下調(diào)受精卵中Clock基因?qū)υ缙谛∈笈咛NA甲基化的影響＊

成姝婷 梁鑫 王正榮 李世平 劉延友 汪宇輝 江舟 肖靜 郭慧玲

（四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)研究室，四川 成都 610041）

在哺乳動(dòng)物中，至少有兩種不同的方式來(lái)反映局部染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的信息，一種是通過(guò)對(duì)那些在DNA 復(fù)制過(guò)程中起作用的某些組蛋白特定殘基甲基化［1，2］；另一種是通過(guò)對(duì)那些能夠復(fù)制DNA 的特定胞嘧啶殘基甲基化［3，4］。這兩種方式的印記都能夠很容易地復(fù)制給新合成的DNA 鏈，并且一代一代的傳遞下去，也就是所謂的表觀遺傳學(xué)修飾。表觀遺傳學(xué)修飾包括DNA 甲基化和組蛋白修飾，通過(guò)改變局部的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)而調(diào)節(jié)基因表達(dá)，從而改變?nèi)旧|(zhì)和DNA 結(jié)合蛋白之間的相互作用，如轉(zhuǎn)錄激活子和抑制子與基因啟動(dòng)子和增強(qiáng)子之間的結(jié)合［5］。不同于遺傳變異，表觀遺傳學(xué)修飾調(diào)節(jié)基因表達(dá)不會(huì)改變其核苷酸序列。值得注意的是，人們?cè)趯?duì)表觀遺傳學(xué)修飾的最初研究里并沒(méi)有把其與時(shí)序調(diào)節(jié)聯(lián)系在一起，因?yàn)橥ǔ６颊J(rèn)為這些印記高度穩(wěn)定，甚至傳代也不會(huì)改變。一直以來(lái)，研究人員對(duì)近日節(jié)律分子機(jī)制的研究通常也都是針對(duì)以轉(zhuǎn)錄／轉(zhuǎn)錄后反饋環(huán)路為基礎(chǔ)的這個(gè)復(fù)雜遺傳網(wǎng)絡(luò)［6，7］。然而，近期的研究證明，組蛋白和DNA 甲基化遠(yuǎn)比從前所想的要活躍得多。例如：超過(guò)100個(gè)DNA 甲基化位點(diǎn)為了與細(xì)胞周期同步而發(fā)生近日震蕩［8］，而細(xì)胞周期也常常受到近日生物鐘的控制［9，10］。這些研究讓研究者們開(kāi)始認(rèn)識(shí)到了表觀遺傳學(xué)調(diào)節(jié)與近日節(jié)律系統(tǒng)之間的聯(lián)系。DNA 甲基化一般是在胞嘧啶的CpG 位點(diǎn)上加上一個(gè)甲基團(tuán)。這是哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育接受表觀遺傳調(diào)節(jié)的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。研究表明，DNA 甲基化對(duì)于動(dòng)物胚胎發(fā)育階段的基因調(diào)節(jié)，特別是組織特異性基因，具有至關(guān)重要的作用［11］。值得注意的是，除了印記基因外，哺乳動(dòng)物基因組的表觀遺傳學(xué)修飾在早期胚胎發(fā)育階段會(huì)被消除，并在之后的整個(gè)胚胎發(fā)育階段得到重建［12～14］。目前大多數(shù)對(duì)DNA 甲基化的研究，都是關(guān)于配子生成、發(fā)育、疾病和干細(xì)胞功能的，這些研究闡明了DNA 甲基化是如何調(diào)節(jié)基因表達(dá)和細(xì)胞分化的［15～18］。而關(guān)于節(jié)律基因在胚胎基因組DNA 甲基化中所起作用的研究則非常少。

本研究應(yīng)用RNAi技術(shù)下調(diào)從二細(xì)胞期到囊胚期這段時(shí)間內(nèi)小鼠受精卵中Clock 基因的表達(dá)，研究了7.5～11.5dpc之間的小鼠胚胎基因組DNA 甲基化水平的改變，以及在哺乳動(dòng)物催化發(fā)育過(guò)程中去甲基化的CpG 位點(diǎn)重新甲基化的主要甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt3a和Dnmt3b。本研究結(jié)果顯示，Clock 基因干擾的小鼠胚胎基因組DNA 甲基化水平比陰性對(duì)照組顯著升高，而甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt3a和Dnmt3b的RNA 表達(dá)水平也顯著增加了。因此，這些結(jié)果為我們提供了一個(gè)新的信息，那就是節(jié)律基因Clock 能夠通過(guò)甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt3a和Dnmt3b調(diào)節(jié)早期小鼠胚胎基因組DNA 的甲基化水平。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)ICR 雄性小鼠（6～8周）30只，雌鼠（4～6周）65只，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。所有雄鼠單只每籠，雌鼠5 只每籠，均單獨(dú)飼養(yǎng)于12L∶12D 光暗循環(huán)箱中，自由進(jìn)食和飲水。

1.1.2 主要儀器 倒置生物顯微鏡TE 2000－U（日本，Nikon），CO2恒溫細(xì)胞孵箱（日本，SANYO），高效液相色譜儀（美國(guó)，VARIAN Pro Star），PCR 儀（德國(guó)，Eppendorf），電泳儀及水平電泳槽（美國(guó)，BIORAD），超凈細(xì)胞工作臺(tái)、凝膠成像儀、恒溫振蕩培養(yǎng)箱、微量注射器及眼科剪、眼科鑷等均為國(guó)產(chǎn)。

1.1.3 主要試劑 孕馬血清促性腺激素PMSG、注射用絨促性腺激素HCG（寧波市激素制品有限公司），Clock干擾質(zhì)粒和HK 陰性對(duì)照質(zhì)粒（武漢市晶賽生物工程技術(shù)有限公司），DMEM 高糖培養(yǎng)液、Opti－MEMI培養(yǎng)液和胎牛血清（美國(guó)，HyClone），LipofectamineTM2000細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑、Trizol（美國(guó)，Invitrogen），基因組DNA 提取試劑盒（美國(guó)，OMEGA），核酸酶P1、堿性磷酸酶、2′－脫氧胞苷dC 和5－甲基－2′－脫氧胞苷mdC（美國(guó)，Sigma），第一鏈cDNA 合成試劑盒、Taq酶（美國(guó)，F(xiàn)ermentas），其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 獲得胚胎樣本 本實(shí)驗(yàn)為了對(duì)小鼠受精卵中Clock基因的表達(dá)進(jìn)行干擾，特采用人工授精（IVF）的方法先在體外得到受精卵，轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒后，再將其移植回假孕雌鼠子宮中以得到所需胚齡（dpc）的小鼠胚胎。

1.2.1.1 人工授精 在進(jìn)行IVF前64小時(shí)，對(duì)每只實(shí)驗(yàn)用雌鼠腹腔注射10IU 的PMSG，48小時(shí)后再對(duì)這些雌鼠腹腔注射10IU 的HCG。頸椎脫臼法處死40只雌鼠，取出輸卵管，放進(jìn)裝有0.5ml T6 培養(yǎng)液（含20mg／ml BSA）的培養(yǎng)皿內(nèi)，撕開(kāi)膨大的壺腹部，釋放出卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體，將其轉(zhuǎn)移到mCZB 受精滴中，放入37℃的CO2孵箱中孵育得到成熟卵子。頸椎脫臼法處死20只雄鼠，摘取附睪，用眼科剪刀將每段附睪尾剪成4 段，輕輕擠壓出精液，然后將其放置在37℃的CO2孵箱中孵育30 分鐘，讓精子充分游出，然后將表面皿中的精子懸液移至1.5ml的EP 管中，繼續(xù)放置在37℃的CO2孵箱中孵育60分鐘以獲能。調(diào)整精子濃度到1×106／ml，每滴含有成熟卵子的受精滴加入10μl獲能的小鼠精子懸液，繼續(xù)放回37℃的CO2孵箱中孵育6小時(shí)，觀察并分離出受精滴中的二細(xì)胞受精卵，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.1.2 質(zhì)粒干擾 將分離出的受精卵隨機(jī)分為Clock干擾組（Clock組）和陰性對(duì)照組（HK 組）兩組，以LipofectamineTM2000細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑分別將Clock干擾質(zhì)粒和HK 陰性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到二細(xì)胞受精卵中。將兩組轉(zhuǎn)染后的受精卵放置在37℃的CO2孵箱中孵育到第5天得到囊胚期胚胎。

1.2.1.3 囊胚移植 在囊胚移植前20天，將10只雄鼠行輸精管結(jié)扎術(shù)，14天后與25只促排卵雌鼠交配獲得假孕雌鼠。將假孕5 天的受體雌鼠用水合氯醛麻醉后，剔除其后腹部的毛并用75%酒精消毒，作一個(gè)長(zhǎng)約1cm 的切口，輕輕牽拉出兩側(cè)子宮角，用4號(hào)針頭在子宮角壁上刺一小孔，分別把12 個(gè)胚胎注入兩側(cè)子宮角，將子宮角放回腹腔后縫合肌肉、皮膚。

1.2.1.4 獲取胚胎 從7.5dpc開(kāi)始，每天頸椎脫臼法處死Clock干擾組和HK 對(duì)照組的受孕雌鼠各2只，剝離其子宮內(nèi)的小鼠胚胎，冷凍于－80℃低溫冰箱，到11.5dpc結(jié)束。

1.2.2 胚胎基因組DNA 甲基化水平 本實(shí)驗(yàn)參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中檢測(cè)DNA 甲基化的標(biāo)準(zhǔn)方法，先將DNA 樣品水解成堿基，水解產(chǎn)物通過(guò)液相色譜柱，所得結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)品相比較，并用紫外光測(cè)定其吸收峰值及出峰面積，計(jì)算mdC／（mdC＋dC）的積分面積，從而得到基因組整體的甲基化水平。

1.2.2.1 提取DNA 使用OMEGA 基因組DNA 提取試劑盒（D3396－02E.Z.N.A.TM Tissue DNA Kit）提取7.5～11.5dpc胚胎的DNA。

1.2.2.2 水解DNA 將DNA 樣本濃度調(diào)節(jié)到0.5μg／μl，每個(gè)樣本吸取3μl開(kāi)水浴2min 后快速冷卻，加入0.75μl ZnSO4（10mM）和1.25μl核酸酶P1，混勻后在37℃孵 育16 小 時(shí)；再加入1.25μl Tris（0.5M，pH 8.3）和0.75μl堿性磷酸酶［50U／ml溶于2.5M 的（NH4）2SO4］，37℃孵育2小時(shí)，離心后取上清。

1.2.2.3 高效液相色譜法檢測(cè) 本實(shí)驗(yàn)采用25cm的C18反相色譜柱，柱溫設(shè)定為35℃，泵A 緩沖液為甲醇，泵B緩沖液為0.05M KH2PO4（pH 4.0）；流動(dòng)相為8%甲醇＋92%0.05M KH2PO4（pH 4.0），流速為1ml／min，UV 波長(zhǎng)為280nm，運(yùn)行時(shí)間為30min。標(biāo)準(zhǔn)品采用mdC 和dC，注入樣品為水解DNA 所得單核苷。樣本中甲基化的定量以總胞苷中mdC 的百分比來(lái)計(jì)算。

1.2.3 甲基轉(zhuǎn)移酶水平 用酚：氯仿法提取7.5～11.5dpc胚胎的RNA，使用Fermentas的第一鏈cDNA 合成試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物序列如下：Dnmt3a：5′－TCACAAGGAAGTTTACACCGAC－3′和5′－GAGGCTCCCACATGAGATACA－3′；Dnmt3b：5′－CGCTCAAGGAGTTGGGTATT－3′和5′－TCTTTGCGGGCAGGATT－3′；Gapdh：5′－TCACTGCCACCCAGAAGA－3′和5′－AAG TCG CAG GAG ACA ACC－3′。電泳PCR 的擴(kuò)增產(chǎn)物，用PCR 儀自帶的分析軟件讀取條帶灰度值，并以Gapdh為參照，比較這段時(shí)間內(nèi)兩種甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)變化。

2 結(jié)果

2.1 小鼠胚胎獲取結(jié)果 人工授精實(shí)驗(yàn)中觀察并分離出的二細(xì)胞受精卵共528枚。分別轉(zhuǎn)染Clock干擾質(zhì)粒和HK 陰性對(duì)照質(zhì)粒后，有37 枚沒(méi)有發(fā)育到囊胚；另隨機(jī)抽取10枚檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果，剩余481枚受精卵移植到假孕雌鼠子宮內(nèi)。25只造模的雌鼠僅得到20只假孕受體。Clock 組和HK 組所得到的7.5～11.5dpc胚齡的小鼠胚胎數(shù)量見(jiàn)表1。

2.2 受精卵中Clock 基因下調(diào)對(duì)早期胚胎基因組DNA 甲基化水平的影響 我們應(yīng)用高效液相色譜法得到了Clock 組和HK 組胚胎基因組DNA 中mdC和dC堿基的出峰面積，并通過(guò)公式：計(jì)算得到基因組整體的甲基化水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除了7.5dpc之外，從8.5～11.5dpc 的DNA 甲基 化水平均是Clock組顯著高于HK 組（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

表1 兩組小鼠取得各胚齡（dpc）胚胎數(shù)量（個(gè)）Table 1 Embryonic numbers in each dpc of the two groups

圖1 小鼠胚胎基因組DNA甲基化水平變化Figure 1 Methylation level changes of genomic DNA in mice embryos

2.3 干擾受精卵Clock基因表達(dá)對(duì)早期胚胎中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的影響 Clock組小鼠胚胎中甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt3a的表達(dá)從8.5dpc開(kāi)始到11.5dpc均顯著高于HK 組（P＜0.05），而其在7.5dpc時(shí)則無(wú)顯著差異（P＞0.05），見(jiàn)圖2A。而甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt3b則從7.5～11.5dpc均是Clock組顯著高于HK 組（P＜0.05），見(jiàn)圖2B。

3 討論

目前已有研究證明，近日節(jié)律系統(tǒng)與哺乳動(dòng)物的生殖存在千絲萬(wàn)縷的聯(lián)系。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中已經(jīng)證實(shí)干擾雄性小鼠圓形精子中Clock基因的表達(dá)后，可以引起雄鼠的生殖能力降低，這種影響不僅表現(xiàn)在與雄鼠交配的雌鼠胎仔數(shù)的減少、體外受精實(shí)驗(yàn)中囊胚形成率的降低，還表現(xiàn)在其子代胚胎發(fā)育過(guò)程中早期吸收胎的增多［19］。早期胚胎發(fā)育的過(guò)程包含了許多重要細(xì)胞命運(yùn)的決定，還有染色質(zhì)狀態(tài)的改變。在這段期間，多種表觀遺傳學(xué)機(jī)制的運(yùn)行改變了染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)，使得某些基因的表達(dá)激活，而另一些基因的表達(dá)沉默［20］。通常情況下，發(fā)育中的胚胎DNA 甲基化模式在個(gè)體的整個(gè)發(fā)育階段以及之后的成年時(shí)期都會(huì)保持穩(wěn)定［11］。然而個(gè)別位點(diǎn)DNA 甲基化的改變是存在的，并且這種改變能夠影響某些在發(fā)育和病理過(guò)程中具有重要生物功能的基因表達(dá)［15，21］，如全基因組范圍或是特定基因位點(diǎn)5－甲基胞嘧啶水平的變化會(huì)增加疾病的易感性，DNA 甲基化的失調(diào)與心血管疾病、Ⅱ型糖尿病以及腫瘤有密切的關(guān)聯(lián)［21～23］。

圖2 甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt3a和Dnmt3b在RNA水平的表達(dá)變化Figure 2 Expression changes of methyltransferase Dnmt3aand Dnmt3bat RNA level

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)人工授精技術(shù)在動(dòng)物體外得到了二細(xì)胞受精卵，以RNAi干擾技術(shù)下調(diào)其Clock 基因的表達(dá)，再將其培育到囊胚并移植到假孕受體雌鼠體內(nèi)。我們對(duì)收獲的7.5～11.5dpc的小鼠胚胎整體進(jìn)行基因組DNA 甲基化水平的檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Clock干擾組胚胎的甲基化水平顯著高于對(duì)照組（P ＜0.05）。這就說(shuō)明二細(xì)胞受精卵中的Clock 基因?qū)τ谛∈笈咛サ脑缙诩谆蔷哂杏绊懙摹NA 甲基化就是一個(gè)將甲基團(tuán)共價(jià)結(jié)合到哺乳動(dòng)物基因組CpG位點(diǎn)上的胞嘧啶殘基上的過(guò)程。這個(gè)過(guò)程需要一組被稱為DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（Dnmts）的酶類參與［24］。由于哺乳動(dòng)物催化發(fā)育過(guò)程中去甲基化的CpG 位點(diǎn)重新甲基化的主要甲基轉(zhuǎn)移酶是Dnmt3a 和Dnmt3b［20］，所以我們又用PCR 檢測(cè)了這些胚胎中Dnmt3a和Dnmt3b的RNA 表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這兩種酶的變化與其DNA 甲基化水平的變化具有相似性，且也是Clock 組顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。因此，我們認(rèn)為二細(xì)胞受精卵中Clock 基因可以通過(guò)調(diào)節(jié)甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt3a和Dnmt3b對(duì)小鼠早期胚胎基因組DNA 甲基化水平造成影響，它們之間具體的作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

在本實(shí)驗(yàn)中，我們利用RNAi技術(shù)干擾了小鼠二細(xì)胞受精卵中Clock 基因的表達(dá)，并成功將這些處理后的受精卵移植到假孕雌鼠子宮內(nèi)，從而得到了由這些受精卵發(fā)育而來(lái)的各胚齡（7.5～11.5dpc）小鼠胚胎。對(duì)這些胚胎基因組DNA 甲基化水平和甲基轉(zhuǎn)移酶的檢測(cè)結(jié)果顯示，Clock干擾組無(wú)論是基因組DNA甲基化水平還是甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt3a、Dnmt3b的表達(dá)量均較對(duì)照組高。由此我們認(rèn)為，受精卵中Clock 基因表達(dá)的下調(diào)可以使得甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt3a和Dnmt3b的表達(dá)量增加，進(jìn)而導(dǎo)致其早期胚胎（7.5～11.5dpc）基因組DNA 甲基化水平上升。

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