基因芯片技術(shù)在腎病綜合征研究中的應(yīng)用前景

張碧麗，郁曉騰

腎病綜合征（nephrotic syndrome，NS）是由于腎小球?yàn)V過(guò)膜對(duì)血漿蛋白的通透性增高、大量血漿蛋白從尿中丟失而導(dǎo)致一系列病理生理改變的臨床綜合征，以大量蛋白尿、低白蛋白血癥、高脂血癥和水腫為主要臨床特點(diǎn)，目前發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明?；蛐酒夹g(shù)是20世紀(jì)90年代初期發(fā)展起來(lái)的綜合了分子生物學(xué)、半導(dǎo)體微電子技術(shù)、激光化學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)等眾多學(xué)科的一門高新技術(shù)，其依據(jù)核酸分子雜交原理檢測(cè)待測(cè)樣品的基因序列及表達(dá)的信息，具有高通量、集成化、微型化及自動(dòng)化的特點(diǎn)[1-2]。目前基因芯片已經(jīng)發(fā)展出多種類型，如Oligo芯片、mRNA表達(dá)譜芯片、microRNA芯片、cDNA芯片及DNA甲基化芯片等，涉及基因表達(dá)檢測(cè)、藥物靶點(diǎn)篩選、新基因識(shí)別及基因功能研究等眾多研究領(lǐng)域。高興等[3]利用基因芯片技術(shù)進(jìn)行多種食源性致病菌的篩查檢測(cè)，得出隨機(jī)引物PCR聯(lián)合基因芯片技術(shù)進(jìn)行食源性致病菌檢測(cè)的體系完全可行，為病原細(xì)菌高通量篩查提供了新的理論和技術(shù)基礎(chǔ)。尹豐等[4]利用基因芯片技術(shù)篩選人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞（GSCs）和正常神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）中差異表達(dá)的基因，揭示了GSCs和NSCs在mRNA表達(dá)水平的差異，由mRNA所控制的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)對(duì)NSCs向GSCs的惡性轉(zhuǎn)化具有重要影響，為探索腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生機(jī)制及靶向治療提供了線索?；蛐酒夹g(shù)可以從基因水平分析NS的致病機(jī)制和藥物治療的作用靶點(diǎn)。本文主要對(duì)基因芯片技術(shù)在NS中的研究應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 基因芯片技術(shù)的原理及與高通量測(cè)序技術(shù)的比較

基因芯片技術(shù)的具體程序是把大量已知基因序列探針集成于同一張芯片，將經(jīng)過(guò)標(biāo)記后的靶核苷酸序列與之雜交，通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)，對(duì)待測(cè)樣品中的基因信息進(jìn)行高通量的分析[5]。高通量測(cè)序技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的另外一種高通量基因組學(xué)研究方法，也稱其為深度測(cè)序技術(shù)[6]。與高通量測(cè)序技術(shù)比較，基因芯片技術(shù)具有技術(shù)穩(wěn)定、雜交結(jié)果分析直觀、快速等優(yōu)點(diǎn)，其缺點(diǎn)在于基因芯片技術(shù)只能檢測(cè)已知序列的特征，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)新信息的能力。近幾年發(fā)展起來(lái)的Target-sequencing或者稱為序列捕獲技術(shù)，先利用芯片探針捕獲待測(cè)片段，再用深度測(cè)序技術(shù)分析核酸序列，充分綜合了兩者的優(yōu)勢(shì)，解決了單一技術(shù)難以解決的問(wèn)題[7-8]。

2 基因芯片技術(shù)在NS研究中的應(yīng)用

目前認(rèn)為NS的發(fā)生是由多基因參與的復(fù)雜過(guò)程。因此，在探索NS發(fā)病機(jī)制的過(guò)程中，能否將NS相關(guān)致病基因作為一個(gè)整體進(jìn)行研究，成為解決這一問(wèn)題的關(guān)鍵?；蛐酒夹g(shù)可實(shí)現(xiàn)在mRNA水平上同時(shí)平行研究成千乃至上萬(wàn)條基因的表達(dá)關(guān)系，為揭示NS的發(fā)病機(jī)制提供了有力工具。

2.1 基因芯片技術(shù)與微小病變性腎病（MCNS） MCNS是兒童NS中最常見(jiàn)的病理類型。有學(xué)者認(rèn)為MCNS是由于免疫細(xì)胞的功能障礙，可能導(dǎo)致腎小球致通透性因子的釋放[9]。Komatsuda等[10]利用包含24 446個(gè)cDNA的微陣列，檢測(cè)2例MCNS患者腎病活動(dòng)期和緩解期外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在腎病活動(dòng)期有171個(gè)功能已知的基因表達(dá)發(fā)生了上調(diào)，其中21個(gè)基因編碼的蛋白可參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞因子的反應(yīng)，通過(guò)qRT-PCR驗(yàn)證24例MCNS患者、10例膜性腎?。∕N）患者和24例健康對(duì)照者，證實(shí)MCNS患者PBMC中趨化因子13（CCL13）和半乳糖凝集素相關(guān)蛋白（hspc159）的mRNA表達(dá)均明顯高于MN患者和健康對(duì)照組。大量研究表明，CCL13參與許多炎癥性疾病，其通過(guò)與受體結(jié)合選擇性趨化炎性細(xì)胞并調(diào)控關(guān)鍵的激活程序，推測(cè)其可能與MCNS患者的免疫炎癥反應(yīng)有關(guān)[11]。hspc159屬于凝集素家族，可以調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞因子的平衡，Th1/Th2細(xì)胞因子的平衡失調(diào)被認(rèn)為參與了許多自身免疫性疾病，推測(cè)hspc159的高表達(dá)與MCNS患者Th2細(xì)胞為主的免疫反應(yīng)有關(guān)[12]。組蛋白賴氨酸甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾，被認(rèn)為參與了多個(gè)生物學(xué)過(guò)程，組蛋白賴氨酸甲基化模式的異常改變，使得染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，可進(jìn)一步導(dǎo)致失調(diào)基因的轉(zhuǎn)錄和疾病進(jìn)展。Zhang等[13]采用ChIP-chip試驗(yàn)方法檢測(cè)15例MCNS患者和15例正常對(duì)照者PBMC組蛋白H3賴氨酸4甲基化（H3K4me3）后基因表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)MCNS組有841個(gè)基因表達(dá)上調(diào)、231個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，采用qRT-PCR驗(yàn)證了表達(dá)明顯上調(diào)的白細(xì)胞介素（IL）-4受體（R）、prkd2基因，與芯片結(jié)果一致，揭示了這些基因mRNA的表達(dá)和H3K4me3水平呈正相關(guān)關(guān)系。IL-4R基因編碼IL-4R的α鏈，通過(guò)與IL-4結(jié)合促進(jìn)Th2細(xì)胞的分化，而prkd2屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員，其在多種細(xì)胞表達(dá)，調(diào)節(jié)包括免疫反應(yīng)在內(nèi)的多種細(xì)胞反應(yīng)，并且prkd2對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移起著重要作用，這些顯著變化的基因有助于解釋MCNS患者免疫功能紊亂[14-15]。此外，還發(fā)現(xiàn)H3K4me3和MCNS患者啟動(dòng)子DNA甲基化之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系[13]。Kobayashi等[16]利用DNA甲基化芯片分別檢測(cè)6例MCNS患者緩解期、復(fù)發(fā)期的外周血的單核細(xì)胞和Th細(xì)胞，結(jié)果顯示從緩解期到復(fù)發(fā)期DNA甲基化模式主要發(fā)生在Th細(xì)胞，GATA2、PBX4和NYX 3個(gè)基因的表達(dá)顯著降低，表明表觀遺傳調(diào)控Th細(xì)胞是MCNS的發(fā)生機(jī)制。

以上研究表明，T淋巴細(xì)胞基因的異常表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞免疫功能障礙，引發(fā)腎小球?yàn)V過(guò)膜通透性改變，參與了NS的發(fā)病。利用基因芯片技術(shù)篩選差異性表達(dá)基因，并探討各個(gè)基因之間的相互關(guān)系和作用，是最終闡明NS發(fā)病機(jī)制和尋找藥物治療靶點(diǎn)的關(guān)鍵。

2.2 基因芯片技術(shù)與局灶節(jié)段性腎小球硬化（FSGS） 近年來(lái)，兒童FSGS的發(fā)病率一直在增長(zhǎng)，是導(dǎo)致兒童慢性腎衰竭的重要原因。研究認(rèn)為FSGS的發(fā)生和足細(xì)胞損傷或數(shù)目減少有關(guān)[17]。足細(xì)胞表達(dá)許多特殊的蛋白分子，如nephrin、CD2AP、Podacalycin等，這些蛋白的編碼基因突變或缺失可以導(dǎo)致足細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能改變[18-19]。Jeffrey等[20]通過(guò)比較FSGS患者、MCNS患者及正常人的基因表達(dá)譜變化，發(fā)現(xiàn)FSGS組較MCNS組、正常組有316個(gè)基因表達(dá)發(fā)生顯著差異，其中nephrin的表達(dá)下降近2倍，足細(xì)胞特異性肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白（Synaptopodin）表達(dá)下降近3倍，還有一些構(gòu)成足細(xì)胞裂孔隔膜（SD）復(fù)合體的分子，如FAT1、MAGI2和TJP1的表達(dá)同樣降低，證實(shí)足細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變與FSGS的發(fā)生密切相關(guān)。通過(guò)聚類分析，揭示這些基因的功能涉及細(xì)胞周期與細(xì)胞增殖、細(xì)胞骨架與運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多個(gè)方面，細(xì)胞增殖周期中轉(zhuǎn)錄因子的再激活和過(guò)表達(dá)很可能與FSGS發(fā)病機(jī)制有關(guān)[20]。Bennett等[21]研究發(fā)現(xiàn) FSGS患者 NPSH1、WT1、nephrin、ACTN4等足細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)明顯下調(diào)，進(jìn)一步證實(shí)足細(xì)胞損傷與FCGS發(fā)生密切相關(guān)。同時(shí)有研究證實(shí)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）表達(dá)的下降與蛋白尿有關(guān)，而轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β信號(hào)通路表達(dá)增強(qiáng)[20]。目前研究證實(shí)，TGF-β信號(hào)通路表達(dá)增強(qiáng)可導(dǎo)致腎臟纖維化的進(jìn)展[23]。另有研究表明，激素抵抗性腎病綜合征和TGF-β1的表達(dá)上調(diào)有密切關(guān)系[24]。目前TGF-β1已被公認(rèn)是治療腎小球硬化的靶點(diǎn)。有研究表明血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑（ACEI）及血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（ARB）類藥物可以下調(diào)TGF-β1的表達(dá)，達(dá)到干預(yù)FSGS進(jìn)展的作用[25]。

2.3 基因芯片技術(shù)與膜性腎病（MN） MN是成人NS中最常見(jiàn)的病理類型，以基底膜彌漫性增厚及上皮下免疫復(fù)合物沉積為特征，其發(fā)病機(jī)制目前仍不明了。Sui等[26]利用基因芯片技術(shù)研究MN與正常人PBMC組蛋白H3賴氨酸9（H3K9me3）甲基化修飾后的變化，發(fā)現(xiàn)MN患者有108個(gè)基因表達(dá)發(fā)生了明顯變化，通過(guò)qRT-PCR驗(yàn)證了DGCR6、SNX16、CNTN4、BIRC3、BIRC2 基因表達(dá)明顯上調(diào)，與芯片結(jié)果一致，其中CNTN4編碼黏附蛋白，屬于免疫球蛋白家族的成員。另有研究顯示CNTN4基因表達(dá)上調(diào)，可能與MN免疫復(fù)合物沉積有關(guān)[27]，為探討MN的發(fā)病機(jī)制及治療提供了方向。Wu等[28]以胎齡6周的BALB/c小鼠為研究對(duì)象，模型組予以陽(yáng)離子化的牛血清白蛋白（C-BSA）造成MN，利用基因芯片分別檢測(cè)模型組和對(duì)照組小鼠腎皮質(zhì)，結(jié)果模型組有175個(gè)基因呈顯著差異性表達(dá)，從中篩選出4個(gè)與損傷、炎癥、細(xì)胞基質(zhì)相互作用有關(guān)的基因MT-1、CTSD、lamr-1和LY6進(jìn)行PCR驗(yàn)證，與芯片結(jié)果一致。其中LY6在以往的研究中被證實(shí)和蛋白尿的發(fā)生及狼瘡腎損害有關(guān)[29]；而CTSD編碼的組織蛋白酶D正常情況下分布于遠(yuǎn)端腎小管和集合管系統(tǒng)，其表達(dá)增加可見(jiàn)于鏈球菌感染后腎小球腎炎[30]。王琳等[31]利用Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0探索特發(fā)MN患者全基因組拷貝數(shù)變異（CNVS）與參芪膜腎方療效的關(guān)系，觀察到參芪膜腎方治療有效組和無(wú)效組在第5、6、8號(hào)染色體檢測(cè)到的CNVS差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中位于6號(hào)染色體上的HLA族基因在有效組多數(shù)病例中表現(xiàn)為拷貝數(shù)擴(kuò)增，而無(wú)效組的多數(shù)病例則表現(xiàn)為拷貝數(shù)缺失，得出基因背景差異可能是導(dǎo)致參芪膜腎方取得不同療效的原因，HLA的同族基因拷貝數(shù)變異影響參芪膜腎方療效的發(fā)揮，前者有望成為該方治療MN的療效預(yù)測(cè)因子。

2.4 基因芯片技術(shù)與系膜增生性腎小球腎炎 系膜增生性腎小球腎炎（MsPGN）是以不同程度的系膜區(qū)增寬、系膜細(xì)胞增生、系膜基質(zhì)增多為主要病理特征的腎小球疾病。通過(guò)給大鼠靜脈注射單克隆抗Thy-1抗體模擬慢性腎小球腎炎模型，可以觀察到腎小球系膜及系膜細(xì)胞的顯著增殖，類似MsPGN[32]。Sadlier等[33]利用Oligo芯片分別檢測(cè)注射抗Thy-1抗體后第0、2、5、7、14天大鼠腎皮質(zhì)基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)在第5天PDGF、TGF-β等促細(xì)胞增殖基因的表達(dá)顯著增加，通過(guò)聚類分析發(fā)現(xiàn)了新的促系膜細(xì)胞增殖基因S100家族。Tsuji等[34]利用基因芯片技術(shù)比較不可逆模型組（靜脈注射1-22-3抗體并切除單側(cè)腎臟）、可逆模型組（單純靜脈注射1-22-3抗體）大鼠之間差異表達(dá)基因，檢測(cè)出有189個(gè)基因發(fā)生差異表達(dá)，而且大多數(shù)的差異基因發(fā)現(xiàn)于第4天，提示基因表達(dá)的早期變化決定了疾病的不可逆性，其中胸腺肽-β10在不可逆組顯著表達(dá)，推測(cè)腎臟疾病發(fā)生的共同機(jī)制可能涉及間質(zhì)纖維化和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。Hong等[35]通過(guò)芯片檢測(cè)模型組大鼠在不同時(shí)間點(diǎn)基因表達(dá)譜的變化來(lái)研究DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子KLF-15對(duì)腎小球系膜細(xì)胞的影響，結(jié)果表明KLF可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白E2F1的表達(dá)抑制腎小球系膜細(xì)胞的增殖，其可作為治療系膜增生性腎小球腎炎的一個(gè)靶點(diǎn)。

3 問(wèn)題與展望

基因芯片技術(shù)經(jīng)過(guò)近20余年的快速發(fā)展，已經(jīng)成為了一個(gè)非常穩(wěn)定可靠的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，并展現(xiàn)出其快速性、高效性、準(zhǔn)確性的優(yōu)勢(shì)。這一技術(shù)在腎臟疾病發(fā)生機(jī)制的研究及藥物治療靶點(diǎn)的篩選中發(fā)揮著重要作用，但仍存在一些問(wèn)題需要完善，比如，如何降低芯片的成本，如何簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)流程，提高檢測(cè)結(jié)果的特異性等。隨著研究的深入和這些問(wèn)題的不斷解決，基因芯片技術(shù)將在腎臟疾病的研究中發(fā)揮更重要的作用。

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