蒺藜皂苷對(duì)局灶性腦缺血大鼠腦組織PPARγ和NF-κB炎癥信號(hào)途徑表達(dá)的影響

翟鳳國(guó)，李厚忠，周福波，林　峰，關(guān)利新

(牡丹江醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，黑龍江 牡丹江 157011)

蒺藜皂苷對(duì)局灶性腦缺血大鼠腦組織PPARγ和NF-κB炎癥信號(hào)途徑表達(dá)的影響

翟鳳國(guó)，李厚忠，周福波，林峰，關(guān)利新※

(牡丹江醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，黑龍江 牡丹江 157011)

摘要：目的探討蒺藜皂苷對(duì)局灶性腦缺血大鼠腦組織過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)和核因子κB (NF-κB)炎癥信號(hào)途徑表達(dá)的影響，并進(jìn)一步探討其潛在的機(jī)制。方法將40只SD大鼠依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組和蒺藜皂苷低劑量組和高劑量組，每組10只，采用線栓法制備大鼠腦缺血/再灌注損傷模型。腦缺血/再灌注24 h后檢測(cè)大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)大鼠腦組織NF-κB、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細(xì)胞介素(IL)1β的水平；免疫印跡法檢測(cè)大鼠腦組織PPARγ蛋白表達(dá)水平。結(jié)果與模型組比較，蒺藜皂苷治療低劑量組和高劑量組大鼠神經(jīng)功能損傷明顯減輕[(1.8±0.7)分、(1.3±0.5)分比(2.3±0.7)分]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組NF-κB、TNF-α、IL-1β[(18.4±1.5) μg/mg、(916±128) pg/mg、(169±16) pg/mg]比較，蒺藜皂苷低劑量[(16.4±1.3) μg/mg、(257±110) pg/mg、(148±16) pg/mg]和高劑量組[(15.0±1.2) μg/mg、(665±72) pg/mg、(139±14) pg/mg]缺血腦組織NF-κB、 TNF-α和IL-1β水平明顯降低(P<0.05)。結(jié)論蒺藜皂苷可能通過(guò)激活PPARγ的表達(dá)，進(jìn)而抑制NF-κB炎癥信號(hào)途徑，抑制炎性因子的表達(dá)，降低炎癥反應(yīng)，從而減輕大鼠腦缺血/再灌注損傷而發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：腦缺血/再灌注；蒺藜皂苷；炎癥；核因子κB；過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ

缺血性腦血管疾病是嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一，具有高發(fā)病率、高致殘率的特點(diǎn)，是中老年人致死和致殘的主要疾病。目前臨床治療主要通過(guò)溶解血栓和神經(jīng)保護(hù)治療兩個(gè)途徑。溶栓治療療效肯定，但受限于過(guò)窄的治療時(shí)間窗(發(fā)病后6 h內(nèi))。盡管對(duì)腦缺血保護(hù)機(jī)制的研究不斷深入，但目前所有的神經(jīng)保護(hù)劑均處于實(shí)驗(yàn)階段，尚缺乏治療缺血性腦卒中療效確切的藥物，因此更多的研究轉(zhuǎn)向具有天然活性的神經(jīng)保護(hù)藥物。蒺藜皂苷是從蒺藜草全草中提取的有效組分之一，是以甾體皂苷為主的十多種皂苷的混合物,臨床主要用于心腦血管疾病的治療。已有研究表明[1-2]，蒺藜皂苷對(duì)腦缺血損傷具有腦保護(hù)作用，但具體機(jī)制仍不明確，尤其是炎癥反應(yīng)的相關(guān)作用研究較少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)大腦中動(dòng)脈缺血損傷模型進(jìn)一步探討蒺藜皂苷在腦缺血/再灌注損傷時(shí)腦保護(hù)作用的機(jī)制，從而為蒺藜皂苷臨床治療腦缺血損傷用藥提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康清潔級(jí)雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量270～320 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供[許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001]。所有大鼠常規(guī)飼料飼養(yǎng)，自由飲水和攝食，室內(nèi)安靜，每日光照12 h，室溫控制在 20~25 ℃，相對(duì)濕度保持在(40±16)%。

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥品及主要試劑蒺藜皂苷由吉林敖東洮南藥業(yè)股份有限公司提供，純度>90%。核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)和白細(xì)胞介素1β(interleukin-1 beta，IL-1β) 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。兔抗大鼠過(guò)氧化物酶體增殖物激活型受體γ(peroxisome proliferator activated receptor gamma,PPARγ)多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)圣克魯斯(SANTA CRUZ)公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物分組及給藥40只大鼠依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為4個(gè)組，即假手術(shù)組、模型組、蒺藜皂苷高劑量組(30 mg/kg)和蒺藜皂苷低劑量組(10 mg/kg)，每組10只。給藥組均于術(shù)前7 d灌胃給藥，每日灌胃1次。模型組和假手術(shù)組給予相同體積的生理鹽水。

1.2.2腦缺血模型的制備根據(jù) Longa等[3]的線栓法加以改進(jìn)，10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉，取頸部正中切口，鈍性分離左側(cè)頸總頸內(nèi)、外動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈。在頸外動(dòng)脈近分叉處剪一“V”形切口，插入頭端燒圓涂蠟呈鈍形的直徑為0.245 mm的尼龍魚(yú)線，線栓插入深度為18～20 mm(距離頸總動(dòng)脈分叉點(diǎn))，有輕微阻力時(shí)停止，扎緊并固定栓線，縫合皮膚，2 h后抽提栓線至頸總動(dòng)脈內(nèi)制備再灌注損傷模型。假手術(shù)組只分離血管，不插入尼龍線。

1.2.3神經(jīng)功能損傷評(píng)分參照Longa等[3]的5分法對(duì)腦缺血24 h后的大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。0分：無(wú)神經(jīng)功能缺損癥狀；1分：提尾懸空不能伸展對(duì)側(cè)前爪；2分：行走向右側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：行走困難,并向右側(cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，伴意識(shí)障礙。神經(jīng)功能缺損達(dá) 1～3分實(shí)驗(yàn)動(dòng)物納入實(shí)驗(yàn)。

1.2.4ELISA測(cè)定腦組織NF-κB、TNF-α和IL-1β的水平各組大鼠于腦缺血/再灌注24 h后斷頭取腦，取缺血側(cè)額頂葉皮質(zhì)腦組織，勻漿，按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作測(cè)定腦組織中NF-κB、TNF-α和IL-1β的表達(dá)。

1.2.5Western blot檢測(cè)腦組織PPARγ的表達(dá)水平大鼠于腦缺血/再灌注24 h后斷頭取腦，在冰上分離缺血側(cè)額頂葉皮質(zhì)腦組織100 mg加入到1 mL蛋白裂解液，勻漿，離心提取總蛋白，并測(cè)定蛋白濃度。經(jīng)灌膠、上樣、10%聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉等步驟后，分別加入兔抗大鼠PPARγ多克隆抗體(1∶500； SANTA CRUZ公司提供)、小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體(1∶2000；美國(guó)SANTA CRUZ公司提供)，4 ℃孵育過(guò)夜，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗(1∶2000)，室溫孵育 2 h，再經(jīng)TBST(加入吐溫20的三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液)洗膜，超敏增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒A液和B液反應(yīng)，壓片、X膠片曝光顯影、圖像采集。再用Image Pro-Plug 610圖像分析軟件測(cè)定目的條帶的累積吸光度值，以β-actin為內(nèi)參照，以目的條帶的吸光度值與β-actin條帶的吸光度值比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2結(jié)果

2.1蒺藜皂苷對(duì)大鼠腦缺血神經(jīng)功能損傷的影響假手術(shù)組大鼠神經(jīng)功能無(wú)損傷(0分)，模型組、蒺藜皂苷低劑量組、蒺藜皂苷高劑量組神經(jīng)功能損傷評(píng)分分別為(2.3±0.7)分、(1.8±0.7)分、(1.3±0.5)分，各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=17.14，P<0.05),腦缺血/再灌注24 h 后，模型組大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分明顯高于假手術(shù)組，蒺藜皂苷高劑量組明顯低于模型組(P<0.05)。

2.2蒺藜皂苷對(duì)大鼠腦組織NF-κB、TNF-α和IL-1β表達(dá)的影響腦缺血/再灌注24 h后，大鼠腦組織NF-κB、TNF-α和IL-1β的水平均明顯增高。與假手術(shù)組比較，模型組NF-κB、TNF-α和IL-1β水平均顯著升高(P<0.05)。與模型組相比，蒺藜皂苷低劑量缺血腦組織NF-κB、TNF-α和IL-1β的水平明顯降低(P<0.05)。高劑量組NF-κB、TNF-α的水平明顯降低，見(jiàn)表1。

2.3蒺藜皂苷對(duì)大鼠腦組織PPARγ蛋白表達(dá)水平的影響與假手術(shù)組相比，模型組、蒺藜皂苷低和高劑量組PPARγ蛋白水平降低(P<0.05)。與模型組相比，蒺藜皂苷低劑量和高劑量組缺血腦組織PPARγ蛋白表達(dá)水平明顯增加(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

3討論

腦缺血后，缺血區(qū)產(chǎn)生具有致炎作用的細(xì)胞因子可誘導(dǎo)多種黏附分子的表達(dá)，并進(jìn)一步促進(jìn)白細(xì)胞的浸潤(rùn)，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，加重腦損傷。因此，干預(yù)缺血性腦卒中炎癥反應(yīng)的某些環(huán)節(jié)可能成為治療缺血性卒中的新的有效途徑，而傳統(tǒng)中藥可通過(guò)干預(yù)炎癥反應(yīng)的各個(gè)環(huán)節(jié)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

NF-κB:核因子κB;TNF-α:腫瘤壞死因子α;IL-1β:白細(xì)胞介素1β;a與假手術(shù)組比較，P<0.01；b與模型組比較，P<0.05;c與蒺藜皂苷低劑量組比較，P<0.05

以往研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB是介導(dǎo)炎癥免疫、細(xì)胞增殖分化和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等作用的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于真核細(xì)胞中，腦缺血損傷時(shí)可激活NF-κB的表達(dá)[4]。NF-κB活化后能調(diào)控一系列基因的表達(dá)，如炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、一氧化氮合酶等，引發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[5-6]；而這些因子反過(guò)來(lái)又可以進(jìn)一步激活NF-κB，從而使NF-κB活化在組織間不斷擴(kuò)散，加重炎癥反應(yīng)[7]。

近年研究表明，PPARγ也與缺血性腦卒中的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[8]。PPARγ是核受體超家族成員之一，其激活后可以抑制腦組織缺血/再灌注導(dǎo)致的 NF-κB、IL-1β、環(huán)加氧酶2、TNF-α等轉(zhuǎn)錄因子和炎性細(xì)胞因子基因的表達(dá)，從而減輕炎性細(xì)胞在缺血灶的炎性浸潤(rùn)及細(xì)胞毒性作用，提示PPARγ表達(dá)的增強(qiáng)與抑制腦缺血/再灌注的炎性損傷密切相關(guān)，是調(diào)節(jié)腦缺血炎癥反應(yīng)的重要作用靶點(diǎn)[9-10]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠腦缺血/再灌注損傷模型，證實(shí)了蒺藜皂苷具有減輕腦缺血神經(jīng)功能損傷作用，即蒺藜皂苷對(duì)大鼠腦缺血具有神經(jīng)保護(hù)作用，這與以往研究相一致[1-2]。

此外，本研究結(jié)果顯示，腦缺血/再灌注24 h后大鼠腦組織PPARγ表達(dá)均明顯降低，NF-κB、TNF-α和IL-1β的表達(dá)均明顯增高，可以推斷腦缺血后抑制PPARγ表達(dá)、激活NF-κB表達(dá)，而NF-κB活化后引發(fā)的一系列病理生理過(guò)程，促進(jìn)了炎癥的發(fā)生、發(fā)展，從而加重了腦損傷；而蒺藜皂苷各劑量組可明顯增加大鼠缺血腦組織PPARγ的表達(dá)水平，且明顯降低缺血腦組織NF-κB、TNF-α和IL-1β的表達(dá)，提示蒺藜皂苷可能是通過(guò)增加大鼠缺血腦組織PPARγ的表達(dá)，進(jìn)而抑制NF-κB炎癥信號(hào)通路，減輕炎癥反應(yīng)，從而減輕缺血性腦損傷。

綜上所述，蒺藜皂苷可能通過(guò)激活PPARγ的表達(dá)，進(jìn)而抑制NF-κB炎癥信號(hào)途徑，抑制炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，從而減輕大鼠腦缺血/再灌注損傷而發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用。

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Effects of Saponins of Tribulus Terrestris on PPARγ and NF-κB Signaling Pathways Expression in Rat Brain Following Cerebral Ischemic InjuryZHAIFeng-guo,LIHou-zhong,ZHOUFu-bo,LINfeng,GUANLi-xin.(DepartmentofPharmacology,MudanjiangMedicalUniversity,Mudanjiang157011,China)

Abstract:ObjectiveTo study and explore the effect of tribulus terrestris on the expression of peroxisome proliferators γ(PPAR γ) and nuclear factor κB (NF-κB) inflammatory signaling pathways in rat brain tissue after focal cerebral ischemia,and further explore its potential mechanisms.MethodsAccording to random number table method,40 SD rats were randomly equally divided into sham operation group,cerebral ischemia-reperfusion model group,low-dose saponins of tribulus terrestris group and high-dose saponins of tribulus terrestris group.Cerebral ischemia reperfusion model was established with suture emboli method in middle cerebral artery of rats.Neurological deficit scores was measured 24 hours after the cerebral reperfusion.Content of NF-κB,tumor necrosis factor-α(TNF-α) and interleukin-1β(IL-1β) in rat brain was detected by ELISA;expression levels of PPARγ protein in rat brain was determined by Western blot.ResultsCompared with the model group,nerve function injury of low dose tribulus terrestris saponin treatment group and high dose group obviously reduced[(1.8±0.7) scores,(1.3±0.5) scores vs (2.3±0.7) scores],the difference was statistically significant(P<0.05).NF-κB,TNF-α and IL-1 β level of low dose saponins of tribulus group [(16.4±1.3) μg/mg,(257±110) pg/mg,(148±16) pg/mg]and high dose group [(15.0±1.2) μg/mg,(665±72) pg/mg,(139±14) pg/mg]were lower than those of the model group [(18.4±1.5) μg/mg,(916±128) pg/mg,(169±16) pg/mg](P<0.05).ConclusionSaponins of tribulus terrestris exerts the neuroprotective effect on cerebral ischemia-reperfusion injury in rats through inhibiting the inflammatory reaction,which may be associated with the increase of the PPARγ protein expression and inhibition of NF-κB inflammation signal pathway.

Key words:Cerebral ischemia-reperfusion; Saponins of tribulus terrestris; Inflammation; Nuclear factor κB; Peroxisome proliferator activated receptor γ

收稿日期：2014-11-10修回日期：2015-08-04編輯：伊姍

基金項(xiàng)目：黑龍江省自然科學(xué)基金(H201379)；黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(11551527)；黑龍江省衛(wèi)生廳科研課題(2012-276)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.24.043

中圖分類號(hào)：R966

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-2084(2015)24-4539-03