斑馬魚側線神經丘毛細胞發(fā)育的研究△

李雯 何英姿,2 # 孫珊 于慧前 李華偉,2

斑馬魚側線系統(tǒng)(lateral line system, LL)是由皮膚衍生的重要感覺器官，具有感覺周圍環(huán)境中的水流、水壓、水溫以及聽覺等功能[1]。側線系統(tǒng)以神經丘為基本單位，排列分布在頭部、軀干部和尾部的體側皮下，其發(fā)育存在固定模式。根據(jù)分布位置側線系統(tǒng)分為：前部側線系統(tǒng)(anterior lateral line, ALL) 和后部側線系統(tǒng)(posterior lateral line, PLL)[2，3]，前部側線系統(tǒng)主要包括位于頭部﹑眼眶上下緣﹑下頜和腮蓋等處的神經丘細胞團，在受精后5天基本形成；后部側線系統(tǒng)包括軀干和尾部的神經丘細胞團，由后部側線原基(posterior lateral line primodium)細胞自頭部眼眶后靠近耳部的外胚層基板開始向尾部遷徙，途中規(guī)律沉積多組神經丘(neuromast)發(fā)育而來；后部側線系統(tǒng)已成為研究細胞遷移的重要模型[4]。研究表明，斑馬魚后部側線系統(tǒng)的發(fā)育過程十分保守，當斑馬魚發(fā)育至受精后48小時(hours post fertilization，hpf)時，初級后部側線系統(tǒng)基本發(fā)育完全，包括軀干部的5～6組神經丘細胞和尾部的2～3組神經丘細胞[2，5，6]。但是，關于斑馬魚初級后部側線原基細胞團遷徙過程中的原基增殖情況、側線神經丘的沉積時間及位置的研究則鮮有報道。

成熟的神經丘由位于中心的機械感受性毛細胞和周圍的支持細胞組成[3]。側線神經丘毛細胞在結構和功能上與哺乳動物的內耳毛細胞非常類似，是研究毛細胞發(fā)育﹑再生及凋亡的重要模型[2.，7]。神經丘毛細胞在受精后3～4天開始具備機械傳導能力，逐漸發(fā)育成具備功能的側線系統(tǒng)，同時，由于斑馬魚神經丘結構位于體表及其對特殊熒光染料的敏感性，可直接活體觀察且便于操作。故本實驗以斑馬魚為模型，以初級后部側線神經丘和毛細胞作為觀察目標，應用免疫熒光染色和原位雜交等方法研究斑馬魚初級后部側線系統(tǒng)的形成模式；通過FM1-43FX熒光染料對斑馬魚側線神經丘功能性毛細胞進行特異性標記的特點[8]，結合轉基因斑馬魚(Brn3c:mGFP)的應用[9]，追蹤觀察側線神經丘毛細胞的早期發(fā)育，為深入研究毛細胞發(fā)育及再生提供研究模型和技術手段。

1 材料與方法

1.1實驗動物 野生型斑馬魚來自復旦大學分子醫(yī)學教育部重點實驗室。轉基因斑馬魚(Brn3c:mGFP)由美國哈佛大學眼耳醫(yī)院 Eaton-Peabody 實驗室陳正一教授惠贈。斑馬魚在28.5 ℃恒溫環(huán)境中生長，光周期為每天14小時光照，10小時黑暗，養(yǎng)殖方案按照《Zebrafish Book》(http://www.zfin.org)常規(guī)進行。

1.2實驗方法

1.2.1斑馬魚胚胎收集和觀察方法 為了確定斑馬魚初級后部側線神經丘的發(fā)育模式，以軀干部的前5個初級神經丘(L1～L5)的沉積時間為標準，數(shù)值化衡量原基的遷移過程。從20 hpf開始至48 hpf每隔4小時收集50個胚胎, 共收集400個胚胎，采用DAPI熒光染色方法檢測神經丘的數(shù)目。Tg(Brn3c:mGFP)轉基因斑馬魚在側線神經丘分化的毛細胞中表達綠色熒光蛋白(GFP)[9]，為了進一步觀察斑馬魚神經丘毛細胞的發(fā)育過程，選取3、5、7 dpf的 Brn3c:mGFP轉基因斑馬魚，每個時間點收集12個胚胎, 共收集36個胚胎以L1～L5神經丘為研究對象，對側線神經丘細胞及其中GFP陽性細胞數(shù)目進行計數(shù)。

1.2.2FM1-43FX染色與計數(shù) FM1-43FX作為一種活細胞染料，可以用來驗證存在的毛細胞是否有功能[8]。將收集的3、5、7 dpf斑馬魚胚胎(每個時間點收集12個胚胎共36個胎胚)浸入3 μM FM1-43FX(Molecular Probes, Eugene, OR, Invitrogen, F-35355)中避光孵育45秒，斑馬魚飼養(yǎng)用水洗滌3遍后，置于0.02% MS-222 (3-aminobenzoic acid ethylester, methanesulfonate salt, Sigma)中麻醉，熒光顯微鏡下對側線神經丘FM1-43FX陽性細胞進行觀察和計數(shù)。

1.2.3整體原位雜交 RNA探針制備：采用全斑馬魚反義RNA探針原位雜交方法在mRNA水平觀察不同發(fā)育階段cxcr7b的表達情況，靶基因cxcr7b編碼區(qū)片段由本實驗室克隆。反義RNA探針的合成按照說明書進行(The DIG RNA Labeling Kit; Roche)。收集斑馬魚胚胎，固定于4%多聚甲醛中，雜交步驟按照參照文獻進行[10]。

1.2.4細胞增殖及分析 原基細胞增殖分析：采用不同發(fā)育階段(24～44 hpf)的斑馬魚，每隔4小時收集20個胚胎，共120個胚胎，分別浸于15 mM的BrdU溶液中(斑馬魚飼養(yǎng)用水溶液配置)1小時，斑馬魚飼養(yǎng)用水洗滌3遍后，置于麻醉劑MS-222中麻醉；4%多聚甲醛室溫固定2小時；所有標本經PBS洗滌3×5 min；置入2N HCl中于37 ℃變性處理30 min；PBS沖洗3×5 min；0.5%Triton X-100處理40 min；5%山羊血清室溫封閉2小時；加入BrdU抗體(1:200)，4 ℃孵育過夜，PBS洗滌3×5 min；加入熒光二抗TRITC conjugated goat anti-mouse (1:200)，37 ℃避光孵育1小時；PBS洗滌3×5 min，抗淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照計數(shù)，計算BrdU指數(shù)(BrdU陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù))。

神經丘細胞增殖分析：收集3 dpf和5 dpf的斑馬魚各14個胚胎，共收集28個胚胎，分別給予10 mM的BrdU持續(xù)處理2天至5 dpf和7 dpf，斑馬魚飼養(yǎng)用水洗滌3遍后，再將其置于麻醉劑MS-222中麻醉，4%多聚甲醛固定2小時；所有標本經PBS洗滌3×5 min；置入2N HCl中于37 ℃變性處理30 min；PBS沖洗3×5 min；0.5%Triton X-100處理40 min；5%山羊血清室溫封閉2小時；加入BrdU抗體(1:200)，4 ℃孵育過夜，PBS洗滌3×5 min；加入熒光二抗FITC conjugated goat anti - mouse (1:200)，37 ℃避光孵育1小時；PBS洗滌3×5 min，抗淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照計數(shù)，計算BrdU指數(shù)。

1.3統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差表示，采用Student’st檢驗進行統(tǒng)計學分析。

2 結果

2.1斑馬魚后部側線發(fā)育 DAPI熒光染色顯示斑馬魚初級后部側線系統(tǒng)的發(fā)育模式有嚴格的時間依賴性(表1，圖1)。24 hpf，斑馬魚后部側線原基前端遷徙至2.3±1.9肌節(jié)，未見神經丘細胞團沉積；至28 hpf時，原基前端遷徙至8.8±0.5肌節(jié)，第一組側線神經丘細胞團(L1)沉積于5.23±0.8肌節(jié)處；32 hpf，原基前端遷徙至13.2±2.8肌節(jié)處，70%斑馬魚出現(xiàn)了L2神經丘細胞團，位于12.11±1.6肌節(jié)處；36 hpf，原基前端遷移至21.4±1.2肌節(jié), L3神經丘細胞團沉積于16.5±1.6肌節(jié)處；40 hpf，96%斑馬魚出現(xiàn)了4～5組神經丘細胞團，L4位于20.5±2.0肌節(jié)處。44 hpf，94%的斑馬魚出現(xiàn)了5組或以上的神經丘細胞團, L5位于25.84±1.7肌節(jié)處。48 hpf，體側共出現(xiàn)了7～9組側線神經丘細胞團，其中5～6組神經丘細胞團位于軀干部，2～3組神經丘細胞團位于尾部。正常斑馬魚初級后部側線原基遷徙速度約為1.7肌節(jié)/小時。

2.2側線原基細胞的增殖 對斑馬魚初級后部側線原基細胞進行BrdU染色觀察和計數(shù)，結果表明，細胞增殖在原基遷移的過程中貫徹始終(圖2)。在未沉積神經丘細胞團時，原基的BrdU指數(shù)為0.43±0.08，隨著原基遷移的進行，在L1 至 L5神經丘細胞團沉積后，原基細胞的BrdU指數(shù)分別為0.45±0.08、0.43±0.09、0.44±0.08、0.42±0.1、0.41±0.06。

表1 不同發(fā)育時期斑馬魚軀干部形成不同個數(shù)神經丘細胞團胚胎的構成比(%)

2.3側線神經丘毛細胞發(fā)育 統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示：3～7 dpf，斑馬魚側線神經丘GFP陽性的毛細胞數(shù)目顯著增多，各組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；進一步對軀干部L1～L5神經丘毛細胞進行FM1-43FX染色計數(shù)，結果顯示FM1-43FX陽性細胞的數(shù)量隨著天數(shù)的增加而逐漸增多，各組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表2，圖3)。提示3～7 dpf是側線神經丘毛細胞發(fā)育的活躍時期，其中受精后3～5天，毛細胞的發(fā)育活動最為劇烈，并開始具備功能。

表2 3～5 dpf斑馬魚側線神經丘毛細胞發(fā)育比較(個，

注：*與3 dpf組比較，P<0.05

2.4側線神經丘細胞的增殖 神經丘細胞在3～5 dpf和5～7 dpf時的增殖情況見圖4，可見，受精后3～5天，斑馬魚神經丘細胞增殖速度相對較快，3～5 dpf和5～7 dpf時神經丘細胞的BrdU指數(shù)分別為0.27±0.05和0.23±0.04。

3 討論

內耳毛細胞不可逆性損傷是導致感音性聾的主要原因[11]。哺乳動物內耳毛細胞在分化成熟后不具備自我修復和再生的能力，因此毛細胞的損傷和再生是感音性聾治療的熱點之一[12，13]。研究表明，鳥類和某些魚類(如斑馬魚)﹑兩棲類動物的前庭和耳蝸毛細胞損傷后可以完全再生，且伴有前庭和聽覺功能的恢復[12，14，15]。斑馬魚的基因與人類相似度高達87%，遺傳背景清楚，且具有發(fā)育周期短﹑繁殖能力強、胚胎發(fā)育體外完成及發(fā)育早期胚胎身體透明等優(yōu)點，備受生物學家關注。此外，斑馬魚側線神經丘毛細胞在結構和功能上與哺乳類動物內耳毛細胞非常類似，故其作為研究毛細胞發(fā)育和再生的模式生物具有獨特優(yōu)勢。

斑馬魚胚胎發(fā)育非常迅速,在受精后6～72 小時期間，胚胎經歷了原腸胚期、器官發(fā)生期、成熟期、孵出期等發(fā)育的重要階段，幾乎全部器官都在此階段內形成。既往研究顯示[16]，在斑馬魚側線系統(tǒng)的發(fā)育過程中，頭部眼眶后靠近耳部的外胚層基板產生體表神經丘和感覺神經節(jié)；耳后的表皮增厚形成后部側線基板，基板靠近后部的大部分細胞構成初級后部側線原基，包括大約100個表皮細胞，在受精后20小時開始沿水平肌膈向后進行遷移，待發(fā)育至48 hpf時，初級側線系統(tǒng)基本形成。本研究結果顯示，斑馬魚在發(fā)育至28 hpf時，幾乎全部出現(xiàn)了第一組側線神經丘細胞團，此后每隔4小時左右沉積1組神經丘細胞團，且神經丘細胞團的沉積位置較為固定。發(fā)育至48 hpf時，斑馬魚幼體出現(xiàn)9組側線神經丘細胞，此時初級后部側線神經丘的發(fā)育基本完成，與Ledent等[16]的研究結果吻合。

圖1 斑馬魚初級后部側線系統(tǒng)的發(fā)育過程

a, 24 hpf斑馬魚軀干部未見側線神經丘細胞團形成; b, 28 hpf斑馬魚軀干部出現(xiàn)了1組側線神經丘細胞團 (L1); c, 32 hpf斑馬魚軀干部出現(xiàn)了2組神經丘細胞團 (L1～L2); d, 36 hpf斑馬魚軀干部出現(xiàn)了3組側線神經丘細胞團 (L1～L3); e, 44 hpf斑馬魚軀干部出現(xiàn)了5組神經丘細胞團 (L1～L5); f, 48 hpf Tg(Brn3c:mGFP)轉基因斑馬魚出現(xiàn)了軀干部的6組神經丘細胞團和尾部的2組神經丘細胞團; g, 原位雜交結果顯示，32 hpf斑馬魚軀干部出現(xiàn)2組神經丘細胞團; h, 原位雜交顯示，40 hpf斑馬魚軀干部出現(xiàn)4組神經丘細胞團; i, 原位雜交顯示，48 hpf斑馬魚出現(xiàn)了軀干部的5組神經丘細胞團和尾部的2組神經丘細胞團。PrimI (primary posterior lateral line primordium)：初級后部側線原基

a，未沉積神經丘時，b～f，分別為沉積神經丘L1、L2、L3、L4、L5后的增殖情況。BrdU染色(紅色)標記原基中的增殖細胞

圖3 斑馬魚側線神經丘毛細胞發(fā)育情況

a，3 dpf； b，5 dpf；c，7 dpf；DAPI(藍色)為神經丘細胞，GFP(綠色)為已分化的毛細胞，F(xiàn)M1-43FX染色(紅色)顯示神經丘中有功能的毛細胞

圖4 斑馬魚側線神經丘細胞的增殖情況

a，3～5 dpf； b，5～7 dpf；DAPI(藍色)為神經丘細胞，BrdU染色(綠色)標記神經丘中的增殖細胞，F(xiàn)M1-43FX染色(紅色)顯示毛細胞

斑馬魚是較成熟的研究細胞遷移相關信號通路的重要模型。研究發(fā)現(xiàn)后部側線原基細胞的遷移受2種趨化因子受體cxcr4b和cxcr7b的調控[17]。Dambly-Chaudiere等[17]詳盡地闡述了cxcr4b和cxcr7b在后側原基細胞內的表達分布及其在原基遷移和神經丘細胞沉積過程中的重要作用，cxcr4b主要表達在原基細胞團的前部，其突變體可導致側線原基遷徙停滯[18，19]；cxcr7b最初從狗的甲狀腺cDNA庫中克隆得到，過去被稱為狗受體基因1(receptor dong cDNA1,RDC1)[20]，斑馬魚的cxcr7b基因與人類cxcr7b基因的同源性高達54%，cxcr7b是高度保守的G-蛋白偶聯(lián)七次跨膜蛋白受體，能夠與基質細胞衍生因子(stromal cellerived factor-1,SDF-1) 結合，形成SDF1/CXCR7生物學軸，從而在胚胎發(fā)育、調控細胞遷移、參與腫瘤侵襲和轉移、介導免疫炎癥反應等方面發(fā)揮生物學功能。斑馬魚側線系統(tǒng)中cxcr7b主要表達于后部側線原基細胞團的尾部以及新沉積的神經丘細胞中, 推測其與神經丘的沉積有關。近年來針對原基的研究發(fā)現(xiàn)cxcr4b和cxcr7b這兩個趨化因子受體的表達可與無翅型MMTV整合位點家族(wingless-type MMTV integration site family members,Wnt)信號轉導通路和成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factors,FGF)信號通路發(fā)生交互作用,從而調控原基細胞的遷移與神經丘的沉積過程[20]。Wnt信號和FGF配體通常分布于原基細胞團的頭部，而FGF激活信號僅分布在原基的尾部，Wnt信號可誘導FGF配體表達而激活尾部的FGF信號通路，原基尾部的FGF信號則通過誘導Dkk1的表達，從而抑制尾部的Wnt/β-catenin信號通路。Wnt和FGF信號在原基的作用表現(xiàn)為互斥性。Wnt/β-catenin激活信號可維持趨化因子受體cxcr4b和cxcr7b的極性，Wnt/β-catenin信號抑制原基頭部細胞cxcr7的表達而將其限制在原基尾部，并可通過未知受體抑制尾部細胞cxcr4的表達，從而在原基細胞的遷移過程中起重要作用。Wnt/β-catenin信號亦可通過影響FGF信號通路而改變神經丘細胞的周期性沉積。原基中FGF信號通路受抑，可影響神經丘的沉積使之數(shù)目減少。

后部側線系統(tǒng)的發(fā)育模式包括細胞的增殖﹑遷移以及分化過程。研究表明，原基細胞在遷移過程中不斷地進行增殖，這種細胞增殖在時間和空間上具有固定模式，Laguerre等[21]推測細胞增殖在側線系統(tǒng)的形成過程中起著不可忽視的重要作用；Aman等[22]認為原基細胞的增殖與神經丘的周期性沉積有關，使用細胞周期抑制劑阻礙原基細胞增殖，可觀察到遷徙過程中沉積下的神經丘數(shù)量減少，而原基的遷徙速度并未受到影響。研究還認為Wnt/β-catenin和FGF信號通路的交互作用對原基細胞的增殖有重要作用，阻斷任何一個信號通路均會減少細胞的增殖[20]。本研究探索了斑馬魚早期發(fā)育階段(24～40 hpf)原基的增殖情況，結果顯示原基細胞在遷移過程中均保持著較高的增殖狀態(tài)，且細胞增殖主要發(fā)生在原基的頭部區(qū)域，這種持續(xù)的細胞增殖為原基的正常遷移提供了形態(tài)基礎，使得原基在固定位置沉積下神經丘后仍可保持一定的基數(shù)，繼續(xù)向后遷移直至遷徙過程完成。

FM1-43FX為一種雙極性的活動依賴性熒光染料，其親水與親脂基團分別位于分子兩端，在水溶液中幾乎不發(fā)熒光。在大多數(shù)細胞中，F(xiàn)M1-43FX不能穿過脂質雙分子層，而當其疏水性的尾部插入到脂膜后，才能夠被激發(fā)從而產生熒光，該特性能夠較好地用于細胞內吞和胞吐作用的研究。FM1-43FX標記毛細胞被認為是鈣和鈣調蛋白依賴性的結果，染料可通過毛細胞頂端的內吞作用快速進入細胞內，可直接在熒光顯微鏡下觀察有功能毛細胞的形態(tài)、數(shù)目。本研究顯示，隨著斑馬魚側線系統(tǒng)的發(fā)育成熟，斑馬魚出膜(48 hpf)后5天是側線神經丘分化的活躍時期，特別是受精后3至5天，側線神經丘毛細胞的發(fā)育活動最為劇烈。若在該時期調控側線發(fā)育相關基因或給予干擾因素處理，可能會影響側線神經丘毛細胞的發(fā)育和分化。

本研究利用免疫熒光染色和整體原位雜交等方法觀察了斑馬魚后部側線神經丘的沉積過程，對初級側線神經丘(L1～L5)的沉積時間和位置進行了定量研究。同時利用Brn3c:mGFP轉基因斑馬魚和熒光染料FM1-43FX，示蹤神經丘毛細胞的發(fā)育過程。本研究所建模型易于觀察和檢測毛細胞的發(fā)育, 且方法簡單，為深入研究側線系統(tǒng)發(fā)育提供了理論依據(jù)，也為耳毒性藥物篩選提供了動物模型和技術手段。

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