原發(fā)性舍格倫綜合征患者Th22細(xì)胞及其細(xì)胞因子IL-22的表達(dá)及意義

王天祥，李金龍，柳洪志，王秋旭

（1.大慶油田總醫(yī)院口腔頜面外科，黑龍江 大慶 163001；2.佳木斯大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科，黑龍江 佳木斯 154002；3.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院口腔科，沈陽 110004）

原發(fā)性舍格倫綜合征患者Th22細(xì)胞及其細(xì)胞因子IL-22的表達(dá)及意義

王天祥1，李金龍2，柳洪志1，王秋旭3

（1.大慶油田總醫(yī)院口腔頜面外科，黑龍江 大慶 163001；2.佳木斯大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科，黑龍江 佳木斯 154002；3.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院口腔科，沈陽 110004）

目的探討Th22細(xì)胞及其細(xì)胞因子白細(xì)胞介素22（IL-22）在原發(fā)性舍格倫綜合征（pSS）患者外周血中的表達(dá)及臨床意義。方法pSS患者根據(jù)唾液腺受累程度分為輕、中、重度患者。健康成人作為對(duì)照組。檢測(cè)Th22細(xì)胞及其細(xì)胞因子IL-22在輕、中、重度pSS患者和健康對(duì)照組外周血中的表達(dá)。結(jié)果pSS患者外周血中Th22細(xì)胞及細(xì)胞因子IL-22表達(dá)明顯高于健康對(duì)照組（P＜0.05）。而且患者病情越嚴(yán)重，外周血中Th22細(xì)胞及細(xì)胞因子IL-22水平越高：重度組高于中度組（P＜0.05），中度組高于輕度組（P＜0.05）。結(jié)論pSS患者外周血中Th22及其細(xì)胞因子IL-22較健康對(duì)照組明顯升高，而且病情越嚴(yán)重，Th22及其細(xì)胞因子IL-22水平越高。因此，檢測(cè)外周血中Th22及其細(xì)胞因子IL-22水平有可能成為判斷pSS病情嚴(yán)重程度的指標(biāo)，并為治療提供新的治療靶點(diǎn)。

原發(fā)性舍格倫綜合征；Th22；IL-22

原發(fā)性舍格倫綜合征（primary Sj?gren′s syndrome，pSS）是外分泌腺進(jìn)行性破壞導(dǎo)致黏膜及結(jié)膜干燥的一種自身免疫性疾?。?］。臨床表現(xiàn)為長時(shí)間的口腔及眼部黏膜干燥、腮腺及其他外分泌腺體腫大，嚴(yán)重的甚至可累及神經(jīng)系統(tǒng)等多個(gè)系統(tǒng)和臟器。本研究旨在明確健康人群及不同病變程度的pSS患者外周血中Th22及其細(xì)胞因子白細(xì)胞介素22（interlukin-22，IL-22）的表達(dá)情況，為pSS的診斷及治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2012年9月至2014年12月于大慶市油田總醫(yī)院口腔科及風(fēng)濕免疫科確診pSS患者共90例。男性32例，女性58例；年齡22～75歲，其中22～＜40歲14例，40～＜60歲59例，≥60歲17例。均符合pSS修訂診斷標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)照組18例，均來自健康獻(xiàn)血者，且無自身免疫病史。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

采用2002年國際診斷分類標(biāo)準(zhǔn)［2］，診斷項(xiàng)目包括：（1）口腔癥狀；（2）眼部癥狀；（3）眼部體征；（4）組織學(xué)檢查；（5）涎腺受損；（6）抗SSA/SSB抗體（+）。其中有4項(xiàng)指標(biāo)提示陽性，即可診斷為pSS。

1.3 方法

1.3.1 分組：通過锝腮腺動(dòng)態(tài)顯像檢測(cè)將pSS患者分為輕、中、重3組，見表1?；颊呷⊙雠P位，靜脈注射99m锝（99mTcO4-）185 MBq（5mCi），注射后用配有低能平行孔準(zhǔn)直器SPECT（單光子發(fā)射器計(jì)算機(jī)斷層）進(jìn)行唾液腺動(dòng)、靜態(tài)顯像，放大倍數(shù)1∶1.6，以1幀/min速度連續(xù)采集40幀，第30分時(shí)給患者口含VitC粉300 mg，第40分時(shí)分別左、右側(cè)位和正位唾液腺顯像，將所得結(jié)果應(yīng)用計(jì)算機(jī)ROI程序（感興趣區(qū)）進(jìn)行定量分析。

表1 99m锝動(dòng)態(tài)顯像檢測(cè)將pSS患者分為輕、中、重3組Tab.1 The pSS patients were divided into mild，moderate and severe groups according to the 99mTc scintigraphy analysis

圖1 Th22、Th17在pSS和健康人外周血中的表達(dá)Fig.1 Th22 and Th17 expression in peripheral blood of pSS and healthy individuals

1.3.2 分離及培養(yǎng)外周血單個(gè)核細(xì)胞：取外周血，去血漿，用淋巴分離液分離出人外周血單核細(xì)胞層，分離出的液體可形成4層，自上而下依次是血漿和組織勻漿液層、環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞或單核細(xì)胞層、透明分離液層和紅細(xì)胞層。小心取出中間白膜層（單核細(xì)胞層），即為PBMC層。然后將PBMC接種到培養(yǎng)板里孵育4 h。

1.3.3 流式檢測(cè)：將孵育好的PBMC培養(yǎng)板內(nèi)的細(xì)胞制懸液，分別移至流式管中，分別加入4 μL CD4-PerCP，后分別固定劑、破膜劑，再分別加入1 μL IL-17-Alexa-Flour，IL-22-PE室溫孵育30 min，將染色后的細(xì)胞群通過前向角（FSC）和側(cè)向角（SSC）散射光信號(hào)進(jìn)行設(shè)門，并用Flowjo 7.6.1軟件分析各細(xì)胞亞群的比例。

1.3.4 ELISA法檢測(cè)pSS實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組血清中IL-22的表達(dá)：抽取患者外周血2 mL，加入EDTA抗凝，通過離心方法取得上部分血清后凍存（-20℃），ELISA法（按試劑盒說明書操作）檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組血清中的IL-22水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，用描述，并進(jìn)行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；PASI評(píng)分呈偏態(tài)分布，應(yīng)用Spearman法進(jìn)行相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血Th22、Th17細(xì)胞的水平結(jié)果

外周血Th22比對(duì)照組健康人顯著升高（P＜0.01）。不僅如此，我們還發(fā)現(xiàn)隨著病情的加重，Th22細(xì)胞頻率逐漸升高（P＜0.01），而Th17細(xì)胞的表達(dá)在輕、中、重3組之間無明顯差異（P＞0.05），見圖1。

2.2 ELISA法檢測(cè)結(jié)果

血清中IL-22的濃度結(jié)果見表2，pSS患者血清中IL-22的濃度顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），且隨著病情的加重，IL-22的濃度逐漸增多。

表2 不同組別中IL-22水平的比較Tab.2 Comparison of the levels of IL-22 in different groups

2.3 Th22細(xì)胞頻率與細(xì)胞因子IL-22濃度的相關(guān)性結(jié)果

pSS患者血清中IL-22的濃度與Th22細(xì)胞比率呈正相關(guān)（R=0.375，P=0.022 3），見圖2。

圖2 Th22和IL-22的相關(guān)性Fig.2 The relationship between Th22 and IL-22

3 討論

pSS的發(fā)生可以分為3個(gè)連續(xù)的階段：第一階段是起始期，一系列異常的基因、生理和生化因素導(dǎo)致涎腺細(xì)胞新生減少和凋亡增加［3］，此階段尚不能檢測(cè)到明顯的自身免疫反應(yīng)；第二階段是確立期，腺上皮細(xì)胞的凋亡引發(fā)了自身免疫反應(yīng)，白細(xì)胞浸潤并表達(dá)致炎因子，形成淋巴濾泡，濾泡中開始是以T細(xì)胞為主，后來B細(xì)胞增多，并出現(xiàn)自身免疫抗體［4］；第三階段是臨床期，開始表現(xiàn)出各種臨床癥狀，涎腺和淚腺分泌功能障礙。由于pSS發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性，很多學(xué)者針對(duì)T淋巴細(xì)胞的各種亞型在發(fā)病過程中所發(fā)揮的作用分別進(jìn)行了研究，已經(jīng)證實(shí)了T輔助淋巴細(xì)胞中的Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞與pSS的發(fā)病密切相關(guān)，而Treg/Th17之間的動(dòng)態(tài)平衡可以影響免疫系統(tǒng)的反應(yīng)模式［5］。

Th22細(xì)胞是一群新型CD4+輔助T細(xì)胞，它相對(duì)獨(dú)立于Th1、Th2及Th17細(xì)胞，是一種CD4+效應(yīng)T細(xì)胞亞群，源于Th0細(xì)胞。Eyerich等［6］應(yīng)用免疫學(xué)等方法進(jìn)行研究，結(jié)果表明Th22不僅有不同于其他T細(xì)胞的生長和分化的調(diào)節(jié)機(jī)制，而且具有特殊的信息傳導(dǎo)方式和穩(wěn)定的效應(yīng)因子，更特殊的是Th22的基因編碼的蛋白和趨化因子與組織的重塑和新血管的生成有密切的關(guān)系。所以Th22是一群獨(dú)立的有特殊功能的輔助T細(xì)胞亞群。在某種特定的條件下，一部分Th22細(xì)胞可以轉(zhuǎn)化成為其他效應(yīng)的T細(xì)胞亞群。Th22細(xì)胞可以表達(dá)CCR4、CCR6和CCRl0。T細(xì)胞亞群是一個(gè)多樣化的細(xì)胞群，它包括Th1、Th9、Th17等，這些T細(xì)胞間存在著一種相互促進(jìn)相互制約的復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，這是一種非常復(fù)雜的平衡，Th22細(xì)胞是T細(xì)胞亞群中的新成員，對(duì)于它的研究還很少，自身免疫性疾病病理機(jī)制以及治療等的研究可以通過深入對(duì)Th22細(xì)胞的生長、分化、生理、病理以及與其他T細(xì)胞之間的調(diào)控關(guān)系的研究，得到新的啟發(fā)，對(duì)于一些自身免疫疾病的治療也具有重要的意義。隨著對(duì)Th22研究的不斷加深，越來越多的研究表明，Th22及其細(xì)胞因子IL-22在皮膚、腫瘤、自身免疫等疾病中起著舉足輕重的作用。

Th22細(xì)胞產(chǎn)生IL-22，不產(chǎn)生IL-4、IL-17和IFN-γ。近期有研究［7］認(rèn)為Th22細(xì)胞是IL-22的重要來源，且本實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果看到二者具有的正相關(guān)關(guān)系也證明了這一點(diǎn)。IL-22是一種新穎的免疫介質(zhì)，由免疫細(xì)胞產(chǎn)生，卻不影響這些細(xì)胞，而是調(diào)節(jié)特定組織細(xì)胞的功能［8］。有研究［9］發(fā)現(xiàn)在克羅恩氏病患者的外周血中也存在大量的IL-22，并且IL-22的血清水平和疾病的活動(dòng)性呈正相關(guān)。IL-22在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的表達(dá)也有描述，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的研究中［10］，滑液組織中IL-22及外周血中IL-22+ CD4+細(xì)胞的表達(dá)明顯增加?？傊琁L-22可以使組織細(xì)胞的固有免疫反應(yīng)得到增強(qiáng)，而且還具有保護(hù)組織受損及增強(qiáng)組織再生等功能。

近年來Th22細(xì)胞及其細(xì)胞因子IL-22在自身免疫性疾病中的作用成為新的研究熱點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了Th22細(xì)胞及其細(xì)胞因子IL-22在健康者、腺體破壞輕、中、重3種程度的pSS患者外周血中的表達(dá)變化，圖1結(jié)果顯示患者外周血Th22細(xì)胞頻率比對(duì)照組健康人顯著升高（P＜0.000 2）。不僅如此，我們還發(fā)現(xiàn)隨著病情的加重，Th22細(xì)胞頻率逐漸升高（P＜0.000 1），而Th17細(xì)胞的表達(dá)在輕、中、重3組之間無顯著性差異（P＞0.05）。對(duì)照組Th17和Th22細(xì)胞水平分別為0.825%和0.672%（圖1A）；pSS輕度組Th17和Th22細(xì)胞水平分別為0.893%和2.754%（圖1B）；pSS中度組Th17和Th22細(xì)胞水平分別為0.979%和3.087%（圖1C）；pSS重度組Th17和Th22細(xì)胞水平分別為0.899%和7.749%（圖1D）。表2表明患者血清中IL-22的濃度顯著高于對(duì)照組（P=0.031 0），且隨著病情的加重，IL-22的濃度逐漸增多。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)pSS患者血清中IL-22的濃度與 Th22細(xì)胞比率呈正相關(guān)（r=0.325，P= 0.022 3，圖2）。深入研究Th22細(xì)胞和IL-22在不同程度患者中外周血中的表達(dá)，明確其相關(guān)性，可能為揭示pSS的發(fā)病機(jī)制及治療提供新的依據(jù)，有利于開發(fā)新的免疫調(diào)節(jié)藥物。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果推斷，通過對(duì)pSS患者Th22細(xì)胞的活性進(jìn)行調(diào)節(jié)或者通過一些手段阻斷IL-22的效應(yīng)通路，可能會(huì)延緩pSS患者病情發(fā)展，為pSS的治療提供新的方向。

［1］孔令華，嚴(yán)春雷，潘穎.干燥綜合征54例唾液腺核素顯像定量分析與高頻超聲及唇腺活檢對(duì)比研究［J］.交通醫(yī)學(xué)，2011，25（2）：133-136.

［2］Vitali C，Bombardieri S，Jonsson R，et al.Classification criteria for Sj?gren′s syndrome：a revised version of the European criteria proposed by the American-European Consensus Group［J］.Ann Rheum Dis，2002，61（6）：554-558.

［3］賈志宇，張英懷.細(xì)胞凋亡在Sj?gren′s綜合征中的作用［J］.國外醫(yī)學(xué)口腔學(xué)分冊(cè)，2003，30（2）：132-134.

［4］劉浩，姜廣水.Th17細(xì)胞在舍格倫綜合征發(fā)病中的作用［J］.國際口腔醫(yī)學(xué)雜志，2010，37（6）：4-8.

［5］Van Amelsfort J M，Jacobs KM，Bijlsma JW，et al.CD4+CD25+regulatory T cells in rheumatoid arthritis：differences in the presence，phenotype，and function between peripheral blood and synovial fluid［J］.Arthritis Rheum，2004，50（9）：2775-2785.

［6］Eyerich S，Eyerich K，Pennino D，et al.Th22 cells represent a distinct human T cell subset involved in epidermal immunity and remodeling［J］.J Clin Invest，2009，119（12）：3573-3585.

［7］Wolk K，Kunz S，Witte E，et al.IL-22 increases the innate immunity of tissues［J］.Immunity，2004，21（2）：241-254.

［8］Dumoutier L，Louahed J，Renauld JC.Cloning and characterization of IL-10-related T cell-derived inducible factor（IL-TIF），a novel cytokine structurally related to IL-10 and inducible by IL-9［J］.J Immunol，2000，164（4）：1814-1819.

［9］Andoh A，Zhang Z，Inatomi O，et al.Interleukin-22，a member of the IL-10 subfamily，induces inflammatory responses in colonic subepithelial myofibroblasts［J］.Gastroenterology，2005，129（3）：969-984.

［10］Shen H，Googall JC，Hill Gaston JS.Frequency and phenotype of peripheral blood Th17 cells in ankylosing spondylitis and rheumatoid arthritis［J］.Arthritis Rheum，2009，60（6）：1647-1656.

（編輯 裘孝琦）

Clinical Significance of IL-22 Expression and Percentage of IL-22-producing Th22 Cellsin Primary Sj?gren′s Syndrome

WANG Tian-xiang1，LIJin-long2，LIU Hong-zhi1，WANG Qiu-xu3

（1.Department of Oral and Maxillofacial Surgery，Daqing Oilfield General Hospital，Daqing 163001，China；2.Department of Oral and Maxillofacial Surgery，Affiliated Stomatology Hospital of Jiamusi University，Jiamusi 154002，China；3.Department of Stomatology Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo measure the percentage of Th22 cells and evaluate the levels of plasma interlukin-22（IL-22）in human peripheral blood，so as to determine their clinical significance in primary Sj?gren′s syndrome（pSS）.MethodsPatients with pSS were divided into three subgroups based on severity of labial gland involvement：mild，moderate and severe.Healthy people served as controls.The percentage of Th22 cells and the levels of IL-22 in human peripheral blood from pSS patients and healthy controls were measured and compared.ResultsCompared to healthy controls，pSS patients had significantly higher percentage of Th22 cells and higher plasma IL-22 levels（P＜0.05）.Among pSS patients，the more serious illness they had，the higher percentage of Th22 cell and levels of IL-22 were observed.Severe patients had higher percentage of Th22 cells and IL -22 levels than moderate patients（P＜0.05），and moderate patients had higher percentage of Th22 cells and IL-22 levels than mild patients（P＜0.05）.ConclusionIncreased peripheral IL-22-secreting Th22 cells are detected in primary Sj?gren′s syndrome，which have a close association with disease severity.These data suggest that Th22 and its released cytokine IL-22 may be considered as potential valuable biomarkers for severity of pSS，which may provide a novel therapeutic target for treatment.

primary Sj?gren′s syndrome；Th22；IL-22

R782.7

A

0258-4646（2015）12-

遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃（2011010215-404）

王天祥（1976-），男，副主任醫(yī)師，碩士.

王秋旭，E-mail：wangqx@sj-hospital.org

2015-03-30

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