蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)的新進(jìn)展

郭 睿綜述，劉全忠審校

（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院皮膚性病科，天津300052）

綜述

蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)的新進(jìn)展

郭 睿綜述，劉全忠審校

（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院皮膚性病科，天津300052）

蛋白質(zhì)相互作用；酵母雙雜交系統(tǒng)；串聯(lián)親和純化；噬菌體展示；免疫共沉淀；GST-Pull down；Far-Western blotting；熒光共振能量轉(zhuǎn)移；生物信息學(xué)

蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)基于蛋白質(zhì)的生物學(xué)原理，它們之間的相互作用決定了分子與細(xì)胞水平上作用機(jī)制，從而起到調(diào)控機(jī)體健康和疾病狀態(tài)的作用。此作用網(wǎng)絡(luò)對于復(fù)雜的多基因疾病的靶向治療領(lǐng)域的研究具有深遠(yuǎn)的意義[1]。本文著眼于酵母雙雜交系統(tǒng)、串聯(lián)親和純化、噬菌體展示、免疫共沉淀、GST-Pull down、Far-Western blotting、熒光共振能量轉(zhuǎn)移、生物信息學(xué)等蛋白質(zhì)相互作用研究方法，對其進(jìn)行比較分析并進(jìn)行綜述。

1 生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究技術(shù)

1.1 酵母雙雜交系統(tǒng)

1.1.1 原理 Fields和Song[2]首次在研究真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控時(shí)建立該系統(tǒng)。其理論基礎(chǔ)是基于GAL4轉(zhuǎn)錄激活因子的特性。GAL4轉(zhuǎn)錄激活因子是一種由兩個(gè)彼此分離但功能必需的結(jié)構(gòu)域組合而成，即DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA-BD）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（AD）。二者在臨近位置相互作用時(shí)可重建功能性轉(zhuǎn)錄因子。在MATCHMAKER酵母雙雜交系統(tǒng)（Y2H）中，誘餌蛋白表達(dá)融合到GAL4的DNA-BD，而獵物蛋白表達(dá)融合到GAL4 DNA-AD。當(dāng)誘餌和獵物蛋白相互作用時(shí)，DNA-BD與AD形成功能性轉(zhuǎn)錄因子，導(dǎo)致酵母報(bào)告基因表達(dá)的激活，通過檢測報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物可判斷兩種蛋白是否發(fā)生相互作用。此方法可以用來確定新的蛋白質(zhì)的相互作用，分析兩種已知蛋白的相互作用以及相互作用的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析[3-4]。

1.1.2 優(yōu)缺點(diǎn) 酵母雙雜交技術(shù)可以精確地分析已知蛋白間的相互作用，篩選編碼未知蛋白的基因，具有真實(shí)性、敏感性、高效性、廣泛性等特性。其自身也存在缺點(diǎn)，如易產(chǎn)生假陽性、假陰性等[5]。

1.1.3 應(yīng)用 You等[6]將wt-APP695與pBT3-SUC誘餌載體相結(jié)合形成pBT3-SUC-APP復(fù)合物，利用酵母雙雜交篩選系統(tǒng)和免疫共沉淀技術(shù)，證實(shí)在阿爾茨海默癥中，Staufen 1蛋白（STAU1）可與淀粉樣前體蛋白（APP）作用，由于Stau1屬于雙鏈RNA結(jié)合蛋白家族，在哺乳動物系統(tǒng)介導(dǎo)mRNA的降解，因此推測淀粉樣前體蛋白也可能參與mRNA調(diào)控。

1.2 串聯(lián)親和純化

1.2.1 原理 串聯(lián)親和純化理論基礎(chǔ)[7]是一個(gè)利用兩個(gè)親和標(biāo)簽不同時(shí)序來純化蛋白組件。TAP標(biāo)簽蛋白由Protein A、TEV蛋白酶可剪切序列和鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽（CBP）組成[8]。在第一步純化步驟中，TAP標(biāo)記的蛋白復(fù)合物通過第一個(gè)標(biāo)簽Protein A特異性結(jié)合到IgG瓊脂珠。此TAP標(biāo)簽標(biāo)記的蛋白質(zhì)成分可被TEV蛋白酶裂解。清洗之后用洗脫液（含TEV蛋白酶）分離Protein A標(biāo)簽使含有靶蛋白的復(fù)合物釋放。第二步親和步驟，該蛋白質(zhì)復(fù)合物通過第二個(gè)標(biāo)簽CBP固定于鈣調(diào)蛋白瓊脂珠。CBP-鈣調(diào)蛋白相互作用具有鈣依賴性，而鈣離子螯合劑用于第二步洗脫步驟來釋放最后的蛋白復(fù)合物。此分離純化的蛋白可通過串聯(lián)質(zhì)譜、免疫雜交等方法進(jìn)行鑒定分析。TAP-MS法已被證明在細(xì)菌、酵母和哺乳動物細(xì)胞以及多細(xì)胞生物如線蟲、果蠅和老鼠的蛋白質(zhì)相互作用研究中均有效[9]。

1.2.2 優(yōu)缺點(diǎn) TAP技術(shù)假陽性和假陰性水平低，與質(zhì)譜等其他技術(shù)聯(lián)用可大規(guī)模地研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)分子之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)。但TAP技術(shù)具有一定局限性：TAP標(biāo)簽的引入可能會影響靶蛋白和親和柱的結(jié)合；少數(shù)靶蛋白可能會在TEV蛋白酶處理過程中被破壞；細(xì)胞裂解過程有時(shí)會影響TAP標(biāo)簽表達(dá)[10]。

1.2.3 應(yīng)用 Campden[11]應(yīng)用TAP技術(shù)和質(zhì)譜分析技術(shù)在胞核和細(xì)胞裂解物中來確定結(jié)合Gβ1亞基的候選蛋白，證實(shí)異三聚體蛋白Gβγ亞基調(diào)節(jié)細(xì)胞活性的作用。

1.3 噬菌體展示 噬菌體展示技術(shù)是將外源性（多）肽表達(dá)在噬菌體顆粒表面上，再利用其配體的特異性親和力將有需要的蛋白質(zhì)或多肽篩選出來的技術(shù)。一個(gè)文庫的噬菌體顆?？杀磉_(dá)多種多樣的肽，用來選擇那些結(jié)合了所需的目標(biāo)。噬菌體展示技術(shù)已被應(yīng)用在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的抗原表位分析。特定的配體分離噬菌體庫可以用于治療目標(biāo)驗(yàn)證、設(shè)計(jì)藥物和疫苗的開發(fā)。噬菌體展示技術(shù)也可以和其他方法結(jié)合使用[12]。噬菌體展示技術(shù)難點(diǎn)在于是如何根據(jù)不同研究目標(biāo)和目的基因特征來采用相應(yīng)的噬菌體，選擇相應(yīng)展示位點(diǎn)和錨定蛋白以及選擇設(shè)計(jì)定位展示在噬菌體表面錨定蛋白的N端或是C端等，隨著遺傳學(xué)和基因工程學(xué)的發(fā)展，噬菌體展示技術(shù)會慢慢攻克其難點(diǎn)[13-14]。

1.4 免疫共沉淀 免疫共沉淀是確定新蛋白間相互作用或確定已知蛋白質(zhì)形成的復(fù)合物的最廣泛使用的方法之一。原理是利用抗原抗體特異性結(jié)合以及細(xì)菌的Protein A或G特異性地結(jié)合到免疫球蛋白的Fc片段的現(xiàn)象。操作方法是將目標(biāo)蛋白與帶標(biāo)簽蛋白的特異性抗體結(jié)合?？贵w結(jié)合蛋白以及任何結(jié)合到目標(biāo)蛋白的蛋白都可以用樹脂沉淀，未結(jié)合到目標(biāo)蛋白的蛋白可被洗滌樣品洗脫。由此產(chǎn)生免疫復(fù)合物，然后通過免疫印跡分析，以研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用[15]。此方法不適用于大規(guī)模篩查相互作用蛋白，但其優(yōu)勢在于能確定在生理?xiàng)l件下細(xì)胞或組織內(nèi)是否存在與目的蛋白能夠相結(jié)合并作用的蛋白質(zhì)[16]。

1.5 GST-Pull down

1.5.1 原理 使用GST融合蛋白的下拉技術(shù)或親和沉淀測定法已成為最常見用來測定興趣蛋白（誘餌蛋白）是否結(jié)合新蛋白質(zhì)的方法之一。目的蛋白溶液過柱后，獵物蛋白會結(jié)合于瓊脂珠或GST本身，洗脫結(jié)合物后通過SDS-PAGE電泳分析[17]。

1.5.2 優(yōu)缺點(diǎn) GST-pull down是在體外直接驗(yàn)證蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的最常見的方式，能驗(yàn)證與已知融合蛋白質(zhì)相互作用的未知蛋白并且能驗(yàn)證兩已知蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。該方法特異性較強(qiáng)，能減少一定的假陽性率[18]。但該方法不適用于大規(guī)模篩查相互作用的蛋白，除此之外，活性融合蛋白的量及避免內(nèi)源性誘餌蛋白干擾是該方法成功的關(guān)鍵[16]。

1.5.3 應(yīng)用 Rab5蛋白是所有的真核細(xì)胞早期內(nèi)涵體融合和內(nèi)吞作用的主要調(diào)節(jié)器。Qi等[19]進(jìn)行Rab5活性測定，采用GST融合蛋白結(jié)合Rab5效應(yīng)器如Rabaptin-5或Rabenosyn-5，證實(shí)EEA1特異結(jié)合GTP結(jié)合的Rab5。

1.6 Far-Western blotting Far-Western Blotting是研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的一種簡便方法，是將目標(biāo)蛋白（獵物蛋白）固定在膜上，然后用非抗體蛋白（誘餌蛋白）檢測。此方法檢測蛋白質(zhì)基于蛋白質(zhì)探針結(jié)合位點(diǎn)的存在或缺失。當(dāng)特定的模塊化蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域作為探針時(shí)，這種方法可以用來研究蛋白質(zhì)間相互作用，如參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的生物過程特性，包括翻譯后修飾調(diào)節(jié)作用[20]。

1.7 蛋白質(zhì)芯片 蛋白質(zhì)芯片是指將蛋白質(zhì)或多肽等固定于支持介質(zhì)表面，用于樣品成分和蛋白質(zhì)之間相互作用的分析[21]，具有高通量、高信噪比等特點(diǎn)，可有效減少藥物研發(fā)周期并提高醫(yī)療診斷效率。目前存在的問題是如何高通量地制造純化高親和性的探針[22]。

1.8 雙分子熒光互補(bǔ) 原理是將熒光蛋白在特定的位點(diǎn)切開，形成不發(fā)熒光的N和C端2個(gè)多肽，2個(gè)片段在細(xì)胞內(nèi)共表達(dá)或體外混合時(shí)，不能自發(fā)組裝成完整的熒光蛋白。但是，當(dāng)這2個(gè)熒光片段分別融合到一組有相互作用的目標(biāo)蛋白上，由于目標(biāo)蛋白質(zhì)的相互作用重新構(gòu)建成完整的具有活性的熒光蛋白分子，受到激發(fā)后發(fā)射出特定波長熒光，可以快速、直觀地檢測目標(biāo)蛋白是否具有相互作用[23-24]。

2 生物物理學(xué)研究技術(shù)

2.1 熒光共振能量轉(zhuǎn)移 熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理是兩種蛋白質(zhì)（bait蛋白，prey蛋白）分別綴合有供體和受體熒光團(tuán)，當(dāng)它們彼此相互作用，且距離比100 ?（10 nm）更接近時(shí)，則可誘導(dǎo)FRET信號[25]。FRET結(jié)合顯微鏡使用，具有高時(shí)間和空間分辨率，可檢測特定的亞細(xì)胞組分來研究蛋白相互作用的動力學(xué)。FRET顯微鏡技術(shù)已成為檢測體內(nèi)兩蛋白直接結(jié)合的相互作用的有力手段[26-27]。

2.2 表面等離子共振分析 當(dāng)入射光的光子撞擊金屬表面時(shí)發(fā)生表面等離子體共振（SPR）。在一定入射角時(shí)，部分光能可通過金屬涂層與金屬表面層的電子相耦合，從而達(dá)到激發(fā)態(tài)，這種電子運(yùn)動被稱為等離子體。在SPR生物傳感器中，探針首先被固定到傳感器表面。當(dāng)目標(biāo)分子的溶液流入并與該表面相接觸，探針-靶點(diǎn)通過親和相互作用相結(jié)合時(shí)，會引起SPR傳感器表面折射率的增加，導(dǎo)致共振角的改變，通過軟件檢測處理這些信號從而得到最終分析結(jié)果。該技術(shù)具有測量靈敏度高，無需標(biāo)簽修飾，實(shí)時(shí)高效測定相互作用等特點(diǎn)[28]。利用SPR生物傳感器等研究可以應(yīng)用于如下方面：（1）SPR對特定的生物樣本的最有效的親和分離所需的固定化條件的選擇。（2）SPR結(jié)合質(zhì)譜法進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定。（3）基于SPR的固定化配體蛋白的鑒定以及相互作用的驗(yàn)證[29]。

2.3 其他 原子作用力顯微技術(shù)、等溫滴定熱分析技術(shù)、核磁共振譜分析技術(shù)、熒光偏振實(shí)驗(yàn)技術(shù)等相關(guān)技術(shù)各具其特性，豐富了生物物理學(xué)在分析蛋白相互作用中的方法。

3 生物信息學(xué)研究技術(shù)

蛋白質(zhì)之間要發(fā)生相互作用必須要有相應(yīng)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，包括接觸面的互補(bǔ)性、結(jié)合特異性和親和力等[30]。生物信息學(xué)技術(shù)，包括蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)和結(jié)構(gòu)預(yù)測等方法可以來預(yù)測蛋白質(zhì)相互作用。主要方法有同源建模、多體串線法和計(jì)算機(jī)模擬分子對接等。

4 展望

蛋白質(zhì)相互作用及作用網(wǎng)絡(luò)已成為越來越熱門的課題。目前各種研究方法均有優(yōu)勢與不足。相信通過對現(xiàn)有技術(shù)的改進(jìn)、不同技術(shù)的結(jié)合以及新技術(shù)的創(chuàng)新，將會使蛋白質(zhì)相互作用研究越來越豐富、準(zhǔn)確。

[1] Safari-Alighiarloo N,Taghizadeh M,Rezaei-Tavirani M,et al. Protein-protein interaction networks(PPI)and complex diseases[J]. Gastroenterol Hepatol bed to bench,2014,7(1)：17

[2] Fields S,Song O.A novel genetic system to detect protein-protein interactions[J].Nature,1989,340(6230)：245

[3] Maple J,M?ller S G.Yeast two-hybrid screening[J].Methods Mol Biol,2007,362(362)：207

[4]吳娟，錢凱，楊澤峰.酵母雙雜交系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J].安慶師范學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2005,11(2)：59

[5]崔紅軍，魏玉清.酵母雙雜交系統(tǒng)及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,43(13)：45

[6] Yu Y,Li Y,Zhang Y.Screening of APP interaction proteins by DUALmembrane yeast two-hybrid system[J].Int J Clin Exp Pathol, 2015,8(3)：2802

[7] Li Y.The tandem affinity purification technology：an overview[J]. Biotechnol Lett,2011,33(8)：1487

[8] Rigaut G,Shevchenko A,Rutz B,et al.A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration[J].Nat Biotechnol,1999,17(10)：1030

[9] V?lkel P,Le Faou P,Angrand P O.Interaction proteomics：characterization ofprotein complexesusing tandem affinity purification-mass spectrometry[J].Biochem Soc Trans,2010,38(4)：883

[10]吳麗民，劉美龍，劉麗華.串聯(lián)親和純化(TAP)技術(shù)的研究進(jìn)展[J].海峽藥學(xué),2009,21(1)：1

[11]Campden R,Pétrin D,Robitaille M,et al.Tandem affinity purification to identify cytosolic and nuclear gβγ-interacting proteins[J].Methods Mol Biol,2015,1234(1234)：161

[12]Pande J,Szewczyk M M,Grover A K.Phage display：concept, innovations,applications and future[J].Biotechnol Adv,2010,28(6)：849

[13]孟繁梅，張朝輝，艾云燦.噬菌體展示技術(shù)系統(tǒng)發(fā)展進(jìn)展[J].遺傳, 2011,33(10)：1113

[14]Roncolato E C,Campos L B,Pessenda G,et al.Phage display as a novel promising antivenom therapy：a review[J].Toxicon,2015,93 (93)：79

[15]Takahashi Y.Co-immunoprecipitation from transfected cells[J]. Methods Mol Biol,2015,1278(1278)：381

[16]涂占晗，林旭.蛋白質(zhì)相互作用研究的常用方法進(jìn)展及比較[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥,2012,19(14)：18

[17]Luo L,King N P,Yeo J C,et al.Single-step protease cleavage elution for identification of protein-protein interactions from GST pull-down and mass spectrometry[J].Proteomics,2014,14(1)：19

[18]Wissmueller S,Font J,Liew C W,et al.Protein-protein interactions：analysis of a false positive GST pulldown result[J].Proteins,2011,79 (8)：2365

[19]Qi Y,Liang Z,Wang Z,et al.Determination of Rab5 activity in the cell by effector pull-down assay[J].Methods Mol Biol,2015,1298 (1298)：259

[20]Jadwin J A,Mayer B J,Machida K.Detection and quantification of protein-protein interactions by far-western blotting[J].Methods Mol Biol,2015,1312(1312)：379

[21]陳藝心，趙樹銘.蛋白質(zhì)芯片構(gòu)建技術(shù)的研究進(jìn)展[J].國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2013,34(8)：989

[22]Liao W,Guo S,Zhao X S.Novel probes for protein chip applications [J].Front Biosci,2006,11(11)：186

[23]沈珂，吳群英，蔣曉山.雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)在蛋白質(zhì)相互作用研究中的應(yīng)用[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新,2015,330(12)：132

[24]Miller K E,Kim Y,Huh W K,et al.Bimolecular fluorescence complementation(BiFC)analysis：advances and recent applications for Genome-Wide interaction studies[J].J Mol Biol,2015,427(11)：2039

[25]Sinha C,Arora K,Moon C S,et al.F?rster resonance energy transfer -an approach to visualize the spatiotemporalregulation of macromolecular complex formation and compartmentalized cell signaling[J].Biochim Biophys Acta,2014,1840(10)：3067

[26]Mattheyses A L,Marcus A I.F?rster resonance energy transfer (FRET)microscopy for monitoring biomolecular interactions[J]. Methods Mol Biol,2015,1278：329

[27]Sun Y,Rombola C,Jyothikumar V,et al.F?rster resonance energy transfer microscopy and spectroscopy for localizing protein-protein interactions in living cells[J].Cytometry A,2013,83(9)：780

[28]Nguyen H H,Park J,Kang S,et al.Surface plasmon resonance：a versatile technique for biosensor applications[J].Sensors(Basel), 2015,15(5)：10481

[29]Ivanov A S,Medvedev A E.Optical surface plasmon resonance biosensors in molecular fishing[J].Biomed Khim,2015,61(2)：231

[30]黃浩，陳臨溪.生物信息學(xué)方法在預(yù)測蛋白質(zhì)相互作用中的應(yīng)用[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新,2010(36)：179

（2015-08-05收稿）

Q7

A

1006－8147（2015）06-0542-03

郭睿(1991-)，男，博士在讀，研究方向：皮膚性病學(xué);通信作者：劉全忠，E-mail:liuquanzhong@medmail.com.cn。