瑞舒伐他汀通過激活SGK1上調(diào)ALI小鼠ENaC表達的實驗研究＊

馮社軍 王慧娟 李軍濤 武艷強 朱濤

（1.邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001；2.四川大學華西醫(yī)院呼吸病學研究室／呼吸內(nèi)科，四川 成都 610041）

非心源性肺水腫（non－cardiac pulmonary edema）是急性肺損傷（acute lung injury，ALI）和急性呼吸窘迫綜合癥（acute respiratory distress syndrome，ARDS）最重要的病理特點之一，也是ALI／ARDS 最特征性的病理生理學改變［1～4］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，在ARDS狀態(tài)下非心源性肺水腫是導致肺順應性下降和肺氧合功能障礙的主要原因之一，也是導致早期ARDS患者死亡的主要因素［1～4］。研究證實，改善肺水腫可以有效改善肺順應性和肺換氣功能，降低ALI模型動物的死亡率。大量研究表明，他汀類藥物具有獨立于降脂以外的包括抑制炎癥反應、抗腫瘤和抗凋亡等多種生物學活性［5～8］。同時發(fā)現(xiàn)他汀可以有效促進血清和糖皮質激素誘導的蛋白激酶1（SGK1）的活化［7］。由于SGK1是調(diào)節(jié)肺上皮細胞ENaC的關鍵分子，實驗表明，激活SGK1可有效上調(diào)ALI狀態(tài)下肺上皮細胞ENaC 的表達而改善肺水腫［3］。本文探討在LPS誘導的小鼠ALI狀態(tài)下，瑞舒伐他汀能否通過上調(diào)肺組織ENaC 的表達改善肺水腫的嚴重程度及相關的分子機制。

1 材料和方法

1.1 主要材料 SPF 級雄性C57BL／6小鼠30只，6～10周齡，體重約18～22g，購于四川大學實驗動物中心。電泳單元及電泳附件、電源、濕轉式電轉儀、凝膠成像系統(tǒng)由Bio－rad公司提供。瑞舒伐他汀購于瑞典阿斯利康制藥有限公司；大腸埃稀桿菌內(nèi)毒素（LPS）購自美國Sigma公司；聚合酶鏈反應（PCR）引物由上海生物工程技術服務有限公司合成；總RNA抽提試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司；第一鏈cDNA 合成試劑盒和PCR 試劑盒購自美國Mbi Fermentas公司；兔抗鼠α－ENaC 抗體、兔抗鼠β－肌動蛋白（β－actin）抗體、兔抗鼠phospho－SGK1抗體以及兔抗鼠SGK1 抗體均購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 方法

1.2.1 LPS誘導的小鼠ALI模型的建立 30 只雄性C57BL／6大鼠隨機平均分為對照組（Control組）、干預組（LPS＋ROS 組）和模型組（LPS 組），每組10只。腹腔注射戊巴比妥（30mg／kg）麻醉小鼠。干預組和模型組小鼠通過氣道內(nèi)注射LPS（10μg LPS溶于50μl生理鹽水）誘導建立ALI模型［1］。注入LPS前2小時，干預組給予口服瑞舒伐他?。?0mg／kg），每日1次；對照組給予生理鹽水代替LPS。于干預72 小時后下腔靜脈放血處死小鼠。

1.2.2 HE染色觀察病理變化并進行肺損傷評分取左下肺組織，常規(guī)制成5μm 的石蠟切片，HE 染色觀察肺損傷程度，并進行肺損傷評分［1］。

1.2.3 肺組織濕／干比（wet to dry ratio，W／D）測定小鼠處死后取出肺組織。將小鼠右下肺置于80℃烤箱24 小時至恒重后，記錄前后肺組織重量，計算W／D 比值。

1.2.4 RT－PCR 法檢測α－ENaC mRNA 表達 取左上肺組織，按照試劑盒說明書提取總RNA。引物：α－ENaC 正 義：5′－TCACTTCAGCA CATCTTC CACAGCTGC－3′，反 義：5′－GTATCTGC CTAGCTGGTC CAAGTGGGA－3′；β－actin 引 物：正 義：5′－CGAGCGGGC TACAG CTTC－′，反 義：5′－GTCACGC ACGATTC CCTCT－3′，按照試劑盒說明書介紹進行反轉錄和擴增實驗。應用凝膠成像系統(tǒng)（Bio－rad）攝影，Quantity One軟件對目的條帶進行掃描分析。用α－ENaC／β－actin PCR 產(chǎn)物條帶灰度比值作為α－ENaC mRNA 的相對表達量。

1.2.5 Western blot檢測肺組織α－ENaC 蛋白表達和SGK1活化水平 按照試劑盒操作要求，首先提取肺組織總蛋白，并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），然后轉移至硝酸纖維素濾膜上，用脫脂奶粉封閉1小時，分別加入兔抗鼠α－ENaC抗體（1∶1000）、兔抗鼠β－actin抗體（1∶2000）、兔抗鼠phospho－SGK1抗體（1∶1100）以及兔抗鼠SGK1抗體（1∶1100），4 ℃孵育過夜，洗膜后加入相應的辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶1000），用ECL 進行顯色，用凝膠成像分析系統(tǒng)進行掃描。

2 結果

2.1 肺組織病理學變化和肺損傷評分 在干預72小時后，獲取小鼠肺組織，HE 染色后光鏡觀察。對照組小鼠肺組織未見病理改變，肺組織結構清晰，肺泡間隔結構完整，無炎癥細胞浸潤，無紅細胞進入肺泡腔，無透明膜形成；模型組小鼠肺組織出現(xiàn)嚴重的病理學改變，主要表現(xiàn)為肺泡間隔增厚，肺組織中大量炎癥細胞浸潤，肺泡和肺間質大量水腫液聚集，肺泡腔中出現(xiàn)大量紅細胞，肺泡中透明膜形成；干預組小鼠肺組織病理改變相對較輕，主要表現(xiàn)為肺泡和肺泡間隔內(nèi)輕度炎癥細胞浸潤，肺間質性肺水腫形成，僅部分肺泡內(nèi)出現(xiàn)水腫液聚集和紅細胞，并可見少量透明膜。進行肺損傷評分后發(fā)現(xiàn)，LPS組小鼠肺組織損傷評分高于干預組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1、表1。

表1 小鼠肺組織損傷評分和W／D值（）Table 1 Lung injury scores and W／D ratio in mice

注：與對照組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

2.2 肺組織濕干比（W／D 比值）在干預72小時后，LPS干預小鼠肺組織W／D 比值較對照組明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。但干預組小鼠肺組織的W／D 比值較模型組更低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

2.3 肺組織α－ENaC 的表達水平 使用RT－PCR 和western blot對肺組織中α－ENaC mRNA 和蛋白表達分析后發(fā)現(xiàn)，在LPS干預72小時后小鼠肺組織中α－ENaC mRNA 和蛋白表達量較對照組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。但瑞舒伐他汀干預組小鼠肺組織α－ENaC表達量較模型組小鼠升高，差異亦有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2、表2。

圖2 肺組織α－ENaC表達RT－PCR和western blotting結果Figure 2 The RT－PCR and western blot results ofα－ENaC in each group

表2 肺組織α－ENaC mRNA 和蛋白的表達水平及SGK1的活化水平（）Table 2 The mRNA and protein expression ofα－ENaC and the activity of SGK1in the lung tissues

表2 肺組織α－ENaC mRNA 和蛋白的表達水平及SGK1的活化水平（）Table 2 The mRNA and protein expression ofα－ENaC and the activity of SGK1in the lung tissues

注：與對照組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

2.4 肺組織SGK1活化水平 使用western blot對肺組織中SGK1 活化水平（phospho－SGK1／total SGK1）分析后發(fā)現(xiàn)，在LPS干預72小時后小鼠肺組織中SGK1活化水平較對照組明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。但瑞舒伐他汀干預組小鼠肺組織SGK1活化水平較模型組升高，差異亦有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖3、表2。

圖3 肺組織SGK1活化水平結果Figure 3 The activity of SGK1results in lungs

3 討論

急性肺損傷（ALI）是一種由多種嚴重的肺內(nèi)或肺外疾病，如重癥肺炎、肺膿腫、嚴重膿毒血癥和休克等導致的失控和自我放大的、以肺組織為中心的炎癥反應［1～4，9］。急性呼吸窘迫綜合癥（ARDS）是其更加嚴重的狀態(tài)。目前流行病學調(diào)查和臨床研究結果表明，ARDS的病死率高達35%～50%，尋求新的治療方法和藥物具有重要的價值和意義［4］。非心源性肺水腫（non－cardiac pulmonary edema）是ALI／ARDS 最重要的病理改變之一，也是ALI／ARDS 最特征性的病理生理改變［1～4，9］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，非心源性肺水腫是導致肺順應性下降和肺氧合功能障礙的主要原因之一，也是導致早期ARDS 患者死亡的主要因素［1～4，9］。研究證實，改善肺水腫可以有效改善肺順應性和肺換氣功能，降低ALI 模型動物的死亡率［1～4，9］。

研究發(fā)現(xiàn)，他汀類（statin）藥物包括瑞舒伐他汀（rosuvastatin）和辛伐他?。╯imvastatin）等具有獨立于降脂以外的包括抑制炎癥反應、抗腫瘤和抗凋亡等多種生物學活性［5～8，10］。Zhu T 等研究證實，瑞舒伐他汀可以通過抑制炎癥反應下調(diào)OVA 誘導的小鼠氣道粘液的分泌［6］。Duivenvoorden R 等的研究發(fā)現(xiàn)，他汀對動脈粥樣硬化相關的炎癥反應有明顯地抑制作用［10］。我們的實驗表明，LPS誘導72小時后小鼠肺組織出現(xiàn)顯著的病理學改變，主要表現(xiàn)為肺泡間隔增厚，肺組織中大量炎癥細胞浸潤，肺泡和肺間質大量水腫液聚集，肺泡腔中出現(xiàn)大量紅細胞，肺泡中透明膜形成。而瑞舒伐他汀進行干預后，小鼠肺組織病理改變明顯減輕，主要表現(xiàn)為肺泡和肺泡間隔內(nèi)輕度炎癥細胞浸潤，肺間質性肺水腫形成，僅部分肺泡內(nèi)出現(xiàn)水腫液聚集和紅細胞，并可見少量透明膜。進一步肺損傷評分后發(fā)現(xiàn)，干預組小鼠肺組織損傷評分顯著低于LPS組。對肺水腫嚴重程度進行分析后也發(fā)現(xiàn)，LPS干預后小鼠肺組織W／D 比值較對照組明顯增加，但瑞舒伐他汀干預后小鼠肺組織的W／D 比值較模型組更低。以上結果表明，瑞舒伐他汀可以明顯減輕LPS誘導的小鼠ALI模型肺組織炎癥反應和肺水腫。

進一步的研究發(fā)現(xiàn)［3，9，11］，肺水腫的形成和清除與肺上皮細胞表達的鈉離子通道（ENaC）密切相關，ENaC是肺泡液體清除的關鍵和限速環(huán)節(jié)，其表達和功能的異常是導致ARDS非心源性肺水腫的重要原因。ENaC由α、β和γ3種亞基構成，ENaC 在肺泡I型和II型上皮細胞上廣泛表達，而α亞基是ENaC 的功能亞基，β和γ 亞基對ENaC 活性具有調(diào)節(jié)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，在LPS干預72小時后，小鼠肺組織中α－ENaC mRNA 和蛋白的表達量明顯下降，但瑞舒伐他汀干預組小鼠肺組織α－ENaC表達量較模型組小鼠升高，提示在ALI狀態(tài)下，瑞舒伐他汀能夠通過促進ENaC的表達改善肺水腫。

另有研究證實，SGK1 是調(diào)節(jié)肺上皮細胞ENaC表達的關鍵分子，促進SGK1 磷酸化（即SGK1 的活化）對于調(diào)節(jié)ENaC 的表達具有重要作用［12］。Zhu T等的研究表明，LPS 誘導的ALI 大鼠模型中促進SGK1磷酸化可以通過上調(diào)肺組織中ENaC 以減輕肺水腫的嚴重程度［3］。Zhang L 等研究表明，他汀類藥物也可誘導SGK1 磷酸化的發(fā)生［7］。本實驗中我們使用western blot法對SGK1 的活化水平（phospho－SGK1／total SGK1）進行分析后發(fā)現(xiàn)，在LPS干預72小時后小鼠肺組織中SGK1活化水平較對照組明顯下降，但給予瑞舒伐他汀干預的小鼠肺組織SGK1活化水平較模型組小鼠升高。提示在ALI狀態(tài)下，瑞舒伐他汀可以誘導肺組織中SGK1的活化。

4 結論

本研究結果表明，在LPS 誘導的小鼠ALI狀態(tài)下，瑞舒伐他汀可以通過增加肺組織ENaC 的表達有效地改善肺水腫嚴重程度，并發(fā)現(xiàn)該機制與促進SGK1的活化密切相關。這為他汀類藥物應用于ARDS的臨床治療奠定了基礎。

［1］Zhu T，Wang D，Zhang W，et al.Andrographolide protects against LPS－induced acute lung injury by inactivation of NF－κB［J］.PloS one，2013，8（2）：56407.

［2］朱濤，肖敏，文富強，等.脫氫穿心蓮內(nèi)酯琥珀酸半酯上調(diào)水通道蛋白5減輕LPS誘導的急性肺損傷肺水腫的實驗研究［J］.西部醫(yī)學，2014，26（1）：16－18.

［3］Zhu T，Zhang W，Wang DX.Insulin up－regulates epithelial sodium channel in LPS－induced acute lung injury model in rats by SGK1activation［J］.Injury，2012，43（8）：1277－1283.

［4］ARDS Definition Task Force，Ranieri VM，Rubenfeld GD，et al.Acute respiratory distress syndrome［J］.Jama，2012，307（23）：2526－2533.

［5］Uekawa K，Hasegawa Y，Ma M，et al.Rosuvastatin Ameliorates Early Brain Injury after Subarachnoid Hemorrhage via Suppression of Superoxide Formation and Nuclear Factor－Kappa B Activation in Rats［J］.J Stroke Cerebrovasc Dis，2014，（13）：1052－3057.

［6］Zhu T，Zhang W，Wang DX，et al.Rosuvastatin attenuates mucus secretion in a murine model of chronic asthma by inhibiting the gamma－aminobutyric acid type A receptor［J］.Chin Med J（Engl），2012，125（8）：1457－1464.

［7］Zhang L，Liu J，Liu Y，et al.Fluvastatin inhibits the expression of fibronectin in human peritoneal mesothelial cells induced by high－glucose peritoneal dialysis solution via SGK1pathway［J］.Clin Exp Nephrol，2014，20：9124－9130.

［8］張維，朱濤，王導新，等.瑞舒伐他汀抑制小鼠哮喘模型慢性氣道炎癥反應的實驗研究［J］.西部醫(yī)學，2014，26（02）：150－153.

［9］王導新，鄧旺.急性呼吸窘迫綜合征肺水腫液清除與正壓通氣研究進展［J］.西部醫(yī)學，2014，26（2）：133－135.

［10］Duivenvoorden R，Tang J，Cormode DP，et al.A statin－loaded reconstituted high－density lipoprotein nanoparticle inhibits atheroscle－rotic plaque inflammation［J］.Nat Commun，2014，5：3065.

［11］劉佩英，徐道妙.辛伐他汀對脂多糖誘導的Ⅱ型肺泡上皮細胞鈉通道α亞基的影響［J］.中國危重病急救醫(yī)學，2012，24（10）：604－607.

［12］Mattes C，Laube M，Thome UH.Rapid elevation of sodium transport through insulin is mediated by AKT in alveolar cells［J］.Physiol Rep，2014，2（3）：00269.