夏枯草對(duì)3種腫瘤細(xì)胞抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究

沈亞芬，丁勤霞，宋利斌，朱曙東，沈金根

1.浙江省中醫(yī)院，浙江 杭州 310000；2.桐鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院，浙江 桐鄉(xiāng) 324500

夏枯草對(duì)3種腫瘤細(xì)胞抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究

沈亞芬1，丁勤霞1，宋利斌1，朱曙東1，沈金根2

1.浙江省中醫(yī)院，浙江 杭州 310000；2.桐鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院，浙江 桐鄉(xiāng) 324500

目的：探索夏枯草粗提物對(duì)3種腫瘤細(xì)胞（淋巴瘤細(xì)胞株Jurkat、人肺癌細(xì)胞株A-549、子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株Ishikawa）生長抑制作用，為夏枯草抗癌機(jī)制的深入研究提供實(shí)驗(yàn)參考依據(jù)。方法：以不同濃度的夏枯草粗提物供試液作用于3種腫瘤細(xì)胞，采用MTT法計(jì)算其IC50值，觀察藥物對(duì)3種腫瘤細(xì)胞的抑制作用，同時(shí)設(shè)置空白組、對(duì)照組、陽性對(duì)照組。結(jié)果：夏枯草粗提物對(duì)Jurkat細(xì)胞、A-549細(xì)胞、IShikawa細(xì)胞IC50值分別為59.628 mg/mL、53.917 mg/mL、48.017 mg/mL，且夏枯草對(duì)3種腫瘤細(xì)胞的抑制率在一定范圍內(nèi)隨藥物濃度增加而加強(qiáng)。結(jié)論：夏枯草對(duì)Jurkat細(xì)胞、A-549細(xì)胞、IShikawa細(xì)胞的增殖具有一定的抑制作用，對(duì)抗癌機(jī)制的研究以及臨床抗癌藥物的篩選具有一定的參考價(jià)值。

夏枯草；腫瘤；細(xì)胞株；MTT法；體外增殖

夏枯草為唇形科多年生草本植物夏枯草(Prunella vulgaris L)的干燥成熟果穗[1]，性寒，味微苦、甘、辛，主入肝經(jīng)、膽經(jīng)，具有清火明目、散結(jié)消腫、清熱活血、祛痰止咳的功效[2～4]?，F(xiàn)代藥理研究表明，夏枯草具有降血糖、抗菌消炎、抗病毒感染、調(diào)節(jié)免疫、降血壓、降血脂、保肝利膽等作用[5]。此外，該藥材對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有明顯的抑制作用[6]。筆者采用MTT法研究夏枯草粗提物對(duì)3種腫瘤細(xì)胞(淋巴瘤細(xì)胞株Jurkat、肺癌細(xì)胞株A-549、子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株Ishikawa)體外增殖的影響，為其抗癌機(jī)制的深入研究以及臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 淋巴瘤細(xì)胞株Jurkat、肺癌細(xì)胞株A-549購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫，子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株Ishikawa由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院婦科腫瘤實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。

1.2 藥品與試劑 夏枯草購自蕭山醫(yī)藥公司。MEM培養(yǎng)液(HyClone公司，批號(hào)：NWL 0507)；優(yōu)級(jí)胎牛血清(天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司，批號(hào)：TBD21HY)；胰蛋白酶(0.25%Trypsin-EDTA，Gibco，批號(hào)：1023133)；DMSO(二甲基亞砜，Sigma，批號(hào)：D8370)；MTT(四甲基偶氮唑鹽，Solarbio，批號(hào)：M8180)；其余試劑為分析純；阿霉素(Solarbio，批號(hào)：P1421，規(guī)格：10 mL/支)。

1.3 儀器與設(shè)備 酶標(biāo)儀(BIORAD，日本)；無菌凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)；顯微鏡(Olympus IX41)；二氧化碳培養(yǎng)箱(NV-2500E，美國)；微量振蕩器(江蘇金壇市中大儀器廠)；電子天平(BP-2110，德國)。

1.4 癌細(xì)胞株的常規(guī)培養(yǎng) 將Jurkat細(xì)胞、A-549細(xì)胞、Ishikawa細(xì)胞置于37℃，5%CO2，濕度95%細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)細(xì)胞生長1天后更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長到80%～90%時(shí)，棄去培養(yǎng)液，以PBS磷酸鹽緩沖液清洗1～2次，加1 mL 0.25%胰蛋白酶，37℃下消化1 min，棄去胰蛋白酶，加入5～6 mL培養(yǎng)液吹打，分裝至2個(gè)不同的培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加培養(yǎng)液，標(biāo)記，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.5 夏枯草供試液的制備 對(duì)藥材以水煎法提取2 h，加入乙醇，至乙醇濃度為75%，制得夏枯草粗提物，取夏枯草粗提物適量，精密稱定，溶于DMSO中，用細(xì)胞培養(yǎng)液分別稀釋配制成含生藥濃度為 24.2 mg/mL，48.4 mg/mL，60.5 mg/mL，84.7 mg/mL，121.0 mg/mL的供試液。供試液中DMSO濃度控制在1%以下。

1.6 MTT比色法測(cè)定藥物的抗癌活性 取對(duì)數(shù)生長期的淋巴瘤Jurkat細(xì)胞、肺癌A-549細(xì)胞、子宮內(nèi)膜癌IShikawa細(xì)胞(5×104mL-1)接種于96孔培養(yǎng)板，每孔接種細(xì)胞懸浮液200 μL，置于37℃、濕度為95%、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞完全貼壁后，吸出培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)組：加入上述不同濃度的夏枯草供試液；陽性對(duì)照組：加入濃度分別為0.04 μg/mL，0.16 μg/mL，0.63 μg/mL，2.50 μg/mL，9.86 μg/mL的阿霉素試液；空白組：只加入細(xì)胞培養(yǎng)液；對(duì)照組：加入細(xì)胞培養(yǎng)液和癌細(xì)胞；每個(gè)濃度均為4孔，每孔加入體積為200 μL，培養(yǎng)48 h后，每孔加入濃度為5 mg/mL的MTT溶液20 μL，培養(yǎng)4 h后，小心吸掉孔板中的培養(yǎng)液，每孔加入150 μLDMSO，低速振蕩10 min使結(jié)晶物充分溶解，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔OD值，測(cè)定波長570 nm，計(jì)算細(xì)胞的生長抑制率。以上實(shí)驗(yàn)平行做兩次，計(jì)算平均值。細(xì)胞生長抑制率(%)=(對(duì)照孔測(cè)定的平均OD值-加藥組測(cè)定的平均OD值)/ (對(duì)照孔測(cè)定的平均OD值-空白孔測(cè)定的平均OD值)× 100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均以SPSS17.0進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，行χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以(±s)表示，行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

各組對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用比較，見表1、表2、表3。不同濃度的供試液對(duì)3種腫瘤細(xì)胞的增殖均有一定的抑制作用，IC50值分別為59.628 mg/mL、53.917 mg/mL、48.017 mg/mL，并且在一定范圍內(nèi)，夏枯草對(duì)細(xì)胞的抑制率隨藥物的濃度增加而加強(qiáng)，呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。

表1 各組對(duì)Jurkat細(xì)胞增殖抑制作用比較

表2 各組對(duì)A-549細(xì)胞增殖抑制作用比較

3 討論

癌癥嚴(yán)重威脅著人類的生命安全，有效的抗癌藥物的篩選對(duì)癌癥的治療具有重要的意義。MTT法利用外源性MTT與活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶反應(yīng)生成水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚，并在細(xì)胞中進(jìn)行沉積，而死細(xì)胞卻不呈現(xiàn)這種現(xiàn)象，以此反映活細(xì)胞存在的數(shù)量。在一定的細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，產(chǎn)生MTT結(jié)晶的量與活細(xì)胞數(shù)目成正比[7]。此種方法準(zhǔn)確性高，重現(xiàn)性好，靈敏度高，且經(jīng)濟(jì)適用等優(yōu)點(diǎn)。目前已廣泛應(yīng)用于抗腫瘤藥物活性的篩選、一些生物活性因子的活性檢測(cè)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)等[8]。實(shí)驗(yàn)研究表明，夏枯草對(duì)肺癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞SGC-7901、淋巴癌細(xì)胞Raji、食管癌Eca-109細(xì)胞等具有一定的抑制作用[9]。其中李軍等[10]報(bào)道夏枯草可以有效的激活P53蛋白、抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)，促使淋巴癌細(xì)胞Raji的凋亡。本文采用MTT法研究了夏枯草粗提物對(duì)Jurkat細(xì)胞、A-549細(xì)胞增殖的影響、同時(shí)首次研究了夏枯草粗提物對(duì)IShikawa細(xì)胞增殖生長的影響，結(jié)果顯示與對(duì)照組比較，夏枯草對(duì)Jurkat、A-549、Ishikawa 3種腫瘤細(xì)胞均有一定的抑制作用，其IC50值分別為59.628 mg/mL、53.917 mg/mL、48.017 mg/mL，且一定濃度范圍內(nèi)，藥物對(duì)3種腫瘤細(xì)胞的抑制率呈現(xiàn)劑量依賴性。通過對(duì)夏枯草體外抗腫瘤細(xì)胞活性進(jìn)行初步篩選，為該藥材抗癌機(jī)制深入研究及臨床用藥奠定了基礎(chǔ)。

表3 各組對(duì)IShikawa細(xì)胞增殖抑制作用比較

[1]梁杰康，張琳，嚴(yán)曉明．HPLC-ECI-MS/MS鑒定夏枯草的主要化學(xué)成分[J]．中國中醫(yī)藥，2013，11(14)：153-154．

[2]張明智，鄭曉珂，劉宏民，等．夏枯草提取物體外誘導(dǎo)EL-4細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究[J]．江蘇中醫(yī)藥，2008，40 (4)：80-83．

[3]鄭學(xué)芝，鄭學(xué)海，李佳，等．夏枯草提取物對(duì)人食管癌Eca-109細(xì)胞增殖和凋亡的影響[J]．中國食物與營養(yǎng)，2012，18(9)：74-73．

[4]張明智，張可杰，王慶端，等．夏枯草對(duì)淋巴瘤細(xì)胞增殖的影響[J]．醫(yī)藥論壇雜志，2007，28(1)：54-55．

[5]許松日，金光，李文，等．夏枯草醇提取物對(duì)正常大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)的舒張作用[J]．四川中醫(yī)，2010，28 (4)：52-53．

[6]張麗丹，蘇潔，呂圭源，等．夏枯草的藥理研究與臨床應(yīng)用[J]．海峽藥學(xué)，2011，23(5)：143-145．

[7]張淼，董寶婧，苗芳，等．夏枯草提取物的抗氧化活性[J].草業(yè)科學(xué)，2012，29(9)：1477-1481．

[8]賈曉斌，封亮，陳彥，等．夏枯草肺癌化學(xué)預(yù)防物質(zhì)基礎(chǔ)研究思路與方法[J]．中草藥，2009，40(2)：316-318.

[9]李艷麗．夏枯草水提物對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠降壓作用的研究[J]．中外醫(yī)學(xué)研究，2012，10(30)：147．

[10]李軍，楊慧玲．夏枯草誘導(dǎo)人淋巴瘤Raji細(xì)胞凋亡及其機(jī)制[J]．中國老年學(xué)雜志，2011，31(13)：2528-2529.

（責(zé)任編輯：駱歡歡）

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R73；R285

A

0256-7415（2015）05-0273-03

10.13457/j.cnki.jncm.2015.05.129

2014-11-30

沈亞芬（1974-），女，主管中藥師，研究方向：中藥材重金屬含量測(cè)定。