免疫共刺激分子PD-1與PD-L1在乳腺癌中的表達(dá)及意義

張　亞，彭成浩

(1.無(wú)錫市第九人民醫(yī)院病理科，江蘇 無(wú)錫 214000； 2.棗莊市立醫(yī)院腫瘤研究所，山東 棗莊 277000)

免疫共刺激分子PD-1與PD-L1在乳腺癌中的表達(dá)及意義

張亞1，彭成浩2※

(1.無(wú)錫市第九人民醫(yī)院病理科，江蘇 無(wú)錫 214000； 2.棗莊市立醫(yī)院腫瘤研究所，山東 棗莊 277000)

摘要：目的探討免疫共刺激分子程序性死亡分子1(PD-1)及其配體PD-L1在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的表達(dá)及意義。方法收集2012年1月至2015年1月棗莊市立醫(yī)院和無(wú)錫市第九人民醫(yī)院經(jīng)手術(shù)及病理診斷證實(shí)為乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌且臨床資料完整的患者67例，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)PD-1 和PD-L1在乳腺乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織及癌旁組織中的表達(dá)，進(jìn)一步分析PD-1和PD-L1的表達(dá)與患者年齡、發(fā)病時(shí)月經(jīng)狀態(tài)、腫瘤部位、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果乳腺癌組織中PD-L1與PD-1的陽(yáng)性率分別為70.2%(47/67)和70.2%(47/67)，其癌旁組織中PD-L1 與PD-1的陽(yáng)性率分別為32.8%(22/67)和62.7%(42/67)。不同腫瘤的組織學(xué)分級(jí)、腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否的PD-L1和PD-1的陽(yáng)性表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。乳腺癌腫瘤組織分化程度越低，PD-L1和PD-1的表達(dá)陽(yáng)性率越高；出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者癌組織中PD-L1 和PD-1表達(dá)率明顯高于未出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移者(P<0.05)；腫瘤越大，乳腺癌組織中PD-L1和PD-1的表達(dá)陽(yáng)性率越高。結(jié)論P(yáng)D-1和PD-L1在乳腺癌組織中呈高表達(dá)，與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，是預(yù)后差的重要指標(biāo)之一，有望成為乳腺癌治療的新靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：乳腺癌；程序性死亡分子1及其配體；臨床病理；預(yù)后；治療靶點(diǎn)

全球乳腺癌發(fā)病率自20世紀(jì)70年代開(kāi)始逐年增高，我國(guó)乳腺癌的發(fā)病率近年來(lái)明顯上升，嚴(yán)重危害女性身心健康。近年來(lái)興起的免疫治療已成為繼手術(shù)、化療和放療后的一種新的腫瘤有效治療手段。針對(duì)人類表皮生長(zhǎng)因子受體2(human epithelial growth factor receptor 2,Her-2)異常擴(kuò)增的靶向藥物赫賽汀的廣泛應(yīng)用，使一部分Her-2過(guò)表達(dá)型乳腺癌患者明顯獲益。然而，仍有許多患者如三陰性乳腺癌對(duì)激素及赫賽汀等治療反應(yīng)差，預(yù)后不良。研究顯示，程序性細(xì)胞死亡分子1(programmed cell death 1,PD-L1)是新近發(fā)現(xiàn)的B7家族的免疫調(diào)節(jié)分子(B7 homolog 1,B7-H1)，具有免疫正性刺激作用，其配體為白細(xì)胞分化抗原28(cluster differentiation 28,CD28)家族成員的負(fù)性刺激受體PD-1[1]，廣泛表達(dá)于多種免疫細(xì)胞、上皮細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞，主要與腫瘤的免疫逃逸關(guān)系密切[2]。近年來(lái)研究顯示，人類許多腫瘤尤其是乳腺癌高表達(dá)免疫共刺激分子PD-L1，有望成為腫瘤治療的新靶標(biāo)[3-6]。目前，有關(guān)乳腺癌中PD-L1的系統(tǒng)研究國(guó)內(nèi)報(bào)道較少。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)PD-L1及其配體PD-1在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌及癌旁組織的表達(dá)，比較其表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系,可望為尋找乳腺癌治療的新靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料收集2012年1月至2015年1月在棗莊市立醫(yī)院和無(wú)錫市第九人民醫(yī)院經(jīng)手術(shù)及病理診斷證實(shí)為乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌且臨床資料完整的患者67例，年齡≤51歲30例，>51歲 37例；月經(jīng)狀態(tài)：未絕經(jīng)43例，已絕經(jīng)24例；腫瘤部位：外上+外下40例，內(nèi)上+內(nèi)下13例，中央?yún)^(qū)14例；組織學(xué)分級(jí)：Ⅰ級(jí)26例，Ⅱ級(jí)26例，Ⅲ級(jí)15例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移:陰性40例，陽(yáng)性27例；腫瘤大?。褐睆健? cm 34例，2 cm<直徑≤5 cm 27例，直徑>5 cm 6例。每例患者均選取腫瘤組織和癌旁組織進(jìn)行分析，癌旁乳腺組織取自67例乳腺癌患者距離癌組織2.5 cm以外的對(duì)應(yīng)乳腺組織。

1.2實(shí)驗(yàn)方法67例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌腫瘤組織和癌旁組織標(biāo)本均進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)PD-L1的表達(dá)。免疫組織化學(xué)檢測(cè)采用鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶法。實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。4%甲醛固定，石蠟包埋組織2～3 μm常規(guī)切片，脫蠟至水，乙二胺四乙酸抗原修復(fù)液行抗原修復(fù)，過(guò)氧化氫處理，按說(shuō)明書(shū)滴加相應(yīng)抗體，采用二氨基聯(lián)苯胺顯色。即用鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶法免疫組織化學(xué)試劑盒、兔抗人PD-L1及PD-1抗體、濃縮型二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒等所用試劑均購(gòu)自福州邁新試劑有限公司。同時(shí)分析PD-1和PD-L1的表達(dá)與患者年齡、發(fā)病時(shí)月經(jīng)狀態(tài)、腫瘤部位、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

PD-1和PD-L1細(xì)胞染色陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，呈清晰的棕黃色顆粒，細(xì)胞不著色或著色率<20%判斷為陰性表達(dá)，細(xì)胞著色率≥20%判斷為陽(yáng)性表達(dá)[3]。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1臨床病理特點(diǎn)67例乳腺浸潤(rùn)性癌均為女性，年齡30～78歲，中位年齡51歲；單側(cè)乳腺發(fā)病者60例，雙側(cè)乳腺發(fā)病者7例；67例病例病理學(xué)檢查證實(shí)為乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌(封三圖1)，癌旁乳腺組織經(jīng)病理檢查無(wú)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)(封三圖2)。所有患者術(shù)前未行放化療或任何其他抗腫瘤治療。

2.2PD-L1和PD-1在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌及癌旁組織中的表達(dá)免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，67例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中，腫瘤組織PD-L1分子陽(yáng)性率為70.2%(47/67)，其癌旁組織中PD-L1陽(yáng)性率為32.8%(22/67)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=18.67,P<0.05)(封三圖3、圖4)。

67例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中，腫瘤組織PD-1分子陽(yáng)性率為70.2%(47/67)，其癌旁乳腺組織中PD-1陽(yáng)性率為62.7%(42/67)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.22,P>0.05)(封三圖5、圖6)。

2.3PD-L1和PD-1在乳腺癌組織中的表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系不同年齡、發(fā)病時(shí)月經(jīng)狀態(tài)以及腫瘤部位PD-L1 和PD-1的陽(yáng)性表達(dá)率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；不同腫瘤的組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤大小的PD-L1 和PD-1的陽(yáng)性表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。乳腺癌腫瘤組織分化程度越低，PD-L1和PD-1的表達(dá)陽(yáng)性率越高；出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者癌組織中PD-L1和PD-1表達(dá)率明顯高于未出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移者；腫瘤越大，乳腺癌組織中PD-L1和PD-1的表達(dá)陽(yáng)性率越高。見(jiàn)表1。

a與Ⅰ級(jí)或5 d≤2 cm比較,P<0.05

3討論

免疫共刺激分子PD-L1是在免疫應(yīng)答中起重要作用的凋亡相關(guān)蛋白，能誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞與其配體PD-1結(jié)合后向T細(xì)胞傳遞抑制性信號(hào)出現(xiàn)凋亡，調(diào)節(jié)外周T細(xì)胞的免疫耐受，在機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1]。 近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1廣泛表達(dá)于人類多種腫瘤組織中，如卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、宮頸癌、腎癌等腫瘤組織微環(huán)境，能增加腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的凋亡和降低其免疫原性，與腫瘤的免疫逃逸關(guān)系密切，提示抗腫瘤免疫可能通過(guò)PD-1/PD-L1信號(hào)通路調(diào)控[2]。腫瘤組織中PD-1/PD-L1通路與腫瘤逃避免疫系統(tǒng)的破壞，是目前腫瘤研究中普遍關(guān)注的免疫治療目標(biāo)。用藥物阻斷PD-1/PD-L1通路能增強(qiáng)T細(xì)胞功能，引起腫瘤細(xì)胞裂解將為腫瘤治療打開(kāi)另一個(gè)新的窗口[3]。

研究顯示，乳腺癌組織中PD-L1的表達(dá)水平與腫瘤的組織學(xué)分級(jí)相關(guān)[3-4]，有望成為繼Her-2之后乳腺癌治療的又一個(gè)新的免疫治療靶標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，67例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中，腫瘤組織中PD-L1陽(yáng)性率為70.2%，其癌旁組織中PD-L1陽(yáng)性率為32.8%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。腫瘤組織PD-1陽(yáng)性率為70.2%，其癌旁組織中PD-1陽(yáng)性率為62.7%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明PD-1和PD-L1 在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌腫瘤組織中呈一致性高表達(dá)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)PD-1和PD-L1的表達(dá)與患者的腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)以及是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)相關(guān)。

PD-L1在腫瘤的免疫應(yīng)答過(guò)程中對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖具有重要影響，同時(shí)在相當(dāng)程度上弱化了腫瘤的免疫原性，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸，在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮至關(guān)重要的正性刺激作用[3]。Chen等[5]研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1在胃癌組織中的表達(dá)水平與腫瘤組織的浸潤(rùn)深度有關(guān)，同時(shí)PD-L1高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞株的侵襲性高于PD-L1低表達(dá)細(xì)胞株。乳腺癌研究中，Ghebeh等[4]評(píng)估了44例乳腺癌組織中PD-L1表達(dá)水平與患者臨床病理參數(shù)間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)PD-L1的表達(dá)并不局限于上皮乳腺組織也存在于淋巴細(xì)胞，與腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)、腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞、HER2/neu狀態(tài)等相關(guān)預(yù)后因素關(guān)系密切，但與雌、孕激素受體的表達(dá)關(guān)系不大，認(rèn)為PD-L1 可能是乳腺癌患者的重要危險(xiǎn)因素之一。進(jìn)一步研究顯示，乳腺癌組織中PD-L1的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞增殖之間直接關(guān)聯(lián)[6]；同時(shí)乳腺癌組織中調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的共表達(dá)PD-L1 和Foxp3也是一個(gè)預(yù)后差的指標(biāo)[7]。Muenst等[8]研究也證實(shí)，乳腺癌組織中PD-L1的表達(dá)與預(yù)后差關(guān)系密切。Chawla等[9]認(rèn)為PD-L1在乳腺癌細(xì)胞中異常表達(dá)，在腫瘤微環(huán)境中能招募調(diào)節(jié)性T細(xì)胞免疫逃逸，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞高度增生而導(dǎo)致預(yù)后差，而化療藥物阿霉素能下調(diào)乳腺癌細(xì)胞表面的PD-L1的表達(dá)。Mittendorf等[10]研究認(rèn)為，PD-L1可作為三陰性乳腺癌治療的重要靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，隨著腫瘤大小的增加、分化程度的降低和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)，PD-L1和PD-1的表達(dá)率逐漸升高。推測(cè)由于PD-L1和PD-1的高表達(dá)促使腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸，增加了增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)會(huì)，是值得深入研究的重要靶點(diǎn)。

綜上所述，PD-L1作為B7家族的重要成員，以其獨(dú)特的生物學(xué)功能在腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮著重要作用，乳腺癌中PD-1與PD-L1的高表達(dá)與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，推測(cè)阻斷PD-1/PD-L1通路可作為乳腺癌的潛在治療靶點(diǎn)，尤其是對(duì)三陰性乳腺癌的治療帶來(lái)了新的希望。

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The Significance of Co-stimulatory Molecules PD-1 and PD-L1 Expression in Breast CancerZHANGYa1，PENGCheng-hao2.(1.DepartmentofPathology,WuxiNinthPeople′sHospital,Wuxi214000,China; 2.TumorResearchInstituteofZaozhuangMunicipalHospital,Zaozhuang277000,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the clinical significance and expression of co-stimulatory molecular PD-1 and PD-L1 in breast invasive ductal cancer.MethodsFrom Jan.2012 to Jan.2015 in Zaozhuang City Hospital and Wuxi Ninth People′s Hospital,67 patients after surgery with pathologic confirmed invasive ductal carcinoma with complete clinical data were included.The expression of PD-1 and PD-L1 were detected in the breast cancer tissue and adjacent normal breast tissue using immunohistochemistry.The relationship between the expression of PD-1/PD-L1 and clinical pathological parameters such as patients′ age,menstrual status,tumor size,pathologic grade,and lymph node metastasis were analyzed.Results PD-L1 and PD-1 positive rate in breast cancer tissue was 70.2%(47/67) and 70.2%(47/67) respectively,the PD-L1 and PD-1 positive rate of the cancer adjacent tissues were 32.8%(22/67) and 62.7%(42/67).PD-L1 and PD-1 expression rate of different histological gradings,tumor sizes and lymph node metastasis state was statistically significantly different(P<0.05).The lower the breast tumor tissue differentiation,the higher PD-L1 and PD-1 expression positive rate;PD-L1 and PD-1 expression in with lymph node metastasis was signifi-cantly higher than those without lymph node metastasis(P<0.05);the bigger the tumor size,the higher the PD-L1 and PD-1 expression positive rate.ConclusionThe expression of PD-1 and PD-L1 in breast cancer tissue is high,which is closely related to the tumor invasion and metastasis,and is one of the important indicators of poor prognosis,and is expected to become a new target for the treatment.

Key words：Breast cancer; Programmed death-1/programmed death-ligand 1; Clinical pathology; Prognosis; Therapeutic target

收稿日期：2015-05-28修回日期：2015-09-25編輯：伊姍

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.24.046

中圖分類號(hào)：R737.9

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-2084(2015)24-4547-03