類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型在中醫(yī)藥研究中的進(jìn)展

張星華,杜小正*,王金海,袁 博,田 亮,朱博雯

(1.甘肅中醫(yī)學(xué)院, 甘肅 蘭州 730000; 2. 蘭州大學(xué)第二醫(yī)院 中醫(yī)科, 甘肅 蘭州 730000)

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類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型在中醫(yī)藥研究中的進(jìn)展

張星華1,杜小正1*,王金海2,袁 博1,田 亮1,朱博雯1

(1.甘肅中醫(yī)學(xué)院, 甘肅 蘭州 730000; 2. 蘭州大學(xué)第二醫(yī)院 中醫(yī)科, 甘肅 蘭州 730000)

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是以慢性滑膜炎為病變的全身性自身免疫疾病。目前RA的病因及發(fā)病機(jī)制仍不明確，尚缺乏有效的預(yù)防手段和根治辦法，動(dòng)物模型的研制是醫(yī)學(xué)科研的重要步驟，選擇與人RA相近的動(dòng)物模型是實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)。就近年來(lái)應(yīng)用于類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎( RA) 實(shí)驗(yàn)研究的動(dòng)物模型進(jìn)行簡(jiǎn)要概括，以期為RA 研究選擇理想的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ吞峁﹨⒖肌?/p>

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；動(dòng)物模型；病證結(jié)合；綜述

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是以慢性滑膜炎和血管炎為病理基礎(chǔ)的自身免疫性疾病。我國(guó)RA的患病率為0.2%～0.4%，RA不積極治療會(huì)引起關(guān)節(jié)畸形，嚴(yán)重者可喪失勞動(dòng)能力[1]。動(dòng)物模型為RA的研究提供了實(shí)驗(yàn)載體，病證結(jié)合模型的建立給中醫(yī)藥治療RA提供了新的實(shí)驗(yàn)思路，本文就近幾年常用的RA動(dòng)物模型進(jìn)行概述及歸納，以期為RA模型提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)模型

CIA模型是Trentham等[2]在1977年發(fā)現(xiàn)約50%的RA患者血清和關(guān)節(jié)滑液中存在著抗膠原的自身抗體，Ⅱ型膠原是一種與免疫系統(tǒng)隔絕的蛋白，但在某些病理?xiàng)l件下可作為一種自身抗原呈現(xiàn)出來(lái)，雞、牛、大鼠、小鼠的膠原均可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗Ⅱ型膠原抗體，根據(jù)這一理論，創(chuàng)建了CIA模型，CIA模型的病理特征、臨床表現(xiàn)及免疫學(xué)特點(diǎn)與RA極為接近，是目前國(guó)際比較公認(rèn)的RA模型。此模型制備[3]用0.1 mol/L的冰乙酸溶解天然牛Ⅱ型膠原(2g/L)，再與等體積的不完全佐劑(IFA)乳化混勻，以0.2 mL/只的劑量在大鼠背部和尾根部進(jìn)行皮內(nèi)多點(diǎn)注射免疫，1周后相同劑量加強(qiáng)注射。CIA大鼠[4]在注射部位會(huì)出現(xiàn)小的潰瘍，大鼠攝食、飲水量減少，毛發(fā)粗糙枯槁，腹瀉以及體重增長(zhǎng)遲緩等全身表現(xiàn)。活動(dòng)受限先是后足出現(xiàn)紅腫僵直癥狀，皮溫升高，隨后波及前足，且后足癥狀普遍比前足嚴(yán)重，大鼠行動(dòng)明顯遲緩，在注射4天后侵襲至對(duì)側(cè)足跖，雙側(cè)足跖腫脹，紅腫逐漸加重，蔓延至前足和尾根部，活動(dòng)受限約在致炎后第9天，加強(qiáng)免疫后大鼠出現(xiàn)關(guān)節(jié)畸形和限制性步態(tài)，致敏20天關(guān)節(jié)腫脹程度達(dá)高峰，關(guān)節(jié)炎指數(shù)積分最高，致炎28天后關(guān)節(jié)腫脹逐漸消退，但不會(huì)徹底消失。

研究發(fā)現(xiàn)[5-6]CIA模型大鼠的炎性反應(yīng)和足趾寬度、厚度、面積及關(guān)節(jié)積分存在較強(qiáng)的相關(guān)性，并與最后的病理變化呈正相關(guān)，足跖大小及關(guān)節(jié)積分可作為模型炎癥狀態(tài)的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)。關(guān)節(jié)炎積分指數(shù)與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)水平、微血管計(jì)數(shù)呈正相關(guān)，表明血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎血管翳形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。病理切片[7]顯示滑膜細(xì)胞水腫變性，細(xì)胞排列不整齊，3～5層明顯增生，滑膜組織中大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)聚集，以T、B淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為主；滑膜內(nèi)血管擴(kuò)張充血，血管內(nèi)膜變形增生，血管翳形成，纖維組織增生，嚴(yán)重者可見(jiàn)滑膜下骨和軟骨侵蝕破壞。光鏡下[8-9]可見(jiàn)滑膜細(xì)胞廣泛增生，排列疏散、紊亂，滑膜細(xì)胞層次增多；滑膜下層纖維結(jié)締組織增生，纖維素變性，膠原纖維沉著，滑膜脂肪墊水腫；大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)并呈灶性聚集，新生肉芽組織形成；軟骨細(xì)胞減少，可見(jiàn)變性、壞死，贅生物形成，血管增生明顯。影像學(xué)[10]顯示四肢關(guān)節(jié)軟組織對(duì)稱(chēng)性腫脹，骨皮質(zhì)變薄，骨小梁稀疏，關(guān)節(jié)間隙變窄，伴有骨質(zhì)侵蝕，嚴(yán)重者關(guān)節(jié)可發(fā)生融合，多以小關(guān)節(jié)破壞為主。

RA患者滑膜組織和滑膜液中含有大量T細(xì)胞，T細(xì)胞活化可釋放大量炎性細(xì)胞因子如IL-1、IL-7、TNF-a、IFN等，Ⅱ型膠原(CⅡ)激活T細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞，侵入滑膜組織，并在病變關(guān)節(jié)釋放炎性因子，隨后中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞趨化聚集，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)增加，形成血管翳。研究證實(shí)[11]T細(xì)胞受體(TCR)疫苗可誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)致病性T細(xì)胞表面抗原受體(TCR)的免疫應(yīng)答，選擇性殺傷致病性T細(xì)胞或使其活性消失，從病因上治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，但此疫苗受主要組織相容性抗原(MHC)限制，無(wú)法大批量生產(chǎn)，難以廣泛應(yīng)用于臨床。

2 佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis，AA) 模型

AA是細(xì)菌學(xué)家Freund[12]在20世紀(jì)50年代率先建立的免疫性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型，又稱(chēng)弗氏佐劑性關(guān)節(jié)炎。弗氏佐劑分為完全佐劑和不完全佐劑兩大類(lèi)，弗氏完全佐劑(CFA)是用液體石蠟與無(wú)水羊毛脂按2∶1比例混合的混合液體，高壓滅菌，加入80℃滅活1h的減毒卡介苗或干燥結(jié)核死菌合成。不加卡介苗的為不完全佐劑(IFA)。造模多數(shù)是在大鼠足趾皮內(nèi)注射弗氏完全佐劑(CFA)0.1mL致敏，但其他研究表明，0.15mL劑量可能是RA模型復(fù)制中的最佳注射量[13-14]。改良的弗氏完全佐劑[15]是選擇吐溫80(Tween 80)代替無(wú)水羊毛脂，液體石蠟和Tween 80以3︰1的比例混合均勻，高壓滅菌后4℃保存?zhèn)溆茫僮鲿r(shí)加入卡介苗(10g/L)、Ⅱ型膠原纖維(5g/L)配制成弗氏完全佐劑。改良弗氏完全佐劑致敏的大鼠關(guān)節(jié)炎出現(xiàn)時(shí)間和病理結(jié)構(gòu)變化與弗氏完全佐劑相似，但抗原特異性更強(qiáng)。另有研究[16]發(fā)現(xiàn)環(huán)瓜氨酸肽輔助完全弗氏佐劑致敏的關(guān)節(jié)炎大鼠與普通AA模型相比，在關(guān)節(jié)腫脹積分與病理形態(tài)變化方面沒(méi)有明顯差異，但血清IL-6、TNF-a、類(lèi)風(fēng)濕因子(RF)、抗環(huán)瓜氨酸肽(anti-CCP)均較AA模型顯著升高。說(shuō)明RA模型的建立不僅要從病理形態(tài)學(xué)上觀察，更應(yīng)結(jié)合RF、anti-CCP等血清學(xué)指標(biāo)綜合分析評(píng)價(jià)，表明CCP可以作為輔助劑用于RA模型的研究。AA[17]致炎后大鼠精神萎靡，體毛不光澤，飲食、活動(dòng)減少，蜷縮，大便稀溏，體重減輕。大鼠足趾部位均出現(xiàn)明顯紅腫僵硬，皮溫升高，AA大鼠致炎后15h，致炎側(cè)足腫脹達(dá)高峰，持續(xù)2～3天逐漸減輕，7～8天后再度腫脹并出現(xiàn)左膝關(guān)節(jié)腫脹，注射部位出現(xiàn)潰瘍并有跛行、拖退等現(xiàn)象。繼發(fā)病變于致炎后10天左右出現(xiàn)，表現(xiàn)為對(duì)側(cè)和前足腫脹，逐漸擴(kuò)展到前足跖趾關(guān)節(jié)、踝關(guān)節(jié)，活動(dòng)障礙明顯，28天后繼發(fā)側(cè)足爪腫脹開(kāi)始下降。病理切片[18]顯示關(guān)節(jié)腔內(nèi)纖維組織增殖明顯，淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞及巨噬細(xì)胞明顯浸潤(rùn)；滑膜細(xì)胞增生，形成明顯的肉芽組織，典型的淋巴濾泡形成；關(guān)節(jié)囊內(nèi)充血、水腫明顯，軟骨細(xì)胞溶解死亡，軟骨和骨骺破壞。

AA[19-20]大鼠關(guān)節(jié)局部和血清中IL-1、IL-6、TNF-a、INF-γ和一氧化氮(NO)等細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)的含量均明顯升高，可抑制骨髓紅細(xì)胞造血功能，出現(xiàn)類(lèi)似人RA貧血癥狀。AA大鼠白細(xì)胞明顯上升，表明白細(xì)胞參與并介導(dǎo)AA大鼠關(guān)節(jié)炎的形成與發(fā)展。AA大鼠[21]外周血IL-1β、TNF-α、巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)、褪黑素(MLT)的峰值均出現(xiàn)在夜間，可為臨床選擇合理的用藥時(shí)間提供依據(jù)。AA模型[22]對(duì)骨的破壞比較明顯，對(duì)軟骨的破壞沒(méi)有RA嚴(yán)重，不產(chǎn)生類(lèi)風(fēng)濕因子，對(duì)胃腸道、生殖系統(tǒng)、皮膚及眼睛均有影響。

AA模型發(fā)病機(jī)制[23]是分子模擬作用，結(jié)核桿菌的相對(duì)分子量是65ku熱休克蛋白( Hsp65) ，與AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨自身抗原Hsp60的分子結(jié)構(gòu)相似，可被同一株T細(xì)胞克隆所識(shí)別，激活原來(lái)處于靜止?fàn)顟B(tài)的針對(duì)以CⅡ抗原為主的各種自身抗原的淋巴細(xì)胞克隆，從而誘發(fā)關(guān)節(jié)的自身免疫反應(yīng)。

3 卵蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型

此模型制備[24]是濃度為4g/L的卵蛋白溶液與等量的弗氏完全佐劑(CFA)在1 500r/min快速混勻器下制成乳化劑，在家兔肩背部均勻選定6個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)皮下注射乳化劑溶液0.2mL。兩周后再以同樣的方法、劑量每點(diǎn)重復(fù)皮下注射1次。第2次免疫完成后7天，在家兔雙膝關(guān)節(jié)分別注入20g/L卵蛋白生理鹽水溶液0.4mL。24h關(guān)節(jié)直徑和表面溫度升高，關(guān)節(jié)直徑可增加32%，出現(xiàn)急性滑膜炎和大量滲出液，2周后關(guān)節(jié)腫脹逐漸減輕，恢復(fù)至平臺(tái)期。1～4周關(guān)節(jié)滑膜顯著增生，新生肉芽組織形成，滑膜細(xì)胞由1～3層增至6～30層，以中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、CD4+淋巴細(xì)胞為主。4周后關(guān)節(jié)出現(xiàn)軟骨的侵蝕和骨的破壞，軟骨細(xì)胞壞死并出現(xiàn)纖維化、軟骨下新骨形成，終致關(guān)節(jié)變形。光鏡下可見(jiàn)滑膜細(xì)胞大量增殖，排列不整齊，炎細(xì)胞大量浸潤(rùn)，纖維組織增生。該模型[25]是在皮下反復(fù)注射抗原，刺激家兔產(chǎn)生大量抗體，注入同一抗原后產(chǎn)生抗原-抗體-補(bǔ)體3(C3)免疫復(fù)合物，此復(fù)合物不僅在關(guān)節(jié)局部產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，還可以介導(dǎo)T細(xì)胞的免疫反應(yīng)，使得滑膜炎持續(xù)存在，滑膜增生，血管翳形成，侵犯軟骨后導(dǎo)致其變性和降解。卵蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型適合較大的關(guān)節(jié)進(jìn)行研究，病理形態(tài)學(xué)改變和人的類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相似，而且這種動(dòng)物模型對(duì)抗風(fēng)濕和抗炎藥物的反應(yīng)性也與人RA相似，但該模型的免疫學(xué)特征及病程變化與人RA有一定的差異，因此應(yīng)用該模型研究RA 有其特定的局限性。

4 病證結(jié)合模型

辨證論治是中醫(yī)的基本原則，證候是對(duì)疾病過(guò)程中病因、病性、病位、病勢(shì)的概括，證候是中醫(yī)辨證論治的基礎(chǔ)，是中醫(yī)藥干預(yù)的主體。因此，證候動(dòng)物模型是中醫(yī)藥開(kāi)發(fā)研究的載體，研制出符合中醫(yī)證候的動(dòng)物模型可真實(shí)反映中醫(yī)藥的功效和優(yōu)越性[26]。病證結(jié)合模型以西醫(yī)致病原理為基礎(chǔ)，將宏觀與微觀、整體論與分析論相結(jié)合，在證候生物學(xué)基礎(chǔ)未闡明的情況下是較為合適的研究模式[27]。

4.1 風(fēng)寒濕痹證模型

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為風(fēng)寒濕邪氣是痹證發(fā)病的外在條件，邪正交爭(zhēng)劇烈時(shí)RA出現(xiàn)關(guān)節(jié)紅腫熱痛的癥狀，熱邪是RA急性期的臨床反映，但很快就會(huì)消退。王安民等[28]將大鼠放入冷水中游泳后再制作膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型，建立了風(fēng)寒濕痹證動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)性增加。肖長(zhǎng)虹等[29]用玻璃鋁合金自制造模箱，用空調(diào)機(jī)控制箱體內(nèi)溫度，霧化器使?jié)穸染S持在100%，風(fēng)寒濕刺激溫度7～10℃，風(fēng)速18m/s，轉(zhuǎn)速4次/min，在此基礎(chǔ)上給予CIA造模，同時(shí)在關(guān)節(jié)面上涂擦葡萄球菌腸毒素B(SEB)，發(fā)現(xiàn)在SEB外抹前提下，風(fēng)寒濕刺激可升高RF、免疫球蛋白G(IgG)的含量，增加雄性CIA大鼠炎癥積分，表明痹證的發(fā)病條件不僅包括風(fēng)寒濕等邪氣刺激，還包括感染源或感染產(chǎn)物的存在，提示風(fēng)寒濕CIA協(xié)同SEB可作為風(fēng)寒濕痹證的模型。姜輝等[30]在大鼠右后足跖皮內(nèi)注射CFA 0.1mL，予以4級(jí)風(fēng)力，5～7℃冰水中站立20min造模。金祝秋等[31]發(fā)現(xiàn)風(fēng)寒濕痹證大鼠模型踝關(guān)節(jié)組織中前列腺素2(PGE2)的含量明顯比正常大鼠升高，并與關(guān)節(jié)腫脹呈正比。

4.2 脾虛證痹證模型

杜中平等[32]在大鼠腹腔注射利血平0.5mg/(kg·d)的基礎(chǔ)上加以Ⅱ型膠原誘發(fā)脾虛痹證的模型。研究發(fā)現(xiàn)大鼠出現(xiàn)精神疲憊，被毛干枯無(wú)光澤，蜷縮扎堆，活動(dòng)量和飲食減少，體重下降，便質(zhì)清稀等類(lèi)似脾虛的癥狀，脾虛證CIA大鼠關(guān)節(jié)損傷程度和關(guān)節(jié)紅腫程度均顯著加重，炎性指標(biāo)如IL-6、IL-10、IFN-γ、抗Ⅱ型膠原抗體含量明顯升高，表明脾虛證RA病證結(jié)合模型，能在一定程度上反映脾虛證RA患者的臨床特征，且造模方法簡(jiǎn)便，操作性高，可為脾虛證痹證模型提供有利的參考依據(jù)。肖誠(chéng)等[33]以大黃煎液25mL/(kg·d) 灌胃瀉下，加饑飽失常法制造脾虛模型，繼而予以Ⅱ型膠原免疫誘發(fā)CIA模型。結(jié)果顯示，脾虛證痹證大鼠體重明顯下降，出現(xiàn)納差、泄瀉癥狀，血清IFN-γ、 TNF-α含量明顯升高，病理切片觀察到滑膜明顯增生，周?chē)浗M織存在大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，血管翳形成，軟骨出現(xiàn)退行性變。

4.3 腎虛證痹證模型

王燕等[34]分別采用去勢(shì)法(即摘除雙側(cè)卵巢與睪丸)和羥基脲法375mg/(kg·d)灌胃制作腎虛動(dòng)物模型，然后在尾根部皮下注射O型膠原與不完全弗氏佐劑混合物的方法誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎。兩種腎虛證痹證大鼠均出現(xiàn)精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，體毛稀少，喜扎堆，大便清稀，肛周污穢等與腎虛相似的臨床癥狀，IL-6、IL-10及IFN-C水平均較CIA組明顯升高，腎虛CIA大鼠腎上腺環(huán)腺苷酸(cAMP)與環(huán)鳥(niǎo)苷酸(cGMP)比值明顯降低，抗O型膠原抗體含量明顯升高。

5 結(jié)語(yǔ)

RA是由T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病，目前RA動(dòng)物模型研制趨向于某一特定的因素，難以復(fù)制出與人RA 完全一致的動(dòng)物模型。病證結(jié)合動(dòng)物模型是RA在今后中醫(yī)藥研究中發(fā)展的必然方向，目前病證結(jié)合動(dòng)物模型只是簡(jiǎn)單的幾種因素的疊加，尚缺乏統(tǒng)一的造模方法和明確的造模效果判斷標(biāo)準(zhǔn)，因此需要借鑒現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的方法，在中醫(yī)理論指導(dǎo)下模擬中醫(yī)的病因、病性、病位、病勢(shì)，構(gòu)建符合西醫(yī)“病”和中醫(yī)“證”的病證結(jié)合模型，為今后RA的研究提供更可靠的疾病模型。

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(責(zé)任編輯：宋勇剛)

Advances in Animal Models with Rheumatoid Arthritis in TCM

Zhang Xinghua1，Du Xiaozheng1*，Wang Jinhai2，Yuan Bo1，Tian Liang1，Zhu Bowen1

(1.Gansu College of Traditional Chinese Medicine，Lanzhou 730000， China;2.Department of Traditional Chinese Medicine ,The Second Hospital of Lanzhou University, Lanzhou 730000, China)

Rheumatoid arthritis (rheumatoid arthritis, RA) is a autoimmune disease characterized by chronic synovitis . it is difficult to prevent and cure it,animal models is an important part of medical research，so selecting the pathogenesis of human RA similar animal model is particularly vital for research. In order to provide experimental model reference for RA study， this article summarizes animal models of rheumatoid arthritis (RA) for experimental studies in recent years.

Rheumatoid Arthritis; Animal Model; Disease and Syndrome

2015-01-22

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81260558)；甘肅省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(1208RJZA185)；甘肅省屬高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金(2012-4)

張星華(1991-)，女，甘肅中醫(yī)學(xué)院碩士研究生，研究方向?yàn)閭鹘y(tǒng)針刺手法治療免疫系統(tǒng)疾病。

杜小正(1973-)，男，甘肅中醫(yī)學(xué)院副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)閭鹘y(tǒng)針刺手法治療免疫系統(tǒng)疾病。Email：lz-duxiaozheng@163.com

R255.6

A

1673-2197(2015)12-0047-04

10.11954/ytctyy.201512018