樹鼩丙型肝炎動物模型研究進展

周玲麗，楊　春(綜述)，曹　驥※(審校)

(1.廣西壯族自治區(qū)腫瘤防治研究所實驗研究部，南寧530021； 2.廣西醫(yī)科大學研究生學院，南寧 530021)

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樹鼩丙型肝炎動物模型研究進展

周玲麗1,2△，楊春1(綜述)，曹驥1※(審校)

(1.廣西壯族自治區(qū)腫瘤防治研究所實驗研究部，南寧530021； 2.廣西醫(yī)科大學研究生學院，南寧 530021)

摘要：丙型肝炎病毒(HCV)感染是全球關注的公共健康問題之一。只有建立穩(wěn)定可靠的HCV感染模型,才能更好地研究HCV感染慢性化和致癌的機制,從而推動丙型肝炎疫苗的研制和抗丙型肝炎藥物的篩選。HCV宿主范圍特別狹窄，只有人和黑猩猩對其易患。目前有一些體內(nèi)和體外的實驗結果初步顯示，樹鼩是目前繼黑猩猩之后唯一能感染HCV的動物。該文對HCV感染樹鼩動物模型的研究進展予以行綜述。

關鍵詞：丙型肝炎病毒；樹鼩；動物模型

近年來，丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)嚴重威脅著人類的健康，1990年至2005年，全球丙型肝炎抗體血清陽性率的患者從2.3%增加至2.8%，感染人數(shù)從1.2億增加到1.85億[1]。HCV的主要傳播途徑有血液傳播、母嬰傳播和不安全的注射等。持久的HCV感染通常會導致慢性肝炎,其病理變化特征向著肝細胞壞死、炎癥和纖維化發(fā)展,部分纖維化患者最終會變成肝細胞癌。目前治療丙型肝炎的藥物主要有干擾素、利巴韋林等，但是治療效果不理想、成本高且不良反應顯著。目前最有效保護易患者和控制病毒傳播的方法是接種疫苗。由于HCV感染機制尚不清楚,尤其是缺乏合適可靠的小動物模型,嚴重阻礙了丙型肝炎疫苗的研制。該文主要圍繞HCV體內(nèi)和體外感染途徑，探討樹鼩丙型肝炎動物模型。

1HCV

HCV是一種具有脂質外殼的單股正鏈RNA病毒，屬于黃病毒科。HCV通過宿主因素和病毒本身相互作用進入肝細胞是產(chǎn)生感染的第一步；病毒侵入肝細胞基本過程主要包括病毒與肝細胞結合，后期綁定和融合；病毒與核內(nèi)體膜融合后病毒基因組釋放到胞質中，完成復制和翻譯；HCV顆粒進行組裝最后從宿主細胞釋放[2]。HCV感染宿主有多種受體蛋白介導：CD81與Claudin-1、LDLr、SR-BI[3]、Occludi[4]等，niemann-pick C1-like 1(NPC1L1)分子[5]是近2年來新發(fā)現(xiàn)的介導HCV感染的分子，也是新發(fā)現(xiàn)的抗病毒靶點。

2樹鼩丙型肝炎動物模型

2.1樹鼩的生物學特性和醫(yī)學應用價值樹鼩外形酷似松鼠，屬哺乳綱，介于靈長目和食蟲目之間，主要棲息于熱帶和亞熱帶森林、灌叢、村落附近。最新研究觀點認為，樹鼩親緣關系最為接近于靈長類，解決了樹鼩與靈長總目的系統(tǒng)發(fā)育關系的爭議[6-7]。樹鼩具有個體小、易操作、價格相對便宜、繁殖周期短等優(yōu)點。我國野生樹鼩主要分布在云南、廣西、廣東及海南等地，目前用于科研的樹鼩主要來自云南，屬于滇西亞種。有學者破譯并分析了樹鼩全基因組，研究樹鼩的免疫系統(tǒng)相關基因，發(fā)現(xiàn)樹鼩的HCV感染相關基因與人類保持高度的一致性，但是DDX58基因在樹鼩基因組中缺失；DDX58基因對于激活核因子κB通路有著重要作用，其可以產(chǎn)生對抗病毒的干擾素，喪失DDX58基因的樹鼩免疫反應中斷，可能會導致樹鼩對HCV的易患性增加[7-8]。樹鼩的許多分子和細胞結構與人類相似,被用于多個研究領域，如感染性疾病的模型甲、乙、丙、丁型(病毒性肝炎)、耐藥細菌感染和敗血癥模型、精神和神經(jīng)疾病模型(心理應激和抑郁癥動物模型、樹鼩近視模型、樹鼩老年癡呆模型)、代謝性疾病模型(糖尿病)、癌癥模型(乳腺癌模型、肝癌、淋巴瘤、肺癌)等[9]。樹鼩在醫(yī)學界的應用價值越來越受到人們的重視。

2.2HCV體內(nèi)感染樹鼩模型王海平等[10]用HCV RNA陽性人血清成功感染了6只成年樹鼩,說明樹鼩可成為HCV易患動物。劉志等[11]用HCV RNA陽性的血清接種10只樹鼩，結果得出HCV能感染樹鼩，并且還產(chǎn)生了慢性病變。有學者用亞型為1b的HCV病毒血清感染樹鼩，接種丙型肝炎患者血漿后20%～35%的樹鼩血漿中HCV RNA 含量可達約104IU/mL，且出現(xiàn)一過性病毒血癥[12]。Amako等[13]用HCV基因型(1b型)患者的血清和培養(yǎng)產(chǎn)生的病毒接種到樹鼩體內(nèi)，樹鼩出現(xiàn)HCV RNA間歇陽性，丙氨酸轉氨酶升高(最高值達75 U/L)，且提取陽性血清可以感染新的樹鼩。這是首次發(fā)現(xiàn)樹鼩發(fā)生了肝組織纖維化和癌變。Xu等[14]用含HCV基因1b、2c、3b、6的4種基因型的人血清和HCV轉染細胞的培養(yǎng)上清分別接種到樹鼩體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)樹鼩可被HCV感染，并且感染呈慢性病程。王佳[15]選高拷貝HCV患者的血清皮下和腹腔注射15只樹鼩，其中6只攜帶HCV長達28周，實驗結果顯示，HCV RNA陽性率為33.33%，抗HCV的陽性率為100%，實驗中丙氨酸轉氨酶水平出現(xiàn)波動且比實驗前高?？锏滦萚16]選用22只人工馴養(yǎng)成年仔樹鼩(中緬樹鼩滇西亞種)，采用橫切打開樹鼩腹腔，肝門靜脈注射接種HCV，觀察到有60%(12/20)樹鼩出現(xiàn)一過性的類似肝炎的癥狀，丙氨酸轉氨酶指標升高，最高可達到192 U/L；在肝組織中能檢測到HCV RNA抗原，感染樹鼩后的病毒載量最高時可達到1×105copies/mL，肝臟活體組織病理檢查發(fā)現(xiàn)不同程度的肝炎癥狀。以上的實驗結果均提示樹鼩可以成為丙型肝炎的小動物感染模型。

2.3HCV體外感染樹鼩模型趙西平等[17]采用HCV RNA陽性患者的血清感染樹鼩原代肝細胞，結果顯示樹鼩肝細胞和感染后的上清液均可檢出HCV RNA，且感染后的上清液可傳代感染新的肝細胞，證明HCV已經(jīng)成功感染樹鼩肝細胞。Guitart等[18]研究發(fā)現(xiàn)，HCV可以在肝細胞直接激活核因子κB通路，在HCV感染樹鼩原代肝細胞最初的24 h內(nèi)，是通過上調核因子κB相關基因趨化因子的作用來實現(xiàn)的。HCV準種能快速適應機體特定的生物學環(huán)境產(chǎn)生變異，HCV刺激干擾素反應遲鈍而誘發(fā)炎癥感染樹鼩肝細胞。有學者用HCV RNA陽性血清感染樹鼩肝細胞，感染后第5～17日，細胞內(nèi)可檢出HCV正負鏈RNA；在電鏡下觀察到體外感染細胞的胞質內(nèi)含有大量的脂肪空泡、疑似病毒樣結構，證實了HCV在體外能感染樹鼩原代肝細胞，而且能直接致肝細胞損傷病變；然而用HCV陽性的血清孵育大鼠肝細胞后卻檢測不到HCV RNA，說明HCV病毒感染宿主細胞具有種屬特異性，證明了樹鼩與靈長類動物的親緣關系，為樹鼩成為丙型肝炎動物模型提供了依據(jù)[19-20]。目前的研究表明，使用HCV陽性的人血清尚不能建立高效的、重復性好的感染。最好的解決方法是使用可重復性好、感染性高的細胞培養(yǎng)HCV代替患者血清來研究丙型肝炎動物模型。Wakita等[21]在爆發(fā)型HCV患者的血中發(fā)現(xiàn)毒力強的基因型2a的HCV病毒株JFH-1，在Huh-7細胞系中可進行大量的復制，將細胞培養(yǎng)體系的上清液感染黑猩猩，顯示血樣和上清中能持續(xù)檢測到JFH-1株，證實HCV可以通過細胞培養(yǎng)體系產(chǎn)生。童一民[22]用HCV假病毒和細胞培養(yǎng)產(chǎn)生的HCV感染樹鼩原代肝細胞，發(fā)現(xiàn)均能發(fā)生感染，并且細胞培養(yǎng)產(chǎn)生的HCV感染樹鼩肝細胞能完成完整的病毒復制過程,產(chǎn)生感染性HCV顆粒；細胞培養(yǎng)產(chǎn)生的HCV(J6/JFH1)還能體內(nèi)感染樹鼩，發(fā)現(xiàn)感染的6只中,有2只血清中能間歇性檢測到HCV RNA，說明樹鼩可能作為HCV小動物感染模型。Tong等[23]用嵌合病毒J6/JFH1感染樹鼩原代肝細胞,用反轉錄-聚合酶鏈反應測定感染細胞培養(yǎng)上清中新產(chǎn)生的HCV載量,觀察的8 d時間里維持在一個較低的相對穩(wěn)定的水平(103～104.5copies/mL),在轉染的第6日達到最大值，證實了樹鼩原代肝細胞可以支持HCV感染。李堯[24]用J6/JFH-1HCV(病毒載量為107U/mL以上)感染表達人CD81分子的樹鼩原代肝細胞,檢測到第7日最高病毒載量的值為106U/mL，證實了J6/JFH-1HCV病毒株可成功感染樹鼩,并有利于研究HCV感染和復制的機制。

3其他丙型肝炎動物模型

3.1黑猩猩黑猩猩基因組約98%與人類相同，且黑猩猩是目前唯一被肯定的HCV易患動物,可以感染HCV流行病學重要的6個基因型,感染病毒后先天和適應性免疫反應均類似于人類；但使用黑猩猩作為實驗動物的費用很高,動物來源極為有限，且和人類為“近親”的倫理道德，嚴重阻礙了黑猩猩作為丙型肝炎動物模型[25]。

3.2小鼠近年來,小鼠模型應用最廣泛。自然狀態(tài)下小鼠HCV感染率極低，通過改造后感染成功率明顯增加。有學者開發(fā)了一種嵌合重癥聯(lián)合免疫缺陷/尿激酶型纖溶酶原激活小鼠模型，這種免疫缺陷小鼠模型支持移植的人肝細胞增殖，持續(xù)HCV感染如靜脈內(nèi)接種后小鼠血漿中可檢測到HCV RNA并出現(xiàn)與人相似的毒血癥狀，證實了人肝細胞占嵌合小鼠肝體積的大部分(至少80%)可發(fā)生HCV感染并可能導致肝衰竭[26-27]。但由于嚴重的聯(lián)合免疫缺陷，因此不能被用于適應性免疫應答的研究或對疫苗的評價。Washburn等[28]提出了一種小鼠模型，即人源化的小鼠顯示出同時具備人肝細胞和免疫細胞，感染HCV后小鼠肝臟中可檢測到HCV RNA；最后約50%的人源化小鼠肝臟出現(xiàn)炎性變化和肝纖維化，該種小鼠缺乏完整免疫系統(tǒng)，其免疫應答有限，其血清中測不到HCV RNA，不能支持HCV的高效復制。Dorner等[29]開發(fā)了一種人源化的小鼠模型，其表達HCV特異性感染受體(包括CD81、緊密連接蛋白、SR-B1和Cluandin-1)，該模型證明了特異性CD81和Occludin是HCV進入小鼠肝細胞必不可少的。因為這個模型中使用的是免疫小鼠，阻礙了病毒復制和感染的研究。

4小結

目前研究已經(jīng)證實，無論是體內(nèi)還是體外的實驗研究結果都初步顯示樹鼩能感染HCV，因此樹鼩有可能成為除人和黑猩猩以外能感染HCV的可靠小動物品系。 雖然目前丙型肝炎樹鼩模型還不夠穩(wěn)定，感染率低、重復性差，但樹鼩的親緣關系接近于靈長類，比小鼠更適合于HCV感染的研究，并且我國樹鼩資源豐富，應該大力發(fā)展并最終建立可行的樹鼩丙型肝炎模型，這將有助于丙型肝炎疫苗的研發(fā)和抗丙型肝炎藥物的篩選，以便進一步更好探討HCV感染與復制的機制。

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Research Progress in Tupaia Animal Model of Hepatitis CZHOULing-li1,2,YANGChun1,CAOJi1.(1.ResearchDepartmentofGuangxiCancerInstitute,Nanning530021,China； 2.GraduateSchoolofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Abstract:Hepatitis C virus(HCV) infection is one of the serious public health problems concerned all over the world.Only through establishing a stable and reliable model of HCV infection can better study in chronic HCV infection and carcinogenic mechanism be realized,thus to promote the development of hepatitis C vaccines and anti-HCV drugs.HCV has a particularly narrow host range,only humans and chimpanzees are susceptible to it.There are some in vivo and in vitro experiment results preliminarily showing that tupaia is currently the animal besides the chimpanzee which can be infected with HCV.Here is to make a review of the research progress in tupaia animal model of HCV infection.

Key words:Hepatitis C virus; Tupaia; Animal models

收稿日期：2014-08-15修回日期：2014-11-18編輯：鄭雪

基金項目：國家自然科學基金(81260080)；廣西自然科學基金(2013GXNSFAA019210)；廣西科技基礎條件平臺建設項目(10-108-25)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.11.004

中圖分類號：R332； R373.21

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)11-1930-03