植物SSR分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用

劉　何，辛　艷

（天津市種子管理站，天津 300060）

植物SSR分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用

劉何，辛艷

（天津市種子管理站，天津 300060）

目前，植物基因組學(xué)研究中SSR標(biāo)記的應(yīng)用較為活躍。該種標(biāo)記具有近于均勻覆蓋基因組、多態(tài)性高等優(yōu)點(diǎn)，在植物高密度遺傳圖譜繪制、DNA指紋圖譜構(gòu)建、種系純度與親緣關(guān)系鑒定以及植物遺傳進(jìn)化方面具有公認(rèn)的優(yōu)越性。不足之處在于位點(diǎn)特異性SSR標(biāo)記的建立先要根據(jù)微衛(wèi)星側(cè)翼序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，所以引物的高開發(fā)成本一直是非商業(yè)化物種SSR標(biāo)記遺傳研究的主要障礙，而且很多根據(jù)檢索得到的引物的多態(tài)性效果不佳，因此尋找一種快速廉價(jià)的引物篩選方法已成為SSR應(yīng)用的熱點(diǎn)問題。這幾年開發(fā)出了多種基于SSR標(biāo)記的方法，如ISSR、SAMPL等。

簡(jiǎn)單序列重復(fù)；微衛(wèi)星；DNA標(biāo)記；植物育種

植物相關(guān)的簡(jiǎn)單序列重復(fù)（Simple Sequence Repeats， SSR）標(biāo)記技術(shù)已用于小麥、水稻、大豆等主要大田作物和油菜、甘藍(lán)、黃瓜等多種園藝植物的基因組學(xué)研究［1-2］，該技術(shù)在植物高密度遺傳圖譜繪制、目的基因定位、指紋圖譜構(gòu)建、種系純度檢驗(yàn)及植物遺傳進(jìn)化研究等方面有公認(rèn)的優(yōu)越性［3-5］。

1　DNA分子標(biāo)記

分子水平的遺傳標(biāo)記是以DNA、蛋白質(zhì)等生物大分子多態(tài)性（指序列、結(jié)構(gòu)等特征存在多種形式）為基礎(chǔ)的標(biāo)記。而DNA標(biāo)記是因DNA發(fā)生缺失、插入、易位、倒位或由于存在長(zhǎng)短與排列不一的重復(fù)序列等機(jī)制而產(chǎn)生的多態(tài)性標(biāo)記。具有可遺傳、可識(shí)別性，可以是某個(gè)結(jié)構(gòu)基因的一部分或是DNA非編碼區(qū)序列［1］，亦或是經(jīng)限制性酶切處理產(chǎn)生的多態(tài)性DNA酶切片斷形式。

DNA分子標(biāo)記較其他標(biāo)記形式的優(yōu)點(diǎn)是：（1）基于DNA水平檢測(cè)，能揭示物種本質(zhì)而不受個(gè)體發(fā)育水平和環(huán)境條件干擾；（2）數(shù)量眾多，遍布于整個(gè)基因組，編碼區(qū)與非編碼區(qū)序列都可作為標(biāo)記，另外，DNA標(biāo)記利用基因組變異檢測(cè)的結(jié)果具有較高多態(tài)性，克服了單純利用基因標(biāo)記的缺點(diǎn)，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）、單核苷酸多態(tài)性（SNP）都基于DNA的點(diǎn)突變檢測(cè)［6-7］，SSR標(biāo)記能檢測(cè)到較高的單基因座位多態(tài)性［8］；（3）許多標(biāo)記表現(xiàn)共顯性遺傳，可區(qū)分個(gè)體的純合性與雜和性［1］。

2　SSR標(biāo)記技術(shù)

2.1SSR的構(gòu)成

SSR的發(fā)現(xiàn)最初始于動(dòng)物基因組［4］。之后，人們發(fā)現(xiàn)幾乎所有真核基因組中都存在重復(fù)序列（現(xiàn)在細(xì)菌DNA中也有發(fā)現(xiàn)［9］，也稱衛(wèi)星DNA［10］，DNA復(fù)性動(dòng)力學(xué)進(jìn)一步證明這類序列往往由大的重復(fù)單位嵌套若干小的乃至更小的串聯(lián)重復(fù)單位構(gòu)成。依據(jù)這些單位的重復(fù)程度，進(jìn)一步分為輕度重復(fù)序列、中度重復(fù)序列和高度重復(fù)序列［11］。

高度重復(fù)序列是簡(jiǎn)單重復(fù)單元的高度重復(fù)形式，重復(fù)序列的單位長(zhǎng)度可以為1～6個(gè)核苷酸［1，9］，重復(fù)次數(shù)可從幾百次到幾百萬次拷貝數(shù)，所以也稱為微衛(wèi)星DNA（microsatellite DNA）［11］或短的串聯(lián)重復(fù)序列（Short Tandemly Repeats，STRs）［12］。已知微衛(wèi)星序列的重復(fù)形式多樣，在基因組中近于均勻分布，其分布情況與基因組大小有關(guān)［9］，果蠅染色體著絲點(diǎn)附近的微衛(wèi)星有ACAAACT、ATAAACT、ACAAAATT等形式，拷貝數(shù)分別達(dá)1.1×107，3.6×107，3.6×107［11］。Skinner等在寄居蟹基因組中發(fā)現(xiàn)一種微衛(wèi)星形式為（TAGG）n［12］。植物中通過對(duì)擬南芥、小麥、水稻等研究，證明SSR在基因組中含量很豐富，已發(fā)現(xiàn)的微衛(wèi)星有（CA）n，（AT）n，（GC）n，（GATA）n，等等，其重復(fù)次數(shù)多在10～60之間［6］。最常見的為雙核苷酸重復(fù)（GA）n，（AC）n是小麥和水稻中最普遍的雙核苷酸重復(fù)形式。小麥中（AC）n拷貝數(shù)達(dá)3 000，（GA）n重復(fù)次數(shù)在6 000以上；水稻中（AC）n與（GA）n重復(fù)次數(shù)分別達(dá)1 000 和2 000以上。栽培型花生中常見的是（GA）n微衛(wèi)星［13］。植物中存在的三核苷酸重復(fù)、四核苷酸重復(fù)單位常見的有（AAG）n、（AAT）n，雙子葉與單子葉植物的微衛(wèi)星數(shù)量、分布都是不同的。植物葉綠體中也發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星的存在［6］。Toth等已對(duì)大量微衛(wèi)星類型及分布情況作了較細(xì)致的總結(jié)［9］。

由于SSR重復(fù)單位的差異，人們把微衛(wèi)星分為核心區(qū)（Core Sequences）與兩側(cè)的側(cè)翼序列。核心區(qū)由短的重復(fù)單位組成，每個(gè)單位的堿基數(shù)目一般不變。重復(fù)次數(shù)是高度變異的，不同個(gè)體可能差別很大，所以又稱為串聯(lián)重復(fù)數(shù)目變異（VNTR）多態(tài)性。通過評(píng)估VNTR的差異可實(shí)現(xiàn)對(duì)個(gè)體的識(shí)別［14］。根據(jù)重復(fù)單位的排列方式，Weber等將核心區(qū)分為完全型（Perfect）、不完全型（Imperfect）和復(fù)合型（Compound）。完全型微衛(wèi)星是由不中斷的重復(fù)單位構(gòu)成的；不完全型其重復(fù)序列中間有3個(gè)以下的非重復(fù)堿基，兩側(cè)不中斷的部分重復(fù)數(shù)大于3；復(fù)合型指兩類或兩類以上的串聯(lián)重復(fù)單位由3個(gè)連續(xù)的非重復(fù)堿基分隔開，但不中斷的重復(fù)單位的重復(fù)數(shù)不小于5［4］。核心區(qū)兩側(cè)為側(cè)翼區(qū)，其突變少，一般是單拷貝的結(jié)構(gòu)基因區(qū)。Toth等［9］報(bào)道真核基因組中位于內(nèi)元（ntron）、基因間隔區(qū)（Intergenic Region）等非編碼區(qū)中的SSR要多于功能基因區(qū)中的SSR，所以SSR與功能基因可能存在遺傳連鎖關(guān)系［5，15］。

關(guān)于SSR高變異性，目前主要有兩種假說：DNA聚合酶滑動(dòng)錯(cuò)配假說和不均等重組假說［9，11］。

SSR對(duì)于調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性、保護(hù)DNA完整性、特殊轉(zhuǎn)錄因子編碼、基因重組與基因組進(jìn)化有特殊意義［4，9］。

2.2SSR標(biāo)記

微衛(wèi)星的VNTR特性與高度變異易于形成多位點(diǎn)多態(tài)性或親子代特異性位點(diǎn)的多態(tài)性，通過這些不同的變異就可發(fā)現(xiàn)不同的SSR在不同種間甚至于不同個(gè)體間的差異。Jeffreys最初就提出利用真核DNA中的小衛(wèi)星串聯(lián)重復(fù)序列來預(yù)測(cè)個(gè)體的特異性［14］。另外，根據(jù)SSR與結(jié)構(gòu)基因的關(guān)系，使得SSR對(duì)于QTL定位、高密度遺傳圖譜構(gòu)建都有重要幫助。范云六等［16］用微衛(wèi)星標(biāo)記結(jié)合分離群體分組分析把R55小麥中的抗條銹病基因定位在染色體1BS上，證實(shí)該抗病基因來自圓錐小麥。劉亞萍等［17］用兩對(duì)引物定位了小麥抗條銹病基因Yr24，確定了其與SSR位點(diǎn)間的遺傳距離。

SSR標(biāo)記的基本原理為將生物個(gè)體微衛(wèi)星側(cè)翼序列DNA片斷克隆、測(cè)序，根據(jù)側(cè)翼序列人工合成引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將單個(gè)座位的微衛(wèi)星擴(kuò)增出來，產(chǎn)物具有簡(jiǎn)單序列重復(fù)長(zhǎng)度多態(tài)性（SSLP），每一擴(kuò)增位點(diǎn)代表該位點(diǎn)上的一對(duì)等位基因，通過高分辨率的聚丙烯酰胺凝膠電泳來區(qū)分該多態(tài)性。非特異性SSR標(biāo)記是利用核心序列制成的1個(gè)，2個(gè)或3個(gè)堿基組成的各10，15，30等次數(shù)的寡聚DNA探針與基因組文庫雜交，進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)Southern雜交，放射自顯影等步驟得到DNA指紋，實(shí)現(xiàn)對(duì)品系純度鑒定、雜交優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)等研究［15］，由于其簡(jiǎn)便易行，分析迅速，在實(shí)際中有廣泛應(yīng)用［17］。但該法不能確定單個(gè)位點(diǎn)的在基因組上的位置，不能用于基因定位研究且產(chǎn)生的譜帶過多，也不利于用計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析［14］。隨著毛細(xì)管電泳（Capillary Electrophoresis， CE）、多重PCR熒光標(biāo)記基因組掃描等新技術(shù)應(yīng)用，SSR標(biāo)記分析將更加快速便捷，同時(shí)檢測(cè)通量將大大提高。

SSR標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)在于：數(shù)量豐富，近于均勻覆蓋整個(gè)基因組，揭示的多態(tài)性高，尤其適于水稻［1］、花生、小麥［3］、黃瓜［2］等特殊基因組的檢測(cè)；共顯性遺傳；樣品DNA取樣少；另外每個(gè)位點(diǎn)由設(shè)計(jì)的引物順序決定，便于不同的實(shí)驗(yàn)室相互交流合作開發(fā)引物。正因如此，我國(guó)農(nóng)業(yè)部主管機(jī)構(gòu)已經(jīng)組織全國(guó)重點(diǎn)科研機(jī)構(gòu)制定了針對(duì)玉米、水稻、棉花等多種農(nóng)作物品種的SSR檢測(cè)技術(shù)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)或國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)并預(yù)計(jì)于2015推出新版標(biāo)準(zhǔn)及CE檢測(cè)平臺(tái)的全國(guó)統(tǒng)一的數(shù)據(jù)檢索信息庫以整合各地得出的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2.2.1SSR標(biāo)記的開發(fā)

SSR標(biāo)記基于PCR反應(yīng)，引物的準(zhǔn)確程度對(duì)于檢測(cè)結(jié)果非常重要［18］。位點(diǎn)特異性SSR標(biāo)記的建立先要構(gòu)建基因組文庫，并根據(jù)微衛(wèi)星側(cè)翼序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)［4，19］，所以高開發(fā)成本一直是非商業(yè)化物種常規(guī)SSR標(biāo)記研究應(yīng)用的主要障礙［5］。尋找快速廉價(jià)的引物篩選方法是SSR應(yīng)用的重點(diǎn)問題［12］。

常規(guī)標(biāo)記篩選法是酶切基因組DNA，構(gòu)建小片斷基因組文庫，用合成的探針與文庫雜交鑒定微衛(wèi)星序列［3］，然后進(jìn)行陽性克隆的測(cè)序與引物設(shè)計(jì)，所設(shè)計(jì)的引物必須經(jīng)過PCR并在對(duì)應(yīng)克隆和基因組DNA中擴(kuò)增出預(yù)計(jì)產(chǎn)物，工作量相當(dāng)大。McFadden等［4］利用常規(guī)法篩選出甘藍(lán)型油菜基因組文庫，對(duì)獲得的140個(gè)陽性克隆進(jìn)行測(cè)序，設(shè)計(jì)了21對(duì)引物，有17對(duì)得到理想產(chǎn)物，13對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物表現(xiàn)為多態(tài)性。Marion S.等從六倍體面包小麥基因組中開發(fā)出230對(duì)引物，擴(kuò)增出279個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，有20%的標(biāo)記檢測(cè)到1個(gè)以上的位點(diǎn)［3］。

引物的獲得也可由相關(guān)文獻(xiàn)［16］或DNA數(shù)據(jù)庫如EMBL、GenBank上進(jìn)行檢測(cè)［17］，大多數(shù)農(nóng)作物都可找到對(duì)應(yīng)SSR引物。但實(shí)際檢測(cè)效果證明此類引物的檢測(cè)效果往往不如用基因組篩選獲得引物的多態(tài)性好，例如從EST獲得SSR的多態(tài)性為54%；而基因組篩選得到的SSR引物多態(tài)性達(dá)到83.8%［4］。沈金雄等［20］報(bào)道根據(jù)檢索的196對(duì)引物，有75對(duì)可篩選出產(chǎn)物，其中僅40對(duì)能檢測(cè)出1個(gè)位點(diǎn)，最多可檢測(cè)出5個(gè)位點(diǎn)；一般需要2～3對(duì)引物才能把親本材料區(qū)分開。

總的看來，SSR標(biāo)記檢測(cè)的不足在于引物的開發(fā)，另外與AFLP相比，SSR座位突變率高，容易受到趨同變異引起的平行演化的影響，可能給親緣關(guān)系評(píng)估帶來誤差，SSR分析的結(jié)果也與植物遺傳背景密切相關(guān)。

2.2.2SSR標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展

近幾年已開發(fā)出多種基于SSR標(biāo)記的方法。簡(jiǎn)單重復(fù)間序列（Inter-Simple Sequence Repeat，ISSR），也稱錨定SSR（anchored simple sequence repeats）［21］，是直接利用被標(biāo)記的SSR引物，擴(kuò)增SSR間的單拷貝序列。引物設(shè)計(jì)時(shí)在5'端和3'端分別加上1-2個(gè)選擇性堿基，使得退火溫度提高，引物有更強(qiáng)的專一性，降低了雜帶的干擾，增加了擴(kuò)增特異性和試驗(yàn)結(jié)果可重復(fù)性［1］。ISSR引物的開發(fā)不需對(duì)側(cè)翼序列單獨(dú)測(cè)序，開發(fā)費(fèi)用降低［2］，它結(jié)合了RAPD與SSR的優(yōu)點(diǎn)，耗資更少。其引物可以在不同的物種間通用而不像SSR標(biāo)記一樣有較強(qiáng)的物種特異性；與RAPD和RFLP相比，ISSR揭示的多態(tài)性較高，可獲得幾倍于RAPD的信息量，精確度幾乎可與RFLP相媲美［1，19］。ISSR廣泛應(yīng)用于多種植物的指紋圖譜繪制。Prevol等［1］用4 個(gè)ISSR標(biāo)記對(duì)34個(gè)馬鈴薯品種檢測(cè)，有兩個(gè)引物完全可以將這些品種區(qū)分開。Ammiraju等［19］通過ISSR技術(shù)已找到與小麥籽粒大小相關(guān)的QTL。

選擇性擴(kuò)增微衛(wèi)星多態(tài)性位點(diǎn)（Selective Amplification of Microsatellite Polymorphism Loci，SAMPL）是SSR與AFLP相結(jié)合的分子標(biāo)記。它利用微衛(wèi)星序列設(shè)計(jì)引物，不需預(yù)先對(duì)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行克隆和測(cè)序。方法是在AFLP反應(yīng)的第二次擴(kuò)增時(shí)將一個(gè)具有3個(gè)選擇性堿基的AFLP引物與一個(gè)16-18 bp的人工SAMPL引物組合在一起，由于SAMPL引物的特異性［12，19］，在擴(kuò)增時(shí)，SAMPL引物5'端重復(fù)提供進(jìn)行嚴(yán)格復(fù)性的5'端錨定位點(diǎn)，因而該引物的3'端的第二個(gè)微衛(wèi)星就可延伸。根據(jù)不同的限制性內(nèi)切酶、SSR引物及選擇性接頭引物的組合，SAMPL所揭示的多態(tài)性幾乎是無限的。與其他方法相比，其結(jié)果可能最有價(jià)值［5，15］。另外還有RAPD與SSR結(jié)合的隨機(jī)擴(kuò)增微衛(wèi)星多態(tài)性法等等。

3　SSR標(biāo)記應(yīng)用

微衛(wèi)星標(biāo)記廣泛用于重要性狀基因定位及分子標(biāo)記輔助育種研究。已利用微衛(wèi)星標(biāo)記建立了與水稻抗白枯病基因、蠟質(zhì)基因，大豆抗條紋花葉病和大豆開花期基因連鎖的微衛(wèi)星標(biāo)記［1］。親緣關(guān)系鑒定方面，Manifesto等對(duì)105份小麥品種用位于不同染色體上的探針檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)親緣關(guān)系越近的品種，指紋譜的相關(guān)系數(shù)越高。郭旺珍等用SSR標(biāo)記對(duì)棉屬二倍體及四倍體種進(jìn)行遺傳多樣性分析，揭示出屬于D染色體組的擬似棉與其他D染色體組棉種的相似系數(shù)最低，A、D染色體組間相似系數(shù)很高［22］。韓麗娟等［23］在大豆疫霉菌研究中指出應(yīng)用SSR標(biāo)記確定生理小種間親緣關(guān)系是可行的。Pestson等利用18對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)113份二倍體粗山羊草進(jìn)行分析，認(rèn)為微衛(wèi)星標(biāo)記非常適于遺傳多樣性分析。Diwan等［1］用20個(gè)SSR位點(diǎn)成功地將17個(gè)用AFLP未能完全區(qū)分開來的栽培大豆分開。Weising等認(rèn)為對(duì)于品種鑒別來說，SSR標(biāo)記比RAPD等標(biāo)記更加優(yōu)越，獲得的資料便于在不同實(shí)驗(yàn)室間共享。

由于PCR-SSR標(biāo)記法比RFLP更易操作和宜于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，所以利用很少的微衛(wèi)星即可進(jìn)行遺傳多樣性分析及系統(tǒng)進(jìn)化研究。Peil等用該標(biāo)記鑒定了普通小麥種間的代換系。而Procunier等鑒定了四倍體小麥的異附加系。值得注意的是有些微衛(wèi)星雖然是位點(diǎn)特異性的，但并不具備相應(yīng)的部分同源性，與RFLP相比，所揭示的部分同源性是很低，因而在染色體的部分同源性鑒定及比較作圖中的應(yīng)用受到了一定限制。

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Q78

A

1002-0659（2015）05-0034-04

2015-07-08

天津市農(nóng)業(yè)局青年人才培育項(xiàng)目（201306）

主要作者簡(jiǎn)介：劉何（1978-），男，農(nóng)藝師，主要從事種子質(zhì)量檢驗(yàn)工作。E-mail：23120207@qq.com