dá)顯著上調(diào)[11]。TNAP主要通過糖基磷脂酰肌醇與細(xì)胞膜緊密結(jié)合，可以將細(xì)胞外基質(zhì)中的PPi以及其他的磷酸鹽類化合物水解生成Pi[12]。Pi同時(shí)可作為信號(hào)分子誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞TNAP表達(dá)水平的進(jìn)一步上調(diào)，促進(jìn)軟骨細(xì)胞終末分化并提高與礦化相關(guān)蛋白的表達(dá)[13]。另外，位于軟骨細(xì)胞胞膜和MV表面的Na/Pi轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可將細(xì)胞外的Pi轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)或基質(zhì)囊泡內(nèi)。在病理性礦化時(shí)，大量Pi便經(jīng)由此通道進(jìn)入胞內(nèi)或囊泡內(nèi)，而通過膦甲酸鈉特異性阻斷Na/Pi轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通道可有效抑制軟骨中病理性礦化的形成，再次顯示了PPi和Pi平衡調(diào)控酶的異常在病理性礦化的形成過程中“功不可沒”[14]。

2.PPi和Pi平衡異常在病理性礦化形成中的作用：軟骨細(xì)胞在生理情況下可以通過多種機(jī)制調(diào)控PPi和Pi的平衡進(jìn)而防止軟骨中病理性礦化的形成，但在OA患者中其平衡調(diào)控機(jī)制可能受到干擾。研究顯示，細(xì)胞外基質(zhì)中高濃度的PPi能夠抑制BCP晶體的成核和生長(zhǎng)，但同時(shí)PPi又是CPPD主要的陰離子來源，故可知高濃度PPi具有促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)中CPPD形成的作用，過高或過低的PPi濃度均會(huì)帶來礦化，因而維持PPi和Pi平衡對(duì)于避免病理性礦化晶體的形成具有一定的積極意義[10]。另據(jù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)了解，當(dāng)小鼠成骨細(xì)胞胞外基質(zhì)中Pi濃度降低時(shí)其骨質(zhì)的礦化程度也會(huì)相應(yīng)減低，更有研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)中Pi濃度高時(shí)會(huì)促進(jìn)成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的凋亡，揭示了Pi的濃度對(duì)維持正常礦化避免病理性礦化同樣不可或缺[15，16]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，軟骨細(xì)胞PPi代謝紊亂是原發(fā)性CPPD晶體沉積病的一個(gè)重要特征，而且軟骨鈣質(zhì)沉著癥患者家系中多發(fā)現(xiàn)ANK基因的變異，由于ANK對(duì)PPi的轉(zhuǎn)運(yùn)在細(xì)胞外基質(zhì)中PPi的調(diào)控方面發(fā)揮了重要的作用，這一發(fā)現(xiàn)再次佐證PPi和Pi平衡異常可能是病理性礦化相關(guān)疾病的重要危險(xiǎn)因素[11]。

三、MV在病理性礦化中的作用

由肥大化的軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞所分泌的MV在軟骨成骨和膜內(nèi)骨化的過程中發(fā)揮了重要的作用。其中，MV由細(xì)胞分泌后能夠在胞外富集鈣磷，之后沉積于細(xì)胞外基質(zhì)的膠原纖維中從而促進(jìn)骨基質(zhì)的礦化。MV來源于生物膜系統(tǒng)，直徑為100～300nm，通常作為細(xì)胞外基質(zhì)中礦化的核心，具有富集鈣磷以及促進(jìn)晶核形成的作用，目前研究顯示MV在生理性和病理性礦化中均發(fā)揮了重要的作用[15]。

1.MV在病理性礦化晶體成核、生長(zhǎng)中的作用：病理?xiàng)l件下，外界異常的刺激會(huì)促使軟骨細(xì)胞發(fā)生肥大化的同時(shí)分泌MV，而外界刺激超出細(xì)胞的調(diào)控能力后會(huì)誘使細(xì)胞發(fā)生凋亡，逐漸形成凋亡小體。有研究顯示，凋亡小體與MV類似，也具有富集鈣磷、促使晶核生成和推動(dòng)病理性礦化形成的作用[10]。MV膜含有調(diào)控Ca2+和Pi轉(zhuǎn)運(yùn)相應(yīng)的通道蛋白，包括膜聯(lián)蛋白、TNAP和Ⅲ型Na/Pi協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。研究發(fā)現(xiàn)來源于OA軟骨的MV膜相關(guān)的鈣通道調(diào)控蛋白的表達(dá)水平顯著提升[17]。MV從細(xì)胞外釋放后富集鈣磷，由于MV內(nèi)部的鈣磷趨向于形成晶相導(dǎo)致內(nèi)部的鈣磷濃度較低，所形成的離子梯度促使鈣磷在MV內(nèi)部的進(jìn)一步富集，逐漸在MV內(nèi)部形成鈣-無機(jī)磷酸鹽-磷脂復(fù)合物，這一復(fù)合物在后期可成為細(xì)胞外晶體形成的核心。MV膜富含酸性磷脂，如磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇等，其對(duì)Ca2+具有較高的親和力，促進(jìn)了MV對(duì)于鈣的攝入[10]。MV內(nèi)的礦化晶體逐漸生長(zhǎng)會(huì)破壞MV膜并釋放到ECM中，而后進(jìn)一步生長(zhǎng)形成礦化結(jié)節(jié)。Boskey等[18]提取MV在體外凝膠體系中培養(yǎng)并觀察到了以MV為核心的晶體的成核和生長(zhǎng)，從而肯定了MV在細(xì)胞外基質(zhì)礦化形成中所發(fā)揮的作用。

2. MV和ECM在病理性礦化形成過程中的相互作用：細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)礦化過程具有重要的調(diào)控作用，Ⅰ型膠原纖維是骨組織細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，可以作為吸引并控制磷酸鈣礦化前體滲透的活性模板，在膠原的礦化過程中發(fā)揮積極的作用[19]。Derfus等[20]研究顯示健康軟骨組織基質(zhì)中可見囊泡，但是很少發(fā)生礦化，而從健康軟骨組織中提取的囊泡在體外礦化的能力與OA來源的囊泡在體外的礦化能力比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，顯示了軟骨基質(zhì)成分對(duì)于囊泡的礦化調(diào)控可能具有重要的作用。膠原的斷裂和蛋白多糖的降解是OA軟骨細(xì)胞外基質(zhì)早期的改變之一，在OA發(fā)病初期，關(guān)節(jié)軟骨中的軟骨細(xì)胞發(fā)生肥大化，促使軟骨細(xì)胞分泌蛋白酶進(jìn)一步降解細(xì)胞外基質(zhì)，同時(shí)OA軟骨細(xì)胞的肥大化使其分泌的蛋白多糖和Ⅱ型膠原的數(shù)量顯著減少[21,22]。在OA軟骨中，細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)正常的區(qū)域內(nèi)少有異常的晶體沉積，提示細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的異?？赡茉阝}鹽結(jié)晶的形成中發(fā)揮重要作用[23]。Jubeck等[24]研究發(fā)現(xiàn)在體外Ⅱ型膠原濃度達(dá)到1.6mg/ml時(shí)，成骨細(xì)胞MV的礦化被顯著抑制，說明OA中軟骨基質(zhì)Ⅱ型膠原受到破壞可能會(huì)促進(jìn)病理性礦化的形成。蛋白多糖與細(xì)胞外的膠原支架一起對(duì)于維護(hù)細(xì)胞外基質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)發(fā)揮了重要的作用。蛋白多糖富含大量帶負(fù)電的硫酸鹽基團(tuán)和羧酸基團(tuán)，能夠使蛋白多糖分子在外周空間盡可能的伸展，這種空間效應(yīng)和電荷作用能夠減少鈣磷的碰撞，干擾細(xì)胞外基質(zhì)中鈣磷的結(jié)合，這些研究顯示蛋白多糖可能在抑制病理性礦化的過程中發(fā)揮了一定的作用。在OA疾病進(jìn)展中，細(xì)胞周圍基質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變可能促進(jìn)了MV來源晶體的生長(zhǎng)和擴(kuò)大，從而加重了OA的發(fā)病進(jìn)程。

四、展 望

病理性礦化晶體的出現(xiàn)與OA疾病進(jìn)展密切相關(guān)，且在OA的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要推動(dòng)作用。因而理清OA患者的病理性礦化形成機(jī)制對(duì)于尋找OA的治療方法具有重要理論意義和臨床指導(dǎo)價(jià)值。分析礦化的具體原因，軟骨細(xì)胞內(nèi)的鈣、磷代謝紊亂以及MV的異常釋放等因素可能發(fā)揮了重要促進(jìn)作用，這些平衡的紊亂和功能異常在不同程度上加速了OA的進(jìn)展。反過來看這些因素也可以成為治療OA的關(guān)鍵靶點(diǎn)，而筆者通過阻斷一個(gè)或者多個(gè)靶點(diǎn)最終可能達(dá)到遲滯病情發(fā)展甚至逆轉(zhuǎn)病情治愈疾病的目的。但目前對(duì)于OA病理性礦化形成機(jī)制的研究還相對(duì)較少，有待于未來開展深入地研究，筆者相信這一類以阻斷病理性礦化為手段的治療方法將會(huì)為OA的治療提供新的思路。