高效液相色譜法測(cè)定高尿酸血癥動(dòng)物模型飼料中嘌呤的含量

崔 博，黃國(guó)偉，王 璇，賽 娜，曹德慶

（天津醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系，天津300070）

論著

高效液相色譜法測(cè)定高尿酸血癥動(dòng)物模型飼料中嘌呤的含量

崔 博，黃國(guó)偉，王 璇，賽 娜，曹德慶

（天津醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系，天津300070）

目的：建立飼料中嘌呤含量的高效液相色譜檢測(cè)方法。方法：采用70%高氯酸在100℃水浴60 min過濾膜；Waters Atlantis T3色譜柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）；流動(dòng)相為10 mmol·mL-1甲酸銨（pH3.6）-甲醇（99∶1）；流速1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：30℃。結(jié)果：各嘌呤在0.01～20 g·mL-1的濃度范圍內(nèi)線性良好，平均回收率為90.82%～99.43%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差＜4.6。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確可靠，適用于飼料中嘌呤含量的檢測(cè)。

飼料；嘌呤；高效液相色譜法

嘌呤為有機(jī)化合物，是核酸的重要組成成分，在體內(nèi)分解代謝生成尿酸排出體外。通過日常飲食中攝取的嘌呤占20%，但極少為人體利用，幾乎全部轉(zhuǎn)化成尿酸。體液中嘌呤和尿酸含量是代謝不平衡的標(biāo)志[1]，嘌呤代謝紊亂和（或）尿酸排泄減少會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)血尿酸水平升高而引起一系列代謝性疾病[2]，如痛風(fēng)。目前，高尿酸血癥動(dòng)物模型的復(fù)制方法多為在模型動(dòng)物飼料中摻入尿酸或尿酸前體物質(zhì)，以復(fù)制人高嘌呤飲食導(dǎo)致血尿酸增高，對(duì)于指導(dǎo)人類預(yù)防疾病發(fā)生有重要意義。故模型動(dòng)物攝入飼料中嘌呤含量的定性及定量檢測(cè)是必不可少的，食品中嘌呤含量檢測(cè)最常用的方法是高效液相色譜法[3]，但國(guó)內(nèi)常見一種特定組分或與食品中其它成分同時(shí)檢測(cè)，少見飼料中4種嘌呤含量檢測(cè)的文獻(xiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)通過探討流動(dòng)相的選擇及水解條件的優(yōu)化，建立飼料中4種嘌呤含量同時(shí)檢測(cè)的方法，以期為相關(guān)代謝性疾病研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與藥品

1.1.1 儀器 高效液相色譜儀配紫外檢測(cè)器(美國(guó)Waters公司)；Seven Easy S20 pH計(jì)(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；BSA224S電子分析天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；KQ-250E型醫(yī)用超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；水浴鍋（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）。

1.1.2 藥品 腺嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤購(gòu)自Sigma公司，純度＞99%；鳥嘌呤購(gòu)自Fluka公司，純度＞99%；甲醇，色譜純購(gòu)自霍尼韋爾公司；磷酸、甲酸、高氯酸為優(yōu)級(jí)純，購(gòu)自天津博迪化工有限公司；甲酸銨為分析純，購(gòu)自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；氫氧化鈉、磷酸二氫鉀為分析純，購(gòu)自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；樣品為大鼠成長(zhǎng)飼料，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；試驗(yàn)用水均為重蒸水。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Waters Atlantis T3色譜柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）；流動(dòng)相：甲酸銨(pH3.6)-甲醇(99∶1)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液的配置 分別準(zhǔn)確稱取腺嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤、鳥嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品各0.01g置10mL量瓶中，用1mol·L-1NaOH溶液溶解，重蒸水定容至10mL，配置成濃度為1g·L-1的儲(chǔ)備液，4℃保存。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配置 精密量取1 g·L-1儲(chǔ)備液適量，分別置于10mL瓶中，用重蒸水稀釋定容，配置成各含嘌呤0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、5、20 μg·mL-1系列標(biāo)準(zhǔn)液，搖勻備用。

1.2.4 樣品的處理 取0.1～0.2 g粉碎樣品置于10 mL玻璃管中，向其加入1 mL 70%高氯酸溶液，混勻后100℃水浴60 min迅速冷卻，7 mol·L-1KOH調(diào)pH至7后再用0.5%甲酸調(diào)pH至3.6，流動(dòng)相定容至5 mL，充分混勻后過0.22 μm濾膜待測(cè)。

1.2.5 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 分別吸取上述系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣10 μL分析，即得一系列色譜數(shù)據(jù)。以各自的峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性分析。分別向高效液相色譜儀進(jìn)入單一標(biāo)準(zhǔn)品，在“1.2.1”條件下進(jìn)樣10 μL分析，所得各單一標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間，即為該標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間。

1.2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一樣品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD。

1.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精確稱取樣品，按樣品處理方法操作，在“1.2.1”色譜條件下，分別在0、4、8、12 h內(nèi)注入高效液相色譜儀，測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD。

1.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精確稱取樣品6份，按樣品處理方法操作，在1.2.1色譜條件下，各取10 μL進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD。

1.2.9 回收率試驗(yàn) 精密稱取樣品0.1 g，按其所含每種嘌呤量0.5倍、1倍、2倍加入各標(biāo)準(zhǔn)品溶液中，使其成為高中低3種濃度，經(jīng)樣品前處理后進(jìn)樣測(cè)定，每個(gè)濃度進(jìn)樣3次取均值和標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算RSD。

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適用性 由色譜圖可以看出，在上述色譜條件下，出峰情況良好，各嘌呤組分得到有效分離，出峰順序?yàn)轼B嘌呤、腺嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤。保留時(shí)間依次約為9.7、10.1、10.8、13.1 min（圖1），樣品在此保留時(shí)間也出現(xiàn)相同的峰，與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均大于16 000（圖2），陰性對(duì)照品在相應(yīng)位置無(wú)影響（圖3）。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 按“1.2.1”條件測(cè)定，以各嘌呤峰面積為縱坐標(biāo)，相應(yīng)濃度為橫坐標(biāo)，繪制各嘌呤標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程如下：鳥嘌呤，Y=34 544X+229.6（r=1，n=8）；腺嘌呤，Y=49 080X-246.72（r=0.999，n= 8）；次黃嘌呤Y=42 392X+818.4（r=0.999，n=8）；黃嘌呤，Y=26 694X-144.77（r=0.999，n=8）。各嘌呤在0.01～20 μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，最低檢測(cè)限為0.01 μg·mL-1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

圖2樣品色譜圖

圖3 陰性對(duì)照色譜圖

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 樣品處理后分別在0、4、8、12 h進(jìn)樣，4種嘌呤峰面積的RSD依次為1.88%、1.82%、12.40%、11.38%，處理液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 精確稱取樣品6份，按樣品處理方法操作進(jìn)樣，樣品中4種嘌呤峰面積的RSD依次為1.90%、1.26%、6.01%、4.98%，重復(fù)性良好。

2.5 精密度試驗(yàn)結(jié)果 平行測(cè)定6次，測(cè)定4種嘌呤峰面積RSD為依次為1.37%、1.33%、5.20%、4.50%，精密度測(cè)試良好，符合要求。

2.6 回收率試驗(yàn)結(jié)果 測(cè)定樣品的平均回收率依次為94.3%、99.43%、90.82%、97.15%，測(cè)定峰面積RSD依次為4.2、2.8、4.6、1.8。加樣回收結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.7 樣品含量測(cè)定結(jié)果 稱取0.1 g樣品處理后，按“1.2.1”條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得的峰面積帶入回歸方程，結(jié)果顯示該飼料中鳥嘌呤含量為0.501 0 mg·g-1，腺嘌呤0.326 2 mg·g-1，次黃嘌呤0.001 4 mg·g-1，黃嘌呤0.005 1 mg·g-1。

3 討論

3.1 飼料中嘌呤含量測(cè)定意義 隨著飲食結(jié)構(gòu)的改變，高尿酸血癥和痛風(fēng)的發(fā)病率正逐年上升，研究表明膳食和營(yíng)養(yǎng)因素在痛風(fēng)患者的發(fā)生、治療中都有著重要作用。為闡明二者之間的關(guān)系，許多學(xué)者做出了研究：周道遠(yuǎn)[4]、徐慧靜[5]使用飼料中添加氧嗪酸鉀鹽或酵母浸粉的方法，在2～3周內(nèi)建立高尿酸血癥模型，通過在飼料中加入不同劑量海參皂苷進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)低劑量和高劑量組可抑制肝臟黃嘌呤氧化酶、腺苷脫氨酶活性，改善高尿酸血癥；臺(tái)灣學(xué)者發(fā)現(xiàn)酪蛋白聯(lián)合紅花籽油飼喂大鼠有減輕高尿酸血癥腎損害的作用，大豆蛋白聯(lián)合紅花籽油飼喂大鼠可降低血清尿酸和膽固醇[6]，但尚無(wú)法定量明確飼料中的嘌呤含量與高尿酸血癥的關(guān)系。故本試驗(yàn)建立高尿酸血癥動(dòng)物模型飼料中嘌呤含量檢測(cè)方法，對(duì)于明確痛風(fēng)、高尿酸血癥等疾病動(dòng)物模型的病因以及膳食預(yù)防和治療有重要意義。

3.2 測(cè)定方法的選擇 食品中嘌呤測(cè)量主要有高效液相色譜法[3，7]、毛細(xì)管電泳法[8]、氣相色譜法[9]、偶聯(lián)酶催化分光光度法[10]、液相色譜法、離子色譜法等。毛細(xì)管電泳法靈敏度低；氣相色譜法用于單一組分測(cè)定，且需與質(zhì)譜聯(lián)用確定結(jié)果；本試驗(yàn)對(duì)于飼料中多嘌呤進(jìn)行定量檢測(cè)，未涉及酶催化，故選用高效液相色譜法。

3.3 流動(dòng)相的選擇 考慮到4種嘌呤的柱效和分離情況，曾選擇甲醇-水（1∶1）、甲醇-水（5∶95）為流動(dòng)相，結(jié)果次黃嘌呤和鳥嘌呤不能分離；選擇磷酸二氫鉀（pH3.6）為流動(dòng)相，4種峰能夠完全分離，出峰順序是鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤、腺嘌呤，出峰時(shí)間依次為11.4、11.9、13.8、16.9 min，與凌云等[11]的研究結(jié)果相同；選擇甲酸銨-甲醇（99∶1）為流動(dòng)相，4種峰分離度好，出峰順序是鳥嘌呤、腺嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤，出峰時(shí)間依次為9.7、10.5、11.5、13.6 min，保留時(shí)間均短于甲醇、磷酸二氫鉀[11-12]。故本試驗(yàn)選用甲酸銨-甲醇（99∶1）作為流動(dòng)相不僅能夠?qū)?種峰有效分離，峰形良好，且保留時(shí)間較短，適用于批量檢測(cè)。

3.4 樣品水解條件的確定 食品中的4種嘌呤是以堿基形式存在于核酸中，故需經(jīng)水解成嘌呤堿基再進(jìn)行分析。常見的水解方法有高氯酸100℃水解[13]，V（三氟乙酸）∶V（甲酸）∶V（去離子水）=3∶3∶1水解。后者常在100℃水解14～35 min后經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀干燥，再經(jīng)流動(dòng)相超聲溶解，Lou[14]發(fā)現(xiàn)漂洗步驟會(huì)使嘌呤總量下降60%，且該方法步驟較繁瑣，對(duì)操作要求高，故本試驗(yàn)采用高氯酸水解的方法。按高氯酸的不同濃度（70%、80%、90%）、不同水解時(shí)間（30、45、60、75 min）水解樣品，進(jìn)樣檢測(cè)結(jié)果70%高氯酸100℃水解60 min所得總嘌呤含量最高，精密度、回收率都符合要求，可以推廣使用。

本試驗(yàn)得到了定量檢測(cè)飼料中4種嘌呤的檢測(cè)方法，通過對(duì)流動(dòng)相的選擇、樣品前處理不同條件的測(cè)試，得到了高效液相色譜法測(cè)定飼料中嘌呤的色譜條件。

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（2015－05－21收稿）

R589

A

1006－8147（2015）06-0530-03

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81302422）

崔博（1989-），女，碩士在讀，研究方向：營(yíng)養(yǎng)與慢性??；通信作者：王璇，E-mail：wangxuan@tmu.edu.cn。