早發(fā)型重度子癇前期分娩前后CD28/CTLA-4的相關(guān)研究

張娜娜，呂英璞，楊石芳，陳艷珺，張文真，李從偉

妊娠期高血壓疾病是產(chǎn)科常見疾患，發(fā)病率約為5%～8%，造成的孕產(chǎn)婦死亡約占妊娠相關(guān)死亡總數(shù)的10%～16%[1]，子癇前期是其中最常見的一種類型，常并發(fā)心、腦、肝、腎等全身臟器的損害，是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦及圍生兒病死率升高的主要原因。至今其發(fā)病原因尚未完全闡明，本研究用流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定早發(fā)型子癇前期患者分娩前后協(xié)同刺激分子白細(xì)胞分化抗原28（CD28）、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4 （cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4，CTLA-4）、CD28/CTLA-4表達(dá)水平的變化，進(jìn)一步探討子癇前期發(fā)病的病因。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象來(lái)源 選取2011年2月—2014年2月在石家莊市第三醫(yī)院和石家莊市第一醫(yī)院產(chǎn)科診治的早發(fā)型重度子癇前期患者30例：平均（29.63±4.06）歲，平均妊娠時(shí)間（229.40±5.82）d，平均動(dòng)脈壓（131.89±8.67）mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），新生兒體質(zhì)量（2311.67±349.55）g?；颊呔鶠槌醍a(chǎn)婦，單胎，均無(wú)近期感染證據(jù)，血糖正常，無(wú)慢性高血壓病史，無(wú)反復(fù)流產(chǎn)史，未經(jīng)輔助生殖技術(shù)治療，無(wú)免疫性疾病，未經(jīng)免疫藥物治療。早發(fā)型重度子癇前期的診斷標(biāo)準(zhǔn)按照茍文麗主編《婦產(chǎn)科學(xué)》第8版。分娩前：指入院時(shí)、治療前；分娩后：分娩后48 h內(nèi)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑 抗人PE-CY5-CD3單克隆抗體、抗人PECY5-CD4單克隆抗體、抗人PE-CY5-CD8單克隆抗體、抗人異硫氰酸熒光素（FITC）-CD28單克隆抗體、抗人PE-CTLA-4單克隆抗體、抗鼠PE-IgG、抗鼠FITC-Ig均購(gòu)自美國(guó)Becton-Dickinson公司。

1.2.2 血標(biāo)本采集 抽取妊娠28～34周子癇前期患者治療前及分娩后48 h內(nèi)的肘正中靜脈血，分離淋巴細(xì)胞[2]，①取肝素抗凝血以磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋，離心；②放置于淋巴細(xì)胞分離液上，使細(xì)胞懸液與分離液體積比為2∶1，離心30 min；③用吸管吸出單個(gè)核細(xì)胞，PBS沖洗；④將懸浮附壁的單個(gè)核細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸液，Hank′s液沖洗。

1.2.3 流式細(xì)胞法檢測(cè) 調(diào)整分離得到的淋巴細(xì)胞濃度為1×106/mL，加入抗人單抗 PE-CY-CD3，PE-CY-CD4，PE-CYCD8，加入抗人單抗CD28-FITC，抗人單抗CTLA-4-PE及小鼠IgG同型陰性對(duì)照 12 h內(nèi)送流式檢驗(yàn) CD3、CD4、CD8、CD28和CTLA-4的比率。

1.2.4 肝、腎功能檢測(cè) 抽取患者空腹肘正中靜脈血2 mL送生化實(shí)驗(yàn)室完成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。檢驗(yàn)結(jié)果正態(tài)分布以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)以中位數(shù)（百分位數(shù)）[M（P25，P75）]表示，進(jìn)行Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，相關(guān)性檢驗(yàn)采取Pearson相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 分娩前后患者血壓及肝腎功能比較 分娩后患者血壓、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、血肌酐、尿素氮和尿酸均顯著下降，與分娩前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），24 h尿蛋白比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表1。

表1 分娩前后患者血壓及肝、腎功能各指標(biāo)水平（n=30±s）

表1 分娩前后患者血壓及肝、腎功能各指標(biāo)水平（n=30±s）

注：* 用 M（P25，P75）表示。

AST（U/L）分娩前 165.67±10.72115.17±9.42131.89±8.6733.10±7.6132.60±9.28分娩后 144.33±7.64 98.53±8.72113.80±7.6727.50±8.0728.27±8.17 t或W 10.101 9.044 10.331 6.414 4.640 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000組別 收縮壓（mmHg）舒張壓（mmHg）平均動(dòng)脈壓（mmHg）ALT（U/L）24 h尿蛋白*（g）分娩前 107.77±27.14 6.67±1.64 382.57±39.864.34（3.36，6.80）分娩后 95.93±21.80 5.83±1.55 331.77±47.883.92（2.93，5.12）t或W 5.702 6.478 7.842 810.500 P 0.000 0.000 0.000 0.122組別 肌酐（μmol/L）尿素氮（mmol/L）尿酸（μmol/L）

2.2 分娩前后患者T細(xì)胞亞群比較 早發(fā)型重度子癇前期患者分娩前CD3+、CD8+比率低于分娩后，CD4+比率高于分娩后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見表 2。

表2 分娩前后患者T細(xì)胞亞群的水平 （n=30，%±s）

表2 分娩前后患者T細(xì)胞亞群的水平 （n=30，%±s）

檢測(cè)時(shí)間 CD3+ CD4+ CD8+分娩前 66.56±8.13 46.85±3.23 23.94±5.61分娩后 71.38±7.67 44.02±5.80 27.26±4.69 t－4.450 2.981 －2.676 P 0.000 0.006 0.001

2.3 分娩前后患者CD28+、CTLA-4+細(xì)胞百分比及CD28+/CTLA-4+情況比較 早發(fā)型重度子癇前期分娩前 CD3+CD4+CTLA-4+、CD3+CD8+CTLA-4+高于分娩后，CD3+CD4+CD28+/CD3+CD4+CTLA-4+、CD3+CD8+CD28+/CD3+CD8+CTLA-4+低于分娩后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表3。CD3+CD4+CD28+/CD3+CD4+CTLA-4+、CD3+CD8+CD28+/CD3+CD8+CTLA-4+兩者無(wú)直線相關(guān)性（r=－0.037，P=0.844）。

表3 分娩前后患者CD28、CTLA-4細(xì)胞百分比及CD28/CTLA-4 情況比較 （n=30，%±s）

表3 分娩前后患者CD28、CTLA-4細(xì)胞百分比及CD28/CTLA-4 情況比較 （n=30，%±s）

注：* 用 M（P25，P75）表示。

CD3+CD4+CD28+CD3+CD8+CD28+CD3+CD4+CTLA-4+*分娩前 46.64±6.74 10.95±2.09 0.45（0.33，0.78）分娩后 49.38±9.90 11.72±2.47 0.30（0.20，0.51）t或Z －1.347 －1.627 749.500 P 0.188 0.115 0.014檢測(cè)時(shí)間檢測(cè)時(shí)間CD3+CD8+CD28+/CTLA-4+分娩前 2.60±0.64 109.21（57.19，167.08） 4.52±1.67分娩后 2.16±0.85 163.74（97.53，209.48） 6.07±1.94 t或 Z 2.447 -775.000 －3.063 P 0.021 0.038 0.005 CD3+CD8+CTLA-4+CD3+CD4+CD28+/CTLA-4+*

3 討論

3.1 CD28、CTLA-4對(duì)T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用 正常生理妊娠類似于同種異體移植，作為同種移植物的胚胎在母體內(nèi)存活直至分娩，實(shí)際上反映母體對(duì)胚胎抗原的免疫耐受，這種免疫調(diào)節(jié)作用不僅發(fā)生在母-胎界面局部，而且也發(fā)生于母體外周。在母-胎免疫微環(huán)境中，有多種細(xì)胞和細(xì)胞因子參與這種免疫調(diào)節(jié)作用[1-3]。

CTLA-4、CD28都是免疫球蛋白超家族糖蛋白，結(jié)構(gòu)上約有31%同源，特別在胞內(nèi)區(qū)[4]，具有相同的配體B7，B7主要表達(dá)于B細(xì)胞表面，是一種重要的B細(xì)胞激活抗原。B7抗原主要包括3類分子：B7-1、B7-2及 B7-3[5]。B7-1、B7-2存在于活化的T 細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突細(xì)胞及γ干擾素（IFN-γ）活化的單核細(xì)胞中。另外，B7-2的表達(dá)早于B7-1，在T細(xì)胞激活初期，由B7-2提供T細(xì)胞活化所需要的共刺激信號(hào)，B7-1在T細(xì)胞克隆增殖中起作用[6]。CTLA-4、CD28都能與B7-1、B7-2結(jié)合，但CD28與之結(jié)合的親合力較CTLA-4低20倍。而且CD28與B7結(jié)合提供協(xié)同刺激信號(hào)，以激活T細(xì)胞；而CTLA-4與B7結(jié)合抑制T細(xì)胞活化，使T細(xì)胞無(wú)能。如果輔助性T細(xì)胞（Th細(xì)胞）識(shí)別低表達(dá)B7分子的抗原提呈細(xì)胞（APC），CTLA-4則以更高親合力結(jié)合B7，從而導(dǎo)致T細(xì)胞不能正?；罨痆7]，進(jìn)一步阻斷協(xié)同刺激信號(hào)，有助于實(shí)現(xiàn)母-胎免疫耐受。

3.2 CTLA-4、CD28在子癇前期中的表達(dá) 目前關(guān)于子癇前期的病因?qū)W研究較多，關(guān)于CD28，CTLA-4的研究論著較少，且研究結(jié)果不一。Samsami Dehaghani等[8]報(bào)道，胎盤中CTLA-4 A49G等位基因中的雜合型可能是重度子癇前期發(fā)生的易感基因。Buurma等[9]報(bào)道22個(gè)復(fù)制的基因變異中，與子癇前期有關(guān)的遺傳變異有7個(gè)：血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE），CTLA-4，凝血因子2（F2），凝血因子Ⅴ（FⅤ）兩個(gè)變種RS6025和RS6020，脂蛋白脂酶（LPL）和纖維蛋白溶酶原激活物抑制劑Ⅰ型（SERPINE1）。這些變異體也是心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)因素，顯示子癇前期和心血管疾病有共同的遺傳風(fēng)險(xiǎn)因子。Pendeloski等[10]研究巴西女性 CTLA4（+49 A/G）（rs 231775），CD28（+17T/C）（rs3116496）和誘導(dǎo)共刺激分子（ICOS）（－1564 T/C）（rs 4675378）基因多態(tài)性與子癇前期的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)子癇前期組ICOS（－1564）T等位基因型頻率和基因頻率顯著低于正常妊娠組，而CTLA-4（+49 A/G）和 CD28（+17 T/C）2組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明子癇前期與ICOS基因多態(tài)性相關(guān)聯(lián)，而非CTLA-4或CD28基因多態(tài)性。Toldi等[11]比較20例子癇前期孕婦和20例正常孕婦，發(fā)現(xiàn)吲哚胺2，3雙加氧酶和共刺激分子B7-1，B7-2在子癇前期孕婦中的表達(dá)低于正常妊娠孕婦，而CD3+CD28+，CD3+CD28+CTLA-4+，CD4+CD28+，CD4+CD28+CTLA-4+2 組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（RSA）免疫機(jī)制方面也表現(xiàn)為母胎免疫耐受，與子癇前期有相似之處。有學(xué)者研究正常妊娠組蛻膜組織CTLA-4的表達(dá)高于RSA組，而在外周血中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，認(rèn)為蛻膜組織淋巴細(xì)胞CTLA-4的表達(dá)情況在母胎界面免疫耐受調(diào)控中起重要作用[12]。

本研究發(fā)現(xiàn)早發(fā)型重度子癇前期分娩前CD3+、CD8+均低于分娩后，CD4+高于分娩后，分娩前CD3+CD4+CTLA-4+，CD3+CD8+CTLA-4+高于分娩后，CD3+CD4+CD28+/CD3+CD4+CTLA-4+、CD3+CD8+CD28+/CD3+CD8+CTLA-4+低于分娩后，可能說(shuō)明CTLA-4與重度子癇前期發(fā)生有關(guān)，高表達(dá)的CTLA-4促進(jìn)CD4+T淋巴細(xì)胞高度活化，抑制CD8+T淋巴細(xì)胞，致T淋巴細(xì)胞失衡，子癇前期患者妊娠耐受失衡，發(fā)生不良妊娠結(jié)局。這與王蓮蓮等[13]的研究結(jié)果有相似之處。

分娩前后CD3+CD4+CD28+/CD3+CD4+CTLA-4+與CD3+CD8+CD28+/CD3+CD8+CTLA-4+兩者之間無(wú)直線相關(guān)性，更加支持子癇前期患者體內(nèi)CD4+/CD8+和CD28/CTLA-4+的免疫偏移是同時(shí)存在的，這種免疫耐受的失衡可能是子癇前期發(fā)生的原因之一。目前，關(guān)于CD28/CTLA-4與子癇前期關(guān)系的報(bào)道甚少，結(jié)論不一，仍需大量實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)早發(fā)型子癇前期患者分娩后CTLA-4下降，CD28/CTLA-4升高，可能CTLA-4與CD28/CTLA-4的異常表達(dá)與子癇前期的發(fā)病有關(guān)。因子癇前期發(fā)病的異質(zhì)性、細(xì)胞因子的網(wǎng)絡(luò)性，子癇前期發(fā)病的實(shí)質(zhì)性研究尚需大量大樣本、多層次、多角度的進(jìn)一步研究。

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