孕婦外周血中胎兒游離DNA在產(chǎn)科中的應(yīng)用

程麗琴(綜述)，田春芳(審校)

(1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東 汕頭 518041; 2.深圳市第七人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 深圳 518081)

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孕婦外周血中胎兒游離DNA在產(chǎn)科中的應(yīng)用

程麗琴1△(綜述)，田春芳2※(審校)

(1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東 汕頭 518041; 2.深圳市第七人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 深圳 518081)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.05.011

通過(guò)檢測(cè)孕婦外周血中胎兒游離DNA來(lái)進(jìn)行無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷、妊娠相關(guān)性疾病診斷等是目前研究的熱點(diǎn)。在孕婦外周血中發(fā)現(xiàn)胎兒游離DNA主要是啟發(fā)于在腫瘤患者的外周血中發(fā)現(xiàn)具有腫瘤特征的游離DNA，并且證實(shí)這些游離DNA大多來(lái)自患者自身的腫瘤細(xì)胞[1]。1989年，Lo等[2]首先發(fā)現(xiàn)在母體血漿、血清中存在高水平的胎兒游離DNA。Rijnders等[3]通過(guò)對(duì)17例行體外受精或?qū)m腔內(nèi)人工受精的孕婦進(jìn)行實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)檢測(cè)SRY基因，發(fā)現(xiàn)最早在5周2 d即可檢測(cè)到SRY基因，7周時(shí)檢出率達(dá)80%，9周時(shí)檢出率達(dá)100%?，F(xiàn)將孕婦外周血中胎兒游離DNA在產(chǎn)科方面的應(yīng)用情況予以綜述。

1胎兒非整倍體疾病篩查

胎兒非整倍體異常是指胎兒1個(gè)體細(xì)胞內(nèi)染色體的數(shù)目增加或減少1條或數(shù)條形成的染色體數(shù)目異常；常見(jiàn)的胎兒非整倍體異常有唐氏綜合征、13三體綜合征、18三體綜合征以及性染色體病[4]。非整倍異?？蓪?dǎo)致出生缺陷，給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷方法有胚胎植入前遺傳診斷、絨毛穿刺取樣、羊膜腔穿刺、經(jīng)皮臍血穿刺技術(shù)和胎兒組織活檢，這些方法都具有創(chuàng)傷性，有發(fā)生感染、出血、流產(chǎn)、死胎等風(fēng)險(xiǎn)[5](164-165)。因此，從證實(shí)母體血漿中存在胎兒游離DNA以來(lái)，胎兒游離DNA的檢測(cè)及臨床應(yīng)用研究對(duì)非侵入性產(chǎn)前診斷技術(shù)產(chǎn)生了重大影響，現(xiàn)已應(yīng)用于臨床且易被孕婦所接受。2011年，Chiu等[6]進(jìn)行了753例大樣本基因測(cè)序，檢測(cè)21號(hào)染色體的靈敏度達(dá)100%，特異度達(dá)97.9%。2012年，Lau等[7]對(duì)108例孕婦血漿中游離DNA進(jìn)行高通量基因測(cè)序，平均妊娠期為12周之前，共32例胎兒染色體常規(guī)核型分析證實(shí)，其中唐氏綜合征11例，18三體綜合征10例，13三體綜合征2例，先天性卵巢發(fā)育不全綜合征(也稱Turner綜合征)(45，XO)8例，克氏綜合征(47XXY)1例，檢出率提高到100%，假陽(yáng)性率為0%。2012年，Bianchi等[8]利用大規(guī)模平行測(cè)序技術(shù)在2882例孕婦血漿中進(jìn)行胎兒染色體非整倍體的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)唐氏綜合征靈敏度為100%(89/89)，18三體綜合征靈敏度為97.2%(35/36)，13三體靈敏度為78.6%(11/14)，單倍體X靈敏度為93.8%(15/16)；此外，還檢測(cè)出其他性染色體異常(XXX,XXY,XYY)及常染色體異常2例(16號(hào)和20號(hào))，表明孕婦血漿中胎兒DNA檢測(cè)染色體異常靈敏度和特異度高。2013年，Huang等[9]對(duì)189例雙胎妊娠孕婦進(jìn)行母體血漿DNA大規(guī)模平行測(cè)序，成功檢測(cè)出9例唐氏綜合征和1例18三體綜合征，另1例18三體綜合征為正常胎和1例18三體綜合征胎兒未能檢出，檢測(cè)唐氏綜合征的特異度為100%，對(duì)胎兒18三體綜合征的靈敏度和特異度分別為50%、100%；進(jìn)一步研究表明，非侵入性產(chǎn)前診斷唐氏綜合征的雙胎妊娠具有高精確度，可以避免95%的侵入性產(chǎn)前診斷。

2單基因遺傳病篩查

單基因遺傳病是常見(jiàn)的出生缺陷之一，目前報(bào)道可利用孕婦外周血中游離DNA進(jìn)行父源性致病基因的非侵入性產(chǎn)前診斷。在β珠蛋白合成障礙性貧血的檢測(cè)中，Galbiati等[10]采用微電子芯片技術(shù)對(duì)32例孕婦進(jìn)行診斷，通過(guò)檢測(cè)7個(gè)常見(jiàn)的β珠蛋白突變得到100%的準(zhǔn)確度和98.3%的特異度。2012年，Sirichotiyakul等[11]利用孕婦血漿中胎兒游離DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)α珠蛋白合成障礙性貧血純合子基因突變，靈敏度為98.4%，假陽(yáng)性率為20.8%，利用這一技術(shù)可以避免79.2%的α珠蛋白合成障礙性貧血純合子行侵入性產(chǎn)前診斷。在軟骨發(fā)育不全、肌強(qiáng)直性營(yíng)養(yǎng)不良、先天性腎上腺皮質(zhì)增生和囊性纖維化中也有成功檢測(cè)的報(bào)道[12]。

3胎兒性別鑒定

在孕早期通過(guò)孕婦外周血中胎兒DNA進(jìn)行胎兒性別測(cè)定對(duì)排除性染色體相關(guān)疾病有重要意義，如X連鎖遺傳病，其致病基因在X染色體上，通過(guò)性別檢測(cè)可進(jìn)一步判定患X連鎖遺傳病的風(fēng)險(xiǎn)，指導(dǎo)妊娠[5]。1989年，Lo等[2]首次應(yīng)用巢式PCR技術(shù)在懷有男性胎兒的孕婦外周血中擴(kuò)增出Y染色體的特異性重復(fù)序列，并提出這一技術(shù)可以作為性相關(guān)基因疾病的產(chǎn)前診斷方法之一。Honda等[13]在81例孕婦中得到妊娠5～10周的血清樣本，先通過(guò)常規(guī)PCR檢測(cè)，檢出男性胎兒的總靈敏度為95%，在第7周后靈敏度達(dá)100%；后用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)5周孕齡的胎兒性別，靈敏度也接近100%。2011年，Zargari等[14]從80例妊娠6～10周的孕婦外周血漿中提取胎兒游離DNA，采用巢式PCR技術(shù)對(duì)男性胎兒Y染色體單拷貝SRY基因、多拷貝DYS14和DAZ基因序列進(jìn)行檢測(cè)，靈敏度為95.2%。

4胎兒血型檢測(cè)

母兒血型不合是我國(guó)新生兒溶血性疾病的主要原因。目前臨床上主要的診斷方法為夫婦血型檢查、血型抗體的測(cè)定、超聲檢查等，但最終確診尚需待新生兒期的檢查。2010年，施選性等[15]用健康孕婦血漿游離DNA檢測(cè)胎兒ABO血型，在46例樣本中，產(chǎn)前檢查能正確顯示胎兒血型的有38例，總檢出率為82.61%；待嬰兒出生后血清學(xué)檢測(cè)，總檢出符合率81.58%。2011年，馬紅麗等[16]對(duì)139例O型血孕婦外周血DNA檢測(cè)胎兒血型準(zhǔn)確度分析，新生兒出生前后血型檢測(cè)符合率為94.24%(131/139)，孕中期血型檢測(cè)符合率為91.95%(80/87)，孕晚期的血型檢測(cè)符合率為98.08%(51/52)。2011年，Sedrak等[17]對(duì)90例RhD陰性孕婦進(jìn)行研究，通過(guò)PCR擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)RhD基因序列和SRY基因序列診斷胎兒RhD血型和性別，診斷出61例RhD陽(yáng)性和29例RhD陰性胎兒，其中男37例，女53例；在胎兒RhD血型檢測(cè)中，妊娠前3個(gè)月靈敏度和診斷準(zhǔn)確度分別為93.5%和91.1%，到妊娠中期分別增加到100%和97.78%；在胎兒性別鑒定中，妊娠前3個(gè)月靈敏度為95.2%，診斷準(zhǔn)確度97.87%，到妊娠中期都增加到100%。2013年，Manzanares 等[18]通過(guò)定量PCR技術(shù)檢測(cè)8～13周妊娠的RhD陰性孕婦母體血漿中胎兒RhD基因型，與產(chǎn)后臍帶血表型進(jìn)行比較，一致性為98.2%；其中1例假陽(yáng)性和1例假陰性，檢測(cè)的特異度和靈敏度分別為97.5%和95%；RhD陰性孕婦在妊娠早期檢測(cè)可以避免不必要的產(chǎn)前預(yù)防。說(shuō)明在妊娠早期通過(guò)孕婦血漿中胎兒游離DNA檢測(cè)RhD血型是可行的、高度精確的。

5妊娠相關(guān)性疾病預(yù)測(cè)

5.1先兆早產(chǎn)早產(chǎn)兒各器官發(fā)育不完善，使其存活率下降，病殘率上升，因此有效預(yù)測(cè)并及時(shí)處理早產(chǎn)有重要意義。2012年，Jakobsen等[19]對(duì)876例孕婦進(jìn)行大規(guī)模研究，通過(guò)篩查檢測(cè)RhD基因，用一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)量化胎兒游離DNA的數(shù)量；發(fā)現(xiàn)在孕25周左右，體內(nèi)高水平的胎兒游離DNA與自發(fā)性早產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，在34周之前的早產(chǎn)，其孕婦外周血漿中的胎兒游離DNA水平升高15倍，認(rèn)為胎兒游離DNA檢測(cè)可用來(lái)預(yù)測(cè)自發(fā)性早產(chǎn)，作為篩查早產(chǎn)的指標(biāo)。

5.2妊娠期高血壓疾病妊娠期高血壓疾病是妊娠與血壓升高同時(shí)存在的一組疾病，可造成孕產(chǎn)婦和圍生兒死亡，但其病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確[5](64-65)。2002年，Lau等[20]通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)Y染色體上的SRY基因，發(fā)現(xiàn)孕婦外周血中胎兒游離DNA的水平在子癇前期組為521 gEq/mL，對(duì)照組為227 gEq/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.017)；在先兆子癇患者血漿中胎兒游離DNA 的半衰期為114 min，對(duì)照組的半衰期為28 min，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.007)；對(duì)照組在產(chǎn)后6 h胎兒游離DNA完全清除，有3例在產(chǎn)后2 h就下降為0 gEq/mL，而在先兆子癇組無(wú)產(chǎn)后6 h胎兒游離DNA下降為0 gEq/mL，認(rèn)為胎兒游離DNA的清除可能與潛在的病理異常(血管病變等)有關(guān)。2011年，鄔晉芳等[21]應(yīng)用甲基特異性PCR的原理及熒光定量PCR的方法，檢測(cè)孕婦外周血中u-maspin基因的含量，發(fā)現(xiàn)各孕期基因檢出含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中中孕是早孕的4.43倍，晚孕是早孕的5.13倍，輕度子癇前期是正常晚孕的2.39倍，重度子癇前期是正常晚孕的5.78倍；由此認(rèn)為，孕婦外周血中胎兒游離DNA的含量隨著孕周的增加而增加，在子癇前期患者中游離DNA含量隨著病情的加重而增加。2013年，Zamanpoor等[22]運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)孕婦外周血漿中Y染色體上的SRY基因水平，進(jìn)行中期妊娠(13～27周)及晚期妊娠(28～40周)基因水平定量檢測(cè)對(duì)比，發(fā)現(xiàn)妊娠期高血壓疾病組中期妊娠平均游離DNA水平(6.72 gEq/mL，n=3)較正常妊娠組(8.75 gEq/mL，n=8)低，統(tǒng)計(jì)分析差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.597)；而晚期妊娠平均游離DNA(245.23 gEq/mL，n=16)較正常妊娠組(49.77 gEq/mL，n=30)明顯升高(約升高492%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)；由此認(rèn)為，妊娠期高血壓疾病時(shí)肝、腎功能受損，影響循環(huán)中胎兒DNA的清除。檢測(cè)孕婦外周血中胎兒游離DNA可以作為潛在的篩查妊娠期高血壓疾病的指標(biāo)。

5.3妊娠期糖尿病妊娠期糖尿病是指在妊娠期首次出現(xiàn)或發(fā)現(xiàn)的糖尿病，對(duì)母兒都有較大危害[5](75)。近些年發(fā)病率有增高趨勢(shì)，但病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確，因此早期防治十分重要。2010年，湯冬玲[23]用血漿DNA抽提法提取62例妊娠中晚期孕婦外周血中胎兒游離DNA，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)兩組孕婦外周血胎兒DNA8水平；結(jié)果顯示，妊娠期糖尿病組孕婦外周血中胎兒游離DNA水平(均值212.31±80.95拷貝數(shù)/mL，n=32)明顯高于正常孕婦組(均值152.08±62.61拷貝數(shù)/mL，n=32)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；并且認(rèn)為，胎兒游離DNA水平的變化可作為輔助診斷及預(yù)防妊娠期糖尿病的一項(xiàng)有效指標(biāo)。而2013年，Zamanpoor等[22]提出了不同的結(jié)論，其運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)孕婦外周血漿中Y染色體上的SRY基因水平，進(jìn)行中期妊娠(13～27周)及晚期妊娠(28～40周)的基因水平定量檢測(cè)對(duì)比，發(fā)現(xiàn)妊娠期糖尿病組中期妊娠平均游離DNA水平(6.09 gEq/mL，n=8)較正常妊娠組(8.75 gEq/mL，n=8)低，晚期妊娠平均游離DNA水平(42.43 gEq/mL，n=32)較正常妊娠組(49.77 gEq/mL，n=30)低，統(tǒng)計(jì)分析差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.400和P=0.621)；認(rèn)為胎兒游離DNA水平會(huì)隨著胎齡的增加而增加，在妊娠期糖尿病時(shí)胎盤功能改變影響母胎血液循環(huán)。兩者有著完全不同的結(jié)論，因此妊娠期糖尿病方面的臨床應(yīng)用還需進(jìn)行大樣本的數(shù)據(jù)研究。

6小結(jié)

孕婦外周血中胎兒游離DNA作為一種新的生物標(biāo)志物，在產(chǎn)前診斷及妊娠相關(guān)性疾病的防治方面提供了新的思路，被用于預(yù)測(cè)臨床問(wèn)題，具有諸多優(yōu)勢(shì)，但目前僅部分應(yīng)用于臨床實(shí)踐中。為了進(jìn)一步廣泛臨床應(yīng)用，還需嚴(yán)格的臨床論證以及尋找更多的方法，以更好地應(yīng)用孕婦血漿中胎兒游離DNA來(lái)診斷遺傳病及妊娠相關(guān)性疾病(如稽留流產(chǎn)、死胎等)。近年來(lái)，分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，在孕婦外周血中胎兒游離DNA方面的研究將更加深入，其在產(chǎn)科中的臨床應(yīng)用也將更廣。

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摘要：檢測(cè)孕婦外周血中胎兒游離DNA，為無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷及妊娠相關(guān)性疾病的防治找到了新途徑，此種技術(shù)具有諸多優(yōu)勢(shì)。孕婦外周血中胎兒游離DNA測(cè)序可用于胎兒非整倍體疾病、胎兒?jiǎn)位蜻z傳病、胎兒血型的檢測(cè)、胎兒性連鎖疾病的產(chǎn)前診斷篩查；胎兒游離DNA水平的變化可作為一種新的生物指標(biāo)為妊娠相關(guān)性疾病的診斷及治療提供幫助。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，對(duì)孕婦外周血中胎兒游離DNA的研究將更加深入。

關(guān)鍵詞：胎兒游離DNA；孕婦血漿；產(chǎn)科

The Application of Fetal Cell-Free DNA in Maternal Peripheral Blood in ObstetricsCHENGLi-qin1,TIANChun-fang2.(1.MedicalCollegeofShantouUniversity,Shantou518041,China; 2.DepartmentofGynecologyandObstetrics,ShenzhenSeventhPeople′sHospital，Shenzhen518081,China)

Abstract:The detection of fetal cell-free DNA in maternal peripheral blood has opened up a new avenue of research for noninvasive prenatal diagnosis,prevention and treatment of pregnancy-related diseases,which has many advantages. The sequencing of fetal cell-free DNA in maternal peripheral blood can be used as prenatal disgnosis for fetal aneuploidy diseases and fetal monogenic hereditary diseases,the detection of fetal blood type and prenatal screening and diagnosis of sex-linked disorders.The changes of fetal cell-free DNA level can be used as a new index of clinical diagnosis and treatment on pregnancy related diseases.With the development of molecular biology,the study of fetal cell-free DNA will be deeper.

Key words:Cell-free fetal DNA; Maternal plasma; Obstetrics

收稿日期：2014-06-05修回日期：2014-09-07編輯：鄭雪

中圖分類號(hào)：R711

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-2084(2015)05-0796-03