淺談2014年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng):超高分辨率熒光顯微成像*

孫育杰 陳軒澤

(北京大學(xué)生物膜與膜工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 生命科學(xué)學(xué)院生物動(dòng)態(tài)光學(xué)成像中心 北京100871)

1 光學(xué)顯微成像的衍射極限

生物醫(yī)學(xué)成像技術(shù)是基礎(chǔ)生物學(xué)研究和臨床醫(yī)學(xué)最重要的工具之一?；仡櫄v史，已有多位科學(xué)家憑借在成像技術(shù)方面的突破獲得諾貝爾獎(jiǎng)。其中，Roentgen因發(fā)現(xiàn)X射線獲得1901年諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng);Zernike因發(fā)明相襯顯微鏡獲得1953年諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng);Ruska的電子顯微鏡以及Binning和Rohrer的掃描隧道顯微鏡獲得1986年諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng);Lauterbur和Mansfield因發(fā)明核磁共振成像技術(shù)共同獲得2003年諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。在剛剛過(guò)去的2014年，諾貝爾獎(jiǎng)評(píng)審委員會(huì)再一次肯定成像技術(shù)的重要性，將諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予發(fā)展超分辨率熒光顯微成像技術(shù)的3位科學(xué)家。他們分別是來(lái)自美國(guó)霍華德·休斯醫(yī)學(xué)研究所的Eric Betzig、德國(guó)馬普生物物理化學(xué)所的Stefan W.Hell和美國(guó)斯坦福大學(xué)的William E.Moerner(圖1)。

圖1 獲得2014年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的3位科學(xué)家

光學(xué)顯微成像的起源大約可以追溯到16世紀(jì)末荷蘭眼鏡商Janssen和他的兒子發(fā)明的原始光學(xué)顯微鏡。他們把兩個(gè)凸透鏡安裝在一個(gè)筒中，發(fā)現(xiàn)這種組合可以放大物體。在之后的幾十年中，荷蘭人Anthony Von Leeuwenhoek和英國(guó)人Robert Hooke在成像原理和實(shí)踐中不斷改進(jìn)，實(shí)現(xiàn)了現(xiàn)代光學(xué)顯微鏡的雛形。Leeuwenhoek第一次觀察到了牙縫中的細(xì)菌;而Hooke則于1665年在顯微鏡下看到了軟木塞的微小結(jié)構(gòu)并將其命名為細(xì)胞(cell)，成為生物學(xué)研究的一個(gè)里程碑。在接下來(lái)的300多年里，各種基于光學(xué)顯微的生物成像技術(shù)不斷涌現(xiàn)，生物學(xué)家也因此取得了一個(gè)接一個(gè)重大發(fā)現(xiàn)。

雖然光學(xué)顯微鏡如此有用，但生物學(xué)家一直不滿意其分辨率。特別是細(xì)胞生物學(xué)家在觀察細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)時(shí)圖像模糊，無(wú)法看清楚細(xì)節(jié)。在實(shí)際操作中，有多種因素會(huì)影響光學(xué)成像的清晰度，包括樣品自身的背景光以及對(duì)光的吸收、散射和折射等光與物質(zhì)的相互作用過(guò)程，也包括物鏡的色差、球差、透光度和成像元件的靈敏度等硬件因素。在這些因素之外，光學(xué)成像的分辨率的理論極限則是由光的衍射決定的。早在1835年，英國(guó)科學(xué)家George B.Airy就提出了“愛里斑(Airy disk)”的概念(圖2):由于光的衍射，即使一個(gè)無(wú)限小的發(fā)光點(diǎn)在通過(guò)透鏡成像時(shí)都會(huì)形成一個(gè)彌散的圖案，即愛里斑，而其在像平面處的光強(qiáng)分布函數(shù)稱為這個(gè)光學(xué)系統(tǒng)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(point spread function，PSF)。

圖2 George B.Airy和他提出的愛里斑

1873年，德國(guó)著名科學(xué)家Ernst Abbe揭示了由于光學(xué)成像有限孔徑下光的衍射效應(yīng)產(chǎn)生的Airy disk與成像分辨率之間的關(guān)系，即著名的阿貝光學(xué)衍射極限理論(Abbe's diffraction limit)［1］。

式中d是分辨率，λ是光的波長(zhǎng)，n是介質(zhì)的折射率，θ是聚焦光錐的半角。nsinθ又稱為數(shù)值孔徑(numerical aperture，NA)?；谶@個(gè)公式可以看出，對(duì)于可見光波段(波長(zhǎng)400～700nm)以水為介質(zhì)的成像，由于水的折射率為1.33，而sinθ最大值是1，則其分辨率極限約為150nm。當(dāng)然，θ角無(wú)法達(dá)到90度，而實(shí)際上水鏡的數(shù)值孔徑(NA)一般在1左右。所以通?？梢远x成像分辨率約為光的波長(zhǎng)的一半，即當(dāng)兩個(gè)點(diǎn)光源相距200nm以內(nèi)時(shí)，它們的Airy disk會(huì)有很大的重疊而無(wú)法區(qū)分;同時(shí)這個(gè)公式也限定了光束聚焦形成光斑的最小尺寸約為光波長(zhǎng)的一半。阿貝光學(xué)衍射極限理論給了我們基本的物理極限，意義重大，因此Abbe的這個(gè)經(jīng)典公式也成為了他墓碑上的全部?jī)?nèi)容(圖3)。

圖3 Ernst Abbe揭示了光學(xué)成像中著名的阿貝光學(xué)衍射極限理論(Abbe's diffraction limit)，其經(jīng)典公式成為他墓碑上的全部?jī)?nèi)容

關(guān)于阿貝光學(xué)衍射極限還有兩點(diǎn)值得一提。一是該衍射極限對(duì)分辨率的限制也適用于其他基于物質(zhì)波成像的技術(shù)，從X射線到超聲成像。像X射線和電子顯微鏡的成像波長(zhǎng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于可見光的波長(zhǎng)，因此有非常高的空間分辨率。但可惜這兩個(gè)技術(shù)目前在活體成像方面還有很多困難，另外也不容易像熒光顯微鏡一樣對(duì)目的分子實(shí)現(xiàn)特異成像和觀察。另外一點(diǎn)是這個(gè)200nm的分辨率極限正好對(duì)生物學(xué)研究有很大的制約。首先，很多亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞器的尺度都是幾百納米到幾微米，而最常用的模式生物之一大腸桿菌也就是2微米長(zhǎng)、0.5微米粗。在這些情況下，200nm的分辨率極限制約了我們對(duì)于細(xì)節(jié)的觀察。另外，細(xì)胞本身是高度擁擠的，即使目的分子的細(xì)胞內(nèi)濃度只有1μmol/L，在光學(xué)衍射極限的200nm見方的立方體中也有5個(gè)目的分子，而衍射極限的存在卻使我們無(wú)從知道這個(gè)體積內(nèi)的具體分子數(shù)目，也無(wú)法區(qū)分它們。因此，生物學(xué)研究迫切地需要“突破”衍射極限的超高分辨率顯微成像技術(shù)。

2 “突破”光學(xué)顯微成像的衍射極限

實(shí)際上，衍射極限是一種遠(yuǎn)場(chǎng)(far-field)效應(yīng)，在近場(chǎng)(near-field)條件下無(wú)效。因此早期的一些嘗試突破光學(xué)衍射極限的努力都是基于近場(chǎng)光學(xué)成像的。像這次諾貝爾獎(jiǎng)得主Eric Betzig就早在1993年發(fā)展了掃描近場(chǎng)光學(xué)顯微鏡，首次實(shí)現(xiàn)了室溫下的單分子超分辨率成像［2］。然而，近場(chǎng)光學(xué)顯微鏡無(wú)法用于細(xì)胞內(nèi)部的成像，因此在生物領(lǐng)域的應(yīng)用一直沒(méi)有發(fā)展起來(lái)。后期的各種“突破”光學(xué)衍射極限的努力都是在遠(yuǎn)場(chǎng)條件下發(fā)展起來(lái)的。

超高分辨率顯微成像一般指在遠(yuǎn)場(chǎng)條件下基于熒光的、“突破”衍射極限的光學(xué)顯微成像技術(shù)。熒光是物質(zhì)吸收光照后發(fā)出的一類光。物質(zhì)分子中的電子分布在不同的能級(jí)上。當(dāng)一束光打到分子，分子具有一定的概率吸收光子，同時(shí)其處在基態(tài)的電子會(huì)躍遷到更高能量的激發(fā)態(tài)能級(jí)。處在激發(fā)態(tài)的電子有多種途徑回到基態(tài)，其中一條途徑就是發(fā)出一個(gè)光子(熒光)，釋放能量回到基態(tài)。發(fā)射光子的能量小于被吸收的光子，因此熒光的波長(zhǎng)比激發(fā)光的波長(zhǎng)要長(zhǎng)。熒光顯微鏡利用了熒光發(fā)射光波長(zhǎng)比吸收光波長(zhǎng)較長(zhǎng)這一重要原理，通過(guò)光路設(shè)計(jì)，分開激發(fā)光和發(fā)射光，大幅降低了成像的背景。結(jié)合靈敏的檢測(cè)器件，在優(yōu)化條件下，熒光顯微鏡還可以檢測(cè)單個(gè)熒光分子發(fā)出的極其微弱的熒光，成為單分子成像的最佳選擇，其發(fā)展也奠定了這次諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的半壁江山。除了低背景和高靈敏度，熒光顯微鏡還通過(guò)對(duì)特定分子進(jìn)行標(biāo)記，具備很高的特異性。這一系列特點(diǎn)使得熒光顯微鏡成為生物學(xué)研究中最常用的一種光學(xué)顯微鏡。

超高分辨率熒光顯微技術(shù)通過(guò)應(yīng)用一系列物理原理、化學(xué)機(jī)制和算法“突破”了光學(xué)衍射極限，把光學(xué)顯微鏡的分辨率提高了幾十倍，使我們能以前所未有的視角觀察生物微觀世界。目前的超高分辨率熒光顯微技術(shù)大體可分為兩類，一類通過(guò)調(diào)制照明光斑縮小系統(tǒng)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)超分辨成像，主要貢獻(xiàn)者包括這次諾貝爾獎(jiǎng)得主Stefan Hell以及Mats Gustafsson;另一類則是基于單分子定位的超分辨技術(shù)，主要貢獻(xiàn)者包括這次諾貝爾獎(jiǎng)得主Eric Betzig、W.E.Moerner以及哈佛大學(xué)莊小威教授和Samuel Hess。

2.1 基于點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)調(diào)制的超分辨技術(shù)

此次獲獎(jiǎng)的德國(guó)科學(xué)家Stefan Hell現(xiàn)為德國(guó)哥廷根大學(xué)教授和德國(guó)馬克斯·普朗克生物物理化學(xué)研究所所長(zhǎng)。他在1994年還在做博士后的時(shí)候就最先提出了受激發(fā)射損耗的方法(stimulated emission depletion，簡(jiǎn)稱STED)來(lái)打破光學(xué)衍射極限［3］。其原理非常樸素但卻十分巧妙。前面提到由于衍射極限的存在，光束聚焦的光斑尺寸不能無(wú)窮小，而是限定為光的波長(zhǎng)的一半，這對(duì)應(yīng)了熒光顯微鏡中聚焦激光光斑的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)。理論上，如果能縮小激光光斑就可以實(shí)現(xiàn)超分辨成像。Hell的基本想法是在激發(fā)光斑點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)周圍套上一個(gè)環(huán)形點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)，以“擦除”激發(fā)光斑的外圍，從而使得激發(fā)光斑“變小”(圖4)。在這里，Hell利用了產(chǎn)生激光的受激輻射原理，用位相板產(chǎn)生環(huán)狀的激光光斑并套在激發(fā)光斑外。這個(gè)環(huán)狀光的波長(zhǎng)匹配激發(fā)態(tài)到基態(tài)的能量差，同時(shí)功率夠高，使得其區(qū)域內(nèi)處在激發(fā)態(tài)的熒光分子在環(huán)狀光照射下會(huì)發(fā)生整齊劃一的飽和受激輻射。因?yàn)槭芗ぽ椛洳ㄩL(zhǎng)與自發(fā)輻射(熒光)不同，所以環(huán)狀光覆蓋的受激輻射可以被擋住，而環(huán)內(nèi)的自發(fā)輻射則是我們需要的熒光。由于環(huán)狀光的孔徑理論上可以通過(guò)增加激光強(qiáng)度無(wú)限縮小，這樣就可以獲得一個(gè)小于衍射極限的熒光激發(fā)點(diǎn)。這樣，Hell的方法就更改了Abbe的衍射極限公式:

式中Ⅰs是飽和受激輻射的激光強(qiáng)度，Ⅰ是環(huán)狀光的強(qiáng)度。可見，隨著Ⅰ的增加，STED技術(shù)的分辨率可以無(wú)窮小。

圖4 德國(guó)科學(xué)家Stefan Hell發(fā)明的受激發(fā)射損耗的方法

這個(gè)巧妙的思想在技術(shù)實(shí)現(xiàn)上當(dāng)時(shí)是非常困難的。Hell經(jīng)過(guò)多年堅(jiān)韌的努力，終于在2000年實(shí)現(xiàn)了他在1994年提出的這個(gè)想法［4］。他用一束激光激發(fā)熒光分子發(fā)光，再用另一束環(huán)狀激光消除激發(fā)光周邊的熒光，通過(guò)二維點(diǎn)掃描實(shí)現(xiàn)了超高分辨率成像，將光學(xué)顯微鏡分辨率提高了近10倍。然而由于熒光分子一般飽和光強(qiáng)較高，可達(dá)100MW/cm2，因此環(huán)狀光需要極高的功率，大大加重了樣品的光損傷和光漂白，制約了STED技術(shù)在生物中的應(yīng)用。從2000年開始，Hell的團(tuán)隊(duì)不斷改進(jìn)STED技術(shù)，包括通過(guò)相似原理發(fā)明了基態(tài)損耗(ground state depletion，GSD)［5］等一系列超高分辨率顯微技術(shù)，使其更加適用于生物研究。后期，Hell團(tuán)隊(duì)將STED的思想進(jìn)一步延展，將這種利用飽和激發(fā)壓縮激發(fā)光點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)并驅(qū)動(dòng)熒光分子熒光態(tài)(亮態(tài))和非熒光態(tài)(暗態(tài))之間的轉(zhuǎn)化的方法統(tǒng)稱為可逆飽和線性熒光躍遷(reversible saturable optical linear fluorescence transitions，簡(jiǎn)稱RESOLFT)，其分辨率統(tǒng)一由式(2)描述［6］。值得一提的是，Hell早期發(fā)明的STED和GSD等技術(shù)是基于熒光分子電子能級(jí)的躍遷，這些狀態(tài)的躍遷及弛豫速率都非?？?，因此需要很高的飽和光強(qiáng)來(lái)實(shí)現(xiàn)飽和受激輻射。為了進(jìn)一步提高RESOLFT技術(shù)的生物兼容性，Hell團(tuán)隊(duì)利用熒光分子的可逆構(gòu)像變化等化學(xué)過(guò)程對(duì)應(yīng)的可逆光開關(guān)(reversible photoswitch)來(lái)實(shí)現(xiàn)超高分辨率成像。基于分子化學(xué)過(guò)程的亮態(tài)和暗態(tài)間的轉(zhuǎn)化所需的飽和光強(qiáng)很小，大大降低了光損傷和光漂白。這類方法的不足之處在于其每個(gè)點(diǎn)的成像時(shí)間較長(zhǎng)，所以通過(guò)點(diǎn)掃描成像將耗費(fèi)太多時(shí)間。為此，Hell團(tuán)隊(duì)在2013年發(fā)明了一種平行RESOLFT方法(parallelized RESOLFT approach)，將十萬(wàn)個(gè)STED光斑排成一個(gè)矩陣來(lái)成像，用rsEGFP熒光蛋白在活細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)了約1s時(shí)間分辨率的超高分辨率成像［7］。Stefan Hell 20年來(lái)的一系列工作為超分辨率熒光顯微成像技術(shù)的發(fā)展做出了巨大貢獻(xiàn)。

在這個(gè)方面值得一書的還有美國(guó)科學(xué)家Mats Gustafsson，他是光學(xué)成像領(lǐng)域公認(rèn)的天才。Gustafsson在2000年發(fā)明了基于結(jié)構(gòu)照明原理的超高分辨率技術(shù)［8］。這個(gè)技術(shù)基于兩個(gè)高空間頻率的圖案重疊可以形成低頻率莫爾條紋的原理，通過(guò)解析低頻莫爾條紋實(shí)現(xiàn)超高分辨率成像(圖5)。這個(gè)技術(shù)使用起來(lái)非常簡(jiǎn)單，對(duì)樣品制備也沒(méi)有任何特殊要求，因此非常適于細(xì)胞研究，但可惜分辨率只能提高一倍。在此基礎(chǔ)上，Gustafsson在2005年發(fā)明了飽和SIM，與RESOLFT原理相似，利用熒光飽和實(shí)現(xiàn)更高的分辨率，其本質(zhì)也是點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的縮?。?］?？上ustafsson于2011年51歲時(shí)因癌癥英年早逝，無(wú)緣分享這次的諾貝爾獎(jiǎng)。

圖5 美國(guó)科學(xué)家Mats Gustafsson基于莫爾條紋原理發(fā)明的結(jié)構(gòu)照明超高分辨率技術(shù)

2.2 基于單分子定位的超分辨技術(shù)

另一大類超分辨熒光顯微成像技術(shù)的發(fā)明是基于單個(gè)熒光分子的定位。雖然Abbe衍射極限指出無(wú)法區(qū)分相距約200nm的兩個(gè)熒光分子，但是通過(guò)提取單個(gè)熒光分子的愛里斑信息卻可以實(shí)現(xiàn)對(duì)這個(gè)熒光分子的精確定位。對(duì)單個(gè)熒光分子的成像嘗試最早可以追溯到1976年，T.Hirschfeld使用基于全內(nèi)反射式的近場(chǎng)照明方式實(shí)現(xiàn)了對(duì)單個(gè)蛋白抗體分子的熒光觀察。但他當(dāng)時(shí)在抗體上標(biāo)記了數(shù)十個(gè)熒光基團(tuán)，因此并非對(duì)單個(gè)熒光分子的成像［10］。這次獲獎(jiǎng)的美國(guó)斯坦福大學(xué)教授W.E.Moerner是單分子熒光技術(shù)的先驅(qū)人物。他于1989年在超低溫下首次實(shí)現(xiàn)了單個(gè)分子的吸收光譜測(cè)量［11］。這一開創(chuàng)性研究直接激發(fā)了后續(xù)的一系列單分子熒光方面的突破性工作。1990年，M.Orrit在低溫下實(shí)現(xiàn)了對(duì)單個(gè)熒光分子的熒光測(cè)量［12］;同年，R.A.Keller等人則利用共聚焦顯微鏡和脈沖激發(fā)等方法在室溫下實(shí)現(xiàn)了對(duì)溶液中單個(gè)熒光分子的檢測(cè)［13-14］。此次諾貝爾獎(jiǎng)得主Eric Betzig則在1993年利用近場(chǎng)顯微鏡首次實(shí)現(xiàn)了常溫下單個(gè)熒光分子在表面的成像［2］。1994年，R.A.Keller［15］，S.Xie［16］以及S.Nie，D.Chiu和R.Zare等人［17］在單分子檢測(cè)方面接連取得突破;而在1995年，日本Yanagida團(tuán)隊(duì)使用全內(nèi)反射顯微鏡觀察到了熒光標(biāo)記的ATP分子和單個(gè)肌球馬達(dá)蛋白分子的相互作用，開創(chuàng)了單分子技術(shù)在生物系統(tǒng)中的應(yīng)用［18］。利用單分子定位研究生物學(xué)問(wèn)題最有影響力的一個(gè)工作是2003年Yildiz等人使用全內(nèi)反射單分子熒光顯微鏡追蹤C(jī)y3熒光標(biāo)記的單個(gè)肌球馬達(dá)蛋白分子沿著肌動(dòng)蛋白微絲的行走。在這個(gè)工作中，單個(gè)肌球蛋白分子的位置被精確定位，精度達(dá)幾納米，因此可以觀察到肌球馬達(dá)蛋白分子約37納米的步長(zhǎng)，并推斷出其行走方式是像人一樣兩個(gè)腿交替邁進(jìn)［19］。這一高精度單分子熒光定位方法被稱為fluorescence imaging with 1-nm accuracy，簡(jiǎn)稱FIONA。其原理是基于2002年Webb等人的工作［20］。他們指出，單個(gè)熒光分子的愛里斑雖然有幾百納米寬，但其光強(qiáng)度的分布卻像山峰一樣，峰尖對(duì)應(yīng)熒光分子的位置。這個(gè)類似于山峰的光子分布可以用一個(gè)二維高斯函數(shù)來(lái)擬合，其中心即為熒光分子的物理位置，而定位中心的誤差則由下式給出:

式中σμi代表中心位置μ在x和y方向上的定位誤差，i指代x和y方向;Si為高斯擬合在x和y方向上的標(biāo)準(zhǔn)偏差;N為檢測(cè)到的光子數(shù);a是探測(cè)器有效像素尺寸;而b為背景噪音。如果忽略像素尺寸和背景噪音的影響，可以看出單分子的定位精度與光子數(shù)的平方根成反比。與式(1)結(jié)合，則基于單分子定位的理論成像分辨率為:

在通常情況下，一個(gè)熒光蛋白分子可檢測(cè)到的光子數(shù)約為幾百個(gè)，而一個(gè)熒光染料分子為幾千個(gè)。通過(guò)擬合找到峰尖，精確度高達(dá)幾納米，遠(yuǎn)超衍射極限。因此通過(guò)單分子定位的原理可以將熒光成像的分辨率提高幾十倍。即便如此，還需要同時(shí)考慮的是解析一個(gè)結(jié)構(gòu)時(shí)的分辨率也是由采樣密度(頻率)決定的，即所謂Nyquist-Shannon采樣定律。該定律指出，為了解析一個(gè)空間頻率為f的信號(hào)，檢測(cè)的空間采樣頻率至少應(yīng)為2f。換句話說(shuō)，在超分辨熒光顯微鏡成像中，樣品的標(biāo)記密度至少應(yīng)為空間分辨率的2倍［21］，如式(5)所示:

式中dsampling為由采樣頻率決定的空間分辨率，ρ為熒光標(biāo)記密度，dim為空間維度。因此，單分子定位的有效空間分辨率為:

式(4)的分辨率是基于每個(gè)衍射極限體積內(nèi)只有一個(gè)熒光分子，如果有兩個(gè)分子并且同時(shí)發(fā)光則還是無(wú)法分辨，也無(wú)法實(shí)現(xiàn)單分子定位。這就要求樣品的標(biāo)記密度很低，然而這樣會(huì)導(dǎo)致式(5)中的采樣分辨率大大下降。

可見，將單分子顯微技術(shù)的高精度定位轉(zhuǎn)化為高分辨率的關(guān)鍵在于如何在一個(gè)衍射極限體積中區(qū)分多個(gè)熒光分子。最早在概念上提出解決方案的是此次諾貝爾獎(jiǎng)得主Eric Betzig，他在發(fā)表于1995年的一篇文章中指出可以通過(guò)光譜來(lái)區(qū)分密集堆積的熒光分子并重構(gòu)出一幅超高分辨率圖像［22］。由于可用的熒光分子種類及其光譜有限，且標(biāo)記方法繁瑣，該方法的實(shí)現(xiàn)相當(dāng)困難。盡管如此，這篇文章為之后的一系列工作打開了思路，使人們意識(shí)到可以利用熒光分子的各種過(guò)程和性質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)超高分辨率成像，其中包括熒光分子的光漂白、閃爍、結(jié)合-解離、以及光控轉(zhuǎn)化等。在1997年，W.E.Moerner與憑借綠色熒光蛋白獲得2008年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的R.Tsien合作發(fā)現(xiàn)了綠色熒光蛋白GFP的光轉(zhuǎn)化效應(yīng)［23］。他們發(fā)現(xiàn)GFP在488nm的光照下發(fā)生閃爍并進(jìn)入暗態(tài)。令人吃驚的是，這個(gè)暗態(tài)并非光漂白狀態(tài)，而是可以被405nm的激光激活并在488nm激光激發(fā)下重新發(fā)熒光。這是第一次發(fā)現(xiàn)可以用光來(lái)控制一個(gè)熒光分子的發(fā)光狀態(tài)，為基于單分子定位的超分辨技術(shù)打開了一扇大門?？上У氖?，這扇已經(jīng)開啟的大門并未受到過(guò)多關(guān)注，直到2002年J.Lippincott-Swartz等人對(duì)GFP進(jìn)行改造取得了性質(zhì)非常好的光激活熒光蛋白［24］。此時(shí)，Eric Betzig剛剛從工業(yè)界返回到學(xué)術(shù)界，他意識(shí)到這種光控?zé)晒獾鞍卓梢院苋菀椎貙?shí)現(xiàn)他在約10年前提出的想法。首先通過(guò)融合蛋白實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的高密度熒光標(biāo)記，之后通過(guò)控制激光強(qiáng)度，使用非常微弱的405nm激光激活很少數(shù)目的熒光蛋白。因?yàn)檫@個(gè)激活過(guò)程是隨機(jī)的，所以激活的熒光蛋白分布稀疏而離散，就可以通過(guò)式(3)進(jìn)行精確的單分子定位。當(dāng)之前激活的熒光蛋白被488nm激光漂白后，405nm激光將會(huì)激活另一批熒光蛋白進(jìn)行單分子定位。如此多次反復(fù)，就可以將高密度的熒光分子一一定位，同時(shí)滿足單分子高精度定位和Nyquist-Shannon采樣定律，把多張圖片疊加形成一幅超高分辨率圖像(圖6)。意識(shí)到這一點(diǎn)后，Betzig開始和Lippincott-Schwarz及H.F.Hess合作以實(shí)現(xiàn)他的想法。

圖6 基于單分子定位的超高分辨率成像技術(shù)

2006年是超高分辨率熒光顯微技術(shù)發(fā)展的重要一年。在這一年，Betzig和Lippincott-Schwarz以及H.F.Hess合作發(fā)明了基于熒光蛋白單分子定位原理的PALM(photoactivated localization microscopy)技術(shù)［25］;幾乎在同時(shí)，哈佛大學(xué)莊小威研究組發(fā)表了基于熒光染料單分子定位的STORM(stochastic optical reconstruction microscopy)技術(shù)［26］;隨后，Samuel Hess研究組也獨(dú)立發(fā)明了FPALM(fluorescence photoactivated localization microscopy)技術(shù)［27］。它們?cè)谠砩隙际腔跓晒夥肿拥墓廪D(zhuǎn)化能力和單分子定位(圖6)。這種“以時(shí)間換空間”的思路非常巧妙，把熒光成像的分辨率一下子提高了20倍左右。加之這些技術(shù)實(shí)現(xiàn)比較容易，因此大大推動(dòng)了超分辨熒光顯微鏡技術(shù)的成熟和在生物學(xué)研究中的廣泛應(yīng)用。莊小威教授本科畢業(yè)于中科大少年班，34歲獲得哈佛大學(xué)的正教授職位，40歲當(dāng)選美國(guó)科學(xué)院院士。作為STORM技術(shù)的發(fā)明人，莊小威教授一直領(lǐng)導(dǎo)并推進(jìn)著超高分辨率顯微技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，包括在率先實(shí)現(xiàn)單分子超分辨技術(shù)的先后實(shí)現(xiàn)了多色、三維和活細(xì)胞高速成像以及在各種生物問(wèn)題中的應(yīng)用;她領(lǐng)導(dǎo)的團(tuán)隊(duì)是近8年來(lái)這個(gè)領(lǐng)域最活躍的研究團(tuán)隊(duì)。

除了STORM/(F)PALM技術(shù)，還有幾種基于單分子定位或熒光分子閃爍的超高分辨率熒光顯微技術(shù)，包括PAINT(points accumulation for imaging in nanoscale topography)［28］，SOFI(super-resolution optical fluctuation imaging)［29］和3B(bayesian analysis of bleaching and blinking)［30］。這些技術(shù)的出現(xiàn)進(jìn)一步豐富了超分辨技術(shù)的選擇和應(yīng)用范圍。

3 總結(jié)與展望

超高分辨率熒光顯微成像作為一類很新的技術(shù)，突破了光學(xué)成像中的衍射極限，把傳統(tǒng)成像分辨率提高了10～20倍，達(dá)到了幾十納米，把我們從顯“微”鏡時(shí)代帶入到顯“納”鏡時(shí)代。對(duì)生物學(xué)家而言，好比一個(gè)近視眼的人突然戴上了合適的眼鏡，從而可以用前所未有的視角觀察奇妙的生物微觀世界，揭示前所未見的生物微觀結(jié)構(gòu)和現(xiàn)象。這些超分辨技術(shù)在過(guò)去的七八年間不斷進(jìn)步，同時(shí)也已經(jīng)在生物學(xué)研究中廣泛應(yīng)用，包括細(xì)胞膜蛋白分布、細(xì)胞骨架、線粒體、染色質(zhì)、神經(jīng)元突觸以及原核生物的研究等。超高分辨率技術(shù)一出現(xiàn)就引起廣泛關(guān)注，先是在2006年被世界著名期刊Science評(píng)為年度10大技術(shù)突破，接著被生物醫(yī)學(xué)方法學(xué)最好的期刊Nature Methods評(píng)為2008年年度方法。在2014年10月的Nature Methods10周年特刊評(píng)出的10年10大技術(shù)中，超高分辨率熒光顯微成像和單分子技術(shù)都出現(xiàn)在榜中，并幾乎在同時(shí)獲得2014年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

展望未來(lái)，超高分辨率顯微技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)應(yīng)該是更高、更快、更深(即更高的空間分辨率、更快的時(shí)間分辨率以及更深的成像深度)，這與生物醫(yī)學(xué)成像越來(lái)越多地應(yīng)用于活體研究的趨勢(shì)需求是一致的。與這些趨勢(shì)相對(duì)應(yīng)并值得關(guān)注的幾個(gè)方面可以大致歸納如下。

首先是通過(guò)進(jìn)一步的物理成像、化學(xué)修飾原理創(chuàng)新，發(fā)展新型的超分辨技術(shù)和標(biāo)記技術(shù)。目前的各種超分辨技術(shù)時(shí)間分辨率都不夠，成像深度更是不能滿足在體成像的需求。其中，提高超分辨技術(shù)時(shí)間分辨率，需要結(jié)合新型成像器件，例如更快的掃描元件，更靈敏的檢測(cè)元件等;實(shí)現(xiàn)更深的成像深度和解決在體成像需求，還需考慮到組織對(duì)光子的散射作用，結(jié)合自適應(yīng)光學(xué)和組織透明化(CLARITY)技術(shù)是解決這一問(wèn)題的關(guān)鍵之一。

第二是進(jìn)一步發(fā)展和優(yōu)化熒光探針，比如提高探針的亮度、光穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)換速率以及發(fā)射波長(zhǎng)等。為解決現(xiàn)有探針的信噪比差、光漂白嚴(yán)重等缺陷，開發(fā)新型高亮度、高穩(wěn)定的熒光探針成為推動(dòng)超分辨技術(shù)的保證。例如上轉(zhuǎn)換納米材料，熒光鉆石，石墨烯量子點(diǎn)等無(wú)機(jī)染料。此外，結(jié)合現(xiàn)有探針和超分辨技術(shù)，發(fā)展新型超分辨標(biāo)記技術(shù)，如聯(lián)合標(biāo)記、特異性活細(xì)胞標(biāo)記染料、量子點(diǎn)等。

第三是注重模態(tài)融合。生命體組成跨越了很大的空間尺度，而不同尺度下的生命功能、結(jié)構(gòu)和過(guò)程都緊密聯(lián)系和互相影響。沒(méi)有哪種技術(shù)能兼顧時(shí)間分辨率、空間分辨率、空間尺度和功能成像，因此多模態(tài)融合是一個(gè)必然趨勢(shì)。對(duì)于超分辨技術(shù)而言，至少有3種值得融合的技術(shù)，并且都已經(jīng)出現(xiàn)了一些研究成果。一種是與雙光子熒光顯微鏡結(jié)合，雙光子熒光顯微鏡基于非線性效應(yīng)，具有成像深度深、熒光背景低的優(yōu)點(diǎn);一種是與電子顯微鏡結(jié)合，即光電融合顯微技術(shù)CLEM(correlative light＆electron microscope)。CLEM結(jié)合了電鏡的高分辨率和光學(xué)顯微鏡的分子特異性，是研究結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系的利器，因此成為目前國(guó)際上顯微成像技術(shù)的研究熱點(diǎn)和重要發(fā)展方向。中科院生物物理所徐濤研究員在基金委重大儀器專項(xiàng)的支持下，從2011年已展開光電融合顯微技術(shù)的研發(fā)并且取得了世界領(lǐng)先的成果。再一種是與片層光結(jié)合。片層光顯微成像技術(shù)是一個(gè)古老卻又重新煥發(fā)生機(jī)的成像技術(shù)，其片層光照明方式一方面大大降低背景熒光信號(hào)，一方面比常規(guī)雙光子、共聚焦顯微鏡有更高的時(shí)間分辨率，具有光毒性小、信噪比高、成像速度快等一系列優(yōu)點(diǎn)，是研究小模式生物的利器，也因此被評(píng)為Nature Methods的2014年年度方法。在基金委重大儀器專項(xiàng)支持下，北京大學(xué)陳良怡和孫育杰研究組合作，于近期發(fā)明了目前世界上性能最卓越的雙光子層狀光顯微鏡并已展開相關(guān)應(yīng)用［31］，而與超分辨技術(shù)的結(jié)合將會(huì)成為在體超分辨成像的重要工具。

第四則是注重發(fā)展數(shù)據(jù)處理和圖像分析算法，迎接大數(shù)據(jù)時(shí)代的到來(lái)。隨著信息技術(shù)的發(fā)展，大數(shù)據(jù)時(shí)代翩然而至，生物醫(yī)學(xué)成像也不例外。一方面，對(duì)活體動(dòng)態(tài)觀察的需求導(dǎo)致了大數(shù)據(jù)影像資料;另一方面，對(duì)于樣品三維高分辨率成像的需求也導(dǎo)致大數(shù)據(jù)。面對(duì)海量數(shù)據(jù)，我們需要發(fā)展更加高效的圖像處理軟件和算法，這將是未來(lái)超高分辨率動(dòng)態(tài)成像的一個(gè)重要挑戰(zhàn)。

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