1，25-（OH）2D3聯(lián)合α-干擾素治療四氯化碳誘導肝纖維化小鼠的療效研究

榮辰，康輝，郝奉天，陶志嵩

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科，沈陽 110001）

1，25-（OH）2D3聯(lián)合α-干擾素治療四氯化碳誘導肝纖維化小鼠的療效研究

榮辰，康輝，郝奉天，陶志嵩

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科，沈陽 110001）

目的探討1，25-（OH）2D3聯(lián)合α-干擾素（IFN-α）對四氯化碳（CCl4）誘導的BALB/c肝纖維化小鼠的治療效果。方法應用10%CCl4（5 μL/g）制造肝纖維化小鼠模型成功后，將其隨機分為鹽水治療組（0.9%生理鹽水100 μL/只，n=6）、IFN-α治療組（800 U/只，n=6）、1，25-（OH）2D3治療組（50 μg/kg口服灌胃，n=6）和聯(lián)合治療組（同時給予2種藥物，n=6），另設正常對照組（n=6）。應用病理組織學檢測方法對各組小鼠進行肝臟纖維化分級及評分；采用實時定量PCR及酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測細胞因子白細胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）及信號轉(zhuǎn)導蛋白Smad3的表達水平。結(jié)果病理組織學檢查結(jié)果顯示：聯(lián)合治療組小鼠肝臟炎性細胞浸潤減少，CoI1α1含量降低；實時定量PCR及ELISA檢測結(jié)果顯示：IL-6、TNF-α、TGF-β、Smad3及IL-10的表達水平升高，但與兩者單獨治療效果無顯著差異。結(jié)論1，25-（OH）2D3聯(lián)合IFN-α治療CCl4誘導的小鼠肝纖維化效果與單獨用藥療效相似。

肝纖維化；1，25-（OH）2D3；α-干擾素

在各種刺激下，肝臟內(nèi)細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）產(chǎn)生和降解失衡，導致其過度增生與異常沉積，使肝臟結(jié)構(gòu)破壞并產(chǎn)生肝臟功能異常，從而導致肝纖維化［1］。當肝臟受到損傷或感染肝炎病毒時，肝臟枯否細胞會釋放腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）等促炎性介質(zhì)，直接或間接激活肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSCs）由靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)，導致膠原形成。TGF-β能夠刺激ECM合成，抑制ECM降解，是組織纖維化形成最重要的因子［2］。

1，25-（OH）2D3是維生素D的活性形式，其主要功能為調(diào)節(jié)鈣磷代謝及骨鈣鹽沉積［3］。研究表明，1，25-（OH）2D3可以有效地調(diào)節(jié)先天性及適應性免疫功能及細胞的生長分化［4］，抑制肝臟、腎臟、肺及心肌纖維化的發(fā)展［5～8］。IFN-α是目前臨床上治療慢性丙型肝炎的首選藥物，研究顯示，它可能還能夠通過調(diào)控肝臟免疫細胞和細胞因子水平發(fā)揮直接的抗纖維化效應［9～11］。1，25-（OH）2D3和IFN-α單獨應用時均具有抗纖維化作用，且其相關(guān)機制有一定程度的交叉重疊，因此，本研究擬將二者聯(lián)合應用于四氯化碳（CCL4）誘導的小鼠肝纖維化的治療中，旨在評判二者聯(lián)合治療的效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：6～8周齡、雌性BALB/c小鼠由中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所提供（許可證編號：SCXK京200420001），18～22℃下自由進食普通桿狀飼料，正常飲水。

1.1.2 主要試劑：CCl4（上海長江化工廠）；重組人IFN-α2b（美國先靈葆雅公司）；1，25-（OH）2D3（美國Sigma公司）；TRIzol（美國Invitrogen公司）；Prime-Script?RT reagent kit with gDNA Eraser（美國Takara公司）；SYBR?Premix Ex TaqTM（美國Takara公司）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠肝纖維化模型建立及分組：給予小鼠腹腔注射10%CCl4（橄欖油稀釋，5 μL/g，3次/周）6周后，將其隨機分為4組（每組6只）：鹽水治療組（0.9%生理鹽水100 μL/只，皮下注射，隔日1次），IFN-α治療組（800 U/只，皮下注射，隔日1次），1，25-（OH）2D3治療組（50 μg/kg，口服灌胃，隔日1次）和聯(lián)合治療組［同時給予800 U/只IFN-α皮下注射和50 μg/kg 1，25-（OH）2D3口服灌胃］。另設正常對照組（n=6），給予小鼠0.9%生理鹽水（100 μL/只）皮下注射，隔日1次。治療6周后，取各組小鼠肝臟組織進行相關(guān)檢測。

1.2.2 組織學檢測及肝纖維化分級評分：取小鼠肝臟組織切片后行HE及Masson染色，并進行纖維化分級及評分。肝纖維化分級標準［12］：0級，正常；Ⅰ級，存在纖維化（匯管區(qū)纖維化擴大，局限竇周及小葉內(nèi)纖維化）；Ⅱ級，輕度纖維化（匯管區(qū)周圍纖維化，纖維間隔形成，小葉結(jié)構(gòu)保留）；Ⅲ級，中度纖維化（纖維間隔伴小葉結(jié)構(gòu)紊亂，無肝硬化）；Ⅳ級，嚴重纖維化（纖維間隔變厚，許多假小葉形成）。將所得分級結(jié)果做下列轉(zhuǎn)化后再做肝纖維化評分統(tǒng)計［13，14］：0級=20；Ⅰ級=21；Ⅱ級=22；Ⅲ級=23；Ⅳ級= 24。

1.2.3 實時定量PCR檢測CoI1α1、IL-6、IL-10、TNF-α及Smad3 mRNA的表達水平：提取肝組織中總RNA，將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，行實時PCR。反應條件：95℃預變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火延伸34 s，40個循環(huán)；95℃15 s，60℃1 min，95℃5 s，制熔解曲線。反應結(jié)束后，分析各樣本的CT值，即達到一定熒光閾值的循環(huán)數(shù)。用β-acti n作為內(nèi)參進行校正。

1.2.4 ELISA法檢測細胞因子表達水平：雙抗體夾心ELISA法檢測小鼠肝細胞培養(yǎng)上清中IL-6、IL-10、TNF-α及TGF-β的含量，酶標儀（InterMedNJ-2100）測定OD450nm值，繪制標準曲線，計算含量。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠肝臟組織病理變化及纖維化分級評分

2.1.1 各組小鼠肝臟組織學變化：正常對照組可見肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝索排列整齊，無炎性細胞浸潤，匯管區(qū)無纖維化，肝小葉間未見纖維組織增生；鹽水治療組可見肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，肝索排列紊亂，有炎性細胞浸潤，肝細胞水腫，脂肪變性明顯，匯管區(qū)大量炎性細胞浸潤，纖維間隔形成伴小葉結(jié)構(gòu)紊亂，匯管區(qū)纖維組織增生；IFN-α治療組和1，25-（OH）2D3治療組可見匯管區(qū)少量炎性細胞浸潤，匯管區(qū)纖維組織增生，少量纖維間隔形成，小葉結(jié)構(gòu)完整；聯(lián)合治療組與各單獨治療組變化相似，無明顯差異。見圖1，圖2。

2.1.2 各組小鼠肝臟組織纖維化分級情況及評分：如表1所示，生理鹽水治療組小鼠纖維化評分較正常組顯著上升（P＜0.05），表明肝纖維化程度加重。應用IFN-α和1，25-（OH）2D3單獨及聯(lián)合治療組小鼠纖維化評分較生理鹽水治療組顯著下降，但聯(lián)合治療并未更好地緩解肝纖維化，評分與單獨治療組無顯著差異（P＞0.05）。

2.2 IFN-α、1，25-（OH）2D3單獨及聯(lián)合應用治療前后小鼠肝臟CoI1α1mRNA表達的變化

圖1 各組小鼠肝臟組織HE染色結(jié)果 ×100Fig.1 HE staining of tissue slices from mice livers×100

圖2 各組小鼠肝臟組織Masson染色結(jié)果 ×100Fig.2 Masson staining of tissue slices from mice livers×100

表1 各組小鼠肝纖維化評級及計分Tab.1 Histological grading and staging in CCL4-induced mice hepatic fibrosis specimens

應用實時PCR檢測各實驗小鼠肝臟內(nèi)ECM的主要成分和纖維化形成的重要標志物CoI1α1 mRNA的表達水平。結(jié)果如圖3所示：與正常對照組小鼠相比，鹽水治療組CoI1α1表達水平上升（P＜ 0.05）；IFN-α、1，25-（OH）2D3單獨治療組及聯(lián)合治療組CoI1α1表達水平較鹽水治療組顯著下降（P＜0.05），聯(lián)合治療組與單獨治療組相比，CoI1α1表達水平無統(tǒng)計學差異。

2.3 IFN-α、1，25-（OH）2D3治療前后肝臟相關(guān)細胞因子的變化

治療6周后，分別應用實時定量PCR及ELISA方法對小鼠肝臟局部細胞因子IL-6、IL-10及TNF-α進行檢測，結(jié)果如圖4所示：IFN-α、1，25-（OH）2D3單獨及聯(lián)合治療后，IL-6及TNF-α表達水平與鹽水治療組相比呈明顯下降趨勢（P＜0.05）；IFN-α和1，25-（OH）2D3聯(lián)合治療組IL-6水平較單獨治療組高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明聯(lián)合治療效果較單獨治療更差。IFN-α、1，25-（OH）2D3單獨及聯(lián)合治療后，IL-10水平較生理鹽水治療組明顯升高，但3組之間無統(tǒng)計學差異。

圖3 各組小鼠肝臟CoI1α1mRNA表達水平Fig.3 Expression of CoI1α1 mRNA in the livers of different groups

圖4 肝細胞培養(yǎng)上清炎性因子TNF-α濃度及IL-6和IL-10mRNA的表達Fig.4 Expression of I L-6，IL-10mRNA and TNF-α in the liver of different groups

2.4 IFN-α、1，25-（OH）2D3單獨及聯(lián)合治療對TGF-β/Smad通路相關(guān)分子表達水平的影響

如圖5所示：IFN-α和1，25-（OH）2D3單獨治療組肝臟組織培養(yǎng)上清中TGF-β濃度及肝臟Smad3 mRNA表達水平與生理鹽水治療組相比均明顯下降（P＜0.05），但與聯(lián)合治療組相比則無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。聯(lián)合治療后雖然降低了TGF-β/Smad通路相關(guān)分子表達水平，但與兩者單獨治療組相比并未見更好的阻斷效果。

3 討論

圖5 各組小鼠肝臟組織培養(yǎng)上清TGF-β濃度及肝臟Smad3mRNA表達水平的變化Fig.5 Smad3mRNA and TGF-β expression level in the liver of different groups

肝纖維化是多種病因所致急性或慢性肝病共有的病理改變，具有可逆性。IFN-α和1，25-（OH）2D3均已被證實具有抗纖維化作用，且兩者的作用機制存在交叉。CoI1α1是ECM的主要成分，大量產(chǎn)生的CoI1α1是纖維化疾病的共同病理特征。研究表明，IFN-α可抑制CCL4誘導的肝纖維化大鼠體內(nèi)CoI1α1的表達，從而減輕ECM的過度增生［15］。1，25-（OH）2D3可通過VDR受體與膠原啟動子序列近端Sp1.1及另一遠端位點結(jié)合，抑制人星狀細胞中CoI1α1的表達［16］。本研究結(jié)果顯示：IFN-α和1，25-（OH）2D3治療后，肝纖維化小鼠肝臟匯管區(qū)炎性浸潤減輕，CoI1α1 mRNA表達水平顯著降低；IFN-α和1，25-（OH）2D3單獨或聯(lián)合治療均有抗肝臟纖維化的作用，且聯(lián)合治療并無疊加效應。

IL-6能通過介導炎性反應啟動纖維化的形成，并可通過促進ECM的合成而促進肝纖維化的發(fā)生發(fā)展［17］。TNF-α可以促進肝內(nèi)Ito細胞及纖維母細胞增殖，并促使其向肌纖維母細胞的轉(zhuǎn)化。IL-10是一種抗炎性因子，能夠拮抗炎性介質(zhì)，抑制炎性反應。本研究通過觀察IFN-α和1，25-（OH）2D3治療前后IL-6、IL-10和TNF-α這3種細胞因子的變化，初步評判二者的治療效果。結(jié)果顯示：IFN-α和1，25-（OH）2D3單獨或聯(lián)合治療后，小鼠肝臟內(nèi)促炎性因子IL-6和TNF-α的表達水平均明顯降低，IL-10則顯著上升；且聯(lián)合治療并未更加有效地抑制促炎性細胞因子的產(chǎn)生，IL-6在聯(lián)合治療后較單獨治療的效果反而更差，提示二者聯(lián)合治療時可能會產(chǎn)生拮抗作用。

TGF-β/Smad3通路的活化可有效刺激肝纖維化形成，阻斷該通路可能成為治療肝纖維化的潛在靶點。在肝損傷時，TGF-β1主要由Kupffer和巨噬細胞釋放，肝纖維化時則主要由HSC釋放。TGF-β1是最強的致纖維化因子［18］，促進纖維連接蛋白及蛋白多糖等細胞外基質(zhì)合成與沉積。Smad3作為肝纖維化時細胞內(nèi)主要信號傳導介質(zhì)，能將信號由胞質(zhì)傳遞到胞核內(nèi)，調(diào)控目的基因的表達，具有活化HSC、促進膠原合成等效應，是調(diào)控肝纖維化發(fā)生發(fā)展的重要因素。研究表明IFN-α和1，25-（OH）2D3可通過此通路抑制纖維化的發(fā)生發(fā)展［19］。本研究結(jié)果顯示：IFN-α和1，25-（OH）2D3單獨或聯(lián)合治療后，肝纖維化小鼠肝臟內(nèi)TGF-β和Smad3的表達水平均下降，提示二者單獨或聯(lián)合治療均有效果，但無疊加效應。

總之，本研究結(jié)果顯示，1，25-（OH）2D3聯(lián)合IFN-α治療CCl4誘導的小鼠肝臟纖維化效果與單獨治療效果相似。文獻報道，對臨床丙型肝炎基因4型患者進行干擾素治療的同時，行維生素D3聯(lián)合治療并無顯著效果［20］，與本研究結(jié)果一致。

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（編輯 王又冬）

Efficacy of Activated Vitamin D3Combined with Interferon-α in the Treatment of CCL4-induced Hepatic Fibrosisin Mice

RONG Chen，KANG Hui，HAO Feng-tian，TAO Zhi-song

（Department of Clinical Laboratory，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo investigate the curative effect of activated vitamin D3combined with IFN-α on CCl4-induced hepatic fibrosis in BALB/c mouse model.MethodsThe experimental mice received 100 μL of 10%CCl4intraperitoneally to induce a model of hepatic fibrosis，and the normal control group were administrated with same volume of 0.9%saline（n=6）.The experimental mice then were randomly divided into four treatment groups and treated for six weeks：saline therapy group（0.9%saline，100 μL/mouse，n=6），IFN-α therapy group（IFN-α 800 U/mouse，n= 6），1，25-（OH）2D3therapy group（50μg/kg，by gavaged，n=6）and combined treatment therapy group（combined treatment，n=6）.Hepatic injury and hepatic pathology were examined by HE staining and Masson staining.Interleukin-6（IL-6），interleukin-10（IL-10），tumor necrosis factor α（TNF-α），transforming growth factor-β（TGF-β）and Smad3 were determined by real-time PCRand ELISA.ResultsInflammatory cell infiltration and periportal collagen deposition were significantly reduced in all the therapeutic group expect saline therapy group assessed by HE and Masson staining.The IFN-α therapy group，1，25-（OH）2D3therapy group and combined treatment therapy group displayed significant decrease in Col1α1，IL-6，TNF-α，TGF-β and Smad3 expression and increase in IL-10 expression in liver tissue（P＜0.05）.ConclusionThe effect of 1，25-（OH）2D3combined with IFN-α therapy is similar to separated treatment.

hepatic fibrosis；1，25-（OH）2D3；IFN-α

R575.2

A

0258-4646（2015）12-1110-06

高等學校博士學科點專項科研基金（21040988）

榮辰（1989-），女，技師，碩士.

康輝，E-mail：kanghui65@sina.com

2015-04-15

網(wǎng)絡出版時間：