快速起搏對家兔心房肌鈣通道表達(dá)的影響及辛伐他汀的干預(yù)研究

章幫助，王聯(lián)發(fā)，陳　晨，黃猛珣

(解放軍第一〇五醫(yī)院心內(nèi)二科，合肥 230031)

論著

快速起搏對家兔心房肌鈣通道表達(dá)的影響及辛伐他汀的干預(yù)研究

章幫助，王聯(lián)發(fā)※，陳晨，黃猛珣

(解放軍第一〇五醫(yī)院心內(nèi)二科，合肥 230031)

摘要：目的通過建立快速起搏家兔模型，探討辛伐他汀對快速起搏早期心房肌細(xì)胞L型鈣離子通道α1C亞基信使RNA(mRNA)表達(dá)的影響。方法30只家兔按隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組(n=10)，心房快速起搏組(n=10)和辛伐他汀干預(yù)組(n=10) 三組。辛伐他汀干預(yù)組予以辛伐他汀5 mg/(kg·d) 灌胃2周，其余組以等量生理鹽水灌胃2周，對照組不行起搏，心房快速起搏組和辛伐他汀干預(yù)組行快速心房起搏(800次/min)建立家兔快速心房起搏模型，急性起搏8 h后取右心房組織，應(yīng)用半定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測心房肌L型鈣離子通道α1C亞基mRNA的表達(dá)。結(jié)果對照組L型鈣離子通道α1C亞基mRNA的相對拷貝數(shù)為 1.00±0.04，辛伐他汀干預(yù)組為0.89±0.04，心房快速起搏組為0.78±0.03。心房快速起搏組和辛伐他汀干預(yù)組L型鈣離子通道α1C亞基mRNA的相對拷貝數(shù)均顯著低于對照組(P<0.05)，心房快速起搏組L型鈣離子通道α1C亞基mRNA的表達(dá)水平低于辛伐他汀干預(yù)組(P<0.05)。結(jié)論辛伐他汀可以改善家兔快速起搏心房引起的心房肌L型鈣離子通道α1C亞基mRNA表達(dá)的下降。

關(guān)鍵詞:辛伐他??；快速起搏；L型鈣離子通道

心房顫動是指規(guī)則有序的心房電活動喪失，代之以快速無序的顫動波，是最嚴(yán)重的心房電活動紊亂之一，可引起心力衰竭、腦卒中等嚴(yán)重的并發(fā)癥，其防治一直是臨床實(shí)踐中的難點(diǎn)[1]。心房顫動的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，深入研究心房顫動的發(fā)病機(jī)制，尋找安全、有效的防治心房顫動的藥物是目前心血管領(lǐng)域的熱點(diǎn)。本研究通過建立快速家兔起搏模型，探討辛伐他汀對快速心房起搏早期心房肌細(xì)胞L型鈣離子通道α1C亞基信使RNA(mRNA)表達(dá)的影響。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物新西蘭大耳白家兔30只(普通級)，合格證號：scxk(蘇)2010-0002，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，雌雄不拘。30只家兔按隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、心房快速起搏組、辛伐他汀干預(yù)組，各10只。

1.2藥物及試劑①辛伐他汀片(杭州默沙東制藥有限公司生產(chǎn),批號：110782)；②美托洛爾注射液(無錫東方藥業(yè)生產(chǎn),批號：EE85)；③阿托品注射液(蕪湖市康奇制藥有限公司生產(chǎn)，批號：111115)；④RNA提取試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 (普洛麥格生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，美國)。3%戊巴比妥鈉溶液：戊巴比妥鈉(上海國藥集團(tuán)生產(chǎn)，批號：20120520)3 g溶解100 mL無菌生理鹽水，常溫保存。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1快速心房起搏模型的建 立經(jīng)兔耳緣靜脈注射肝素1000 U、 3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)，待兔完全麻醉后將其仰臥固定于兔臺(手術(shù)過程中根據(jù)麻醉情況隨時追加戊巴比妥鈉)。將固定于兔臺的家兔頸部備皮，頸部正中切開3～4 cm長的切口，用血管鉗逐層分離皮下組織和肌肉組織，分離并暴露右側(cè)頸內(nèi)靜脈，固定后置入1根5F四極電極導(dǎo)管，插入深度約6 cm至右心房，將導(dǎo)管電極與心電圖機(jī)電極相連，記錄家兔心內(nèi)膜心電圖，當(dāng)電極位于右心房時心內(nèi)膜心電圖示大A小V，對照組不行快速右心房起搏，心房快速起搏組和辛伐他汀干預(yù)組予以心臟電生理刺激儀連續(xù)單刺激模式(起搏周長 100 ms，脈寬 0.5 ms，電壓 4 V)進(jìn)行800次/min快速心房起搏刺激8 h，定時觀察家兔情況。

1.3.2標(biāo)本的采集和RNA的提取根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組，辛伐他汀干預(yù)組用5 mg/(kg·d)辛伐他汀灌胃2周，其余組以等量生理鹽水灌胃2周，分別在起搏8 h后采用空氣拴塞法快速處死家兔，無菌技術(shù)開胸，迅速取出心臟，在磷酸鹽緩沖液中漂洗心臟，取右心房組織充分勻漿，按照Trizol試劑盒操作說明提取總RNA。

1．3.3組織總RNA的質(zhì)量鑒定紫外分光光度儀測定RNA純度和濃度，吸光度比值：260/280 nm在1.8～1.9，取1 μL的總RNA溶液在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測，經(jīng)嗅化乙錠(ethidium bromide，EB)染色后觀察RNA質(zhì)量，28 s與18 s的吸光度比值約為2∶1。

1.3.4引物設(shè)計(jì)根據(jù)要求，在pubmed中查出的基因序列，由上海生工生物公司設(shè)計(jì)、合成，聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增的引物序列及反應(yīng)條件如下： 3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH),5′-CAGTGGCAAAGTGGAGATTGTTG-3′，5′-CAGTC-TTCTGGGTGGCAGTGAT-3′,55 ℃退火，循環(huán)36次，擴(kuò)增片段長度為491 bp。L型鈣離子通道α1C亞基，5′-CAAAGAACCAGCACCAGTACAA-3′，5′-CAGGATGAGAACGAACATCAGA-3′，56 ℃退火，循環(huán)36次，擴(kuò)增片段長度為80 bp。

1.3.5反轉(zhuǎn)錄-PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)檢測L型鈣離子通道α1C亞基mRNA的表達(dá)將1 μg總RNA行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后所得互補(bǔ)DNA作為模板，行DNA擴(kuò)增反應(yīng)。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(20 μL體系)步驟按照Promage試劑盒操作步驟進(jìn)行，PCR體系(50 μL)：5 μL互補(bǔ)DNA，25 μL PCR Master Mix，18 μL 無核酶水，上下游引物各1.5 μL。反應(yīng)產(chǎn)物在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳并拍照，凝膠成像分析系統(tǒng)對電泳帶進(jìn)行分析，以GAPDH為內(nèi)參照，測定目的基因和GAPDH擴(kuò)增產(chǎn)物的吸光度值，將其比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2結(jié)果

心房快速起搏組和辛伐他汀干預(yù)組L型鈣離子通道α1C亞基mRNA的相對拷貝數(shù)均顯著低于對照組(P<0.05)。心房快速起搏組L型鈣離子通道α1C亞基mRNA的表達(dá)水平低于辛伐他汀干預(yù)組(P<0.05)。見表1、圖1。

1：對照組； 2：心房快速起搏組； 3：辛伐他汀干預(yù)組； CAPDH：3-磷酸甘油醛脫氫酶

圖1L型鈣離子通道α1C亞基的mRNA產(chǎn)物的瓊脂糖電泳結(jié)果

CAPDH：3-磷酸甘油醛脫氫酶；a與對照組比較,P<0.05;b與心房快速起搏組比較,P<0.05

3討論

心房重構(gòu)在心房顫動的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，心房快速激動誘發(fā)心房重構(gòu)的重要因素是細(xì)胞內(nèi)鈣超載，鈣超載一方面刺激線粒體鈣泵攝鈣，使胞質(zhì)內(nèi)鈣向線粒體轉(zhuǎn)移，過多的鈣離子與線粒體內(nèi)含磷酸根的化合物結(jié)合成不溶性磷酸鈣，引起線粒體代謝異常、ATP生成減少，產(chǎn)生肌小節(jié)缺失、肌溶解，導(dǎo)致心房肌結(jié)構(gòu)重構(gòu)、心房肌收縮功能減退；另一方面，心房肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子增加負(fù)反饋引起鈣通道電流密度降低，導(dǎo)致心房電生理重構(gòu)，進(jìn)一步引起心房肌興奮收縮偶聯(lián)障礙。心肌細(xì)胞膜的L型鈣通道電流(L-type calcium current,ICa-L)在心房顫動鈣超載的過程中起重要作用，研究顯示，Ca2+通過L型鈣通道的內(nèi)流是一個多功能的信號，這一過程引發(fā)了心肌的收縮，控制動作電位的時程并且能調(diào)控基因的表達(dá)[2]，動物實(shí)驗(yàn)和臨床研究認(rèn)為，心房顫動對心房肌細(xì)胞ICa-L具有下調(diào)作用[3-4]，同時ICa-L的減少引起動作電位時程縮短及動作電位時程對頻率的適應(yīng)性下降，導(dǎo)致心房顫動的發(fā)生，有利于心房顫動的維持[5-6]。研究表明，α1C亞單位[7]為L型鈣通道的重要組成部分，可決定鈣通道的電壓依賴性和藥物敏感性，快速心房起搏[8]即可誘導(dǎo)鈣超載介導(dǎo)的心房肌L型電壓依賴鈣通道蛋白α1C亞單位表達(dá)下調(diào)。周賢惠等[9]發(fā)現(xiàn)，房性心動過速時ICa-L電流密度和ICa-L相應(yīng)α-mRNA 濃度均出現(xiàn)不同程度下降。本實(shí)驗(yàn)建立快速心房起搏家兔模型，通過PCR法觀察快速心房起搏8 h后L型鈣離子通道α1C亞基mRNA變化，電泳結(jié)果顯示目的基因及內(nèi)參GAPDH擴(kuò)增條帶位置和理論值相符，快速起搏8 h后心房肌L型鈣離子通道α1C亞基mRNA的表達(dá)明顯下降，證實(shí)了快速心房起搏8 h可引起L型鈣離子通道轉(zhuǎn)錄水平的適應(yīng)性下調(diào)，其機(jī)制可能是快速心房起搏早期引起細(xì)胞內(nèi)鈣超載負(fù)反饋?zhàn)饔玫慕Y(jié)果，以抑制Ca2+的過度內(nèi)流，減輕心肌細(xì)胞受高濃度Ca2+的損傷。

辛伐他汀為羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶抑制劑，廣泛應(yīng)用于臨床，傳統(tǒng)用于阻滯膽固醇的合成、治療高脂血癥。研究認(rèn)為[10]，他汀類藥物具有除治療高脂血癥之外的其他方面的作用，并不依賴于降血脂功能，稱之為他汀的多效性。2010 歐洲心臟病協(xié)會心房顫動指南[11]指出，通過動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)他汀類藥物具有較好的抗心律失常的作用，推薦作為心房顫動一級預(yù)防和二級預(yù)防(上游治療)的重要藥物。Young等[12]研究發(fā)現(xiàn),他汀類藥物服用的時間越長，劑量越大，心房顫動復(fù)律后的復(fù)發(fā)率就越低，說明他汀類藥物具有除降血脂、治療高膽固醇血癥作用之外的抗心律失常的作用。Alexander等[13]對29 088例65歲以上急性心肌梗死及冠狀動脈血運(yùn)重建患者的心房顫動發(fā)生情況進(jìn)行分析，他汀組5年和10年心房顫動發(fā)生率均低于對照組，此研究也支持他汀類藥物預(yù)防心房顫動的作用。到目前為止，他汀類藥物防治心房顫動的具體機(jī)制尚未明確，本研究結(jié)果顯示，辛伐他汀預(yù)處理可以改善快速起搏早期家兔心房肌L型鈣離子通道α1C亞基mRNA的表達(dá)下降，說明辛伐他汀對快速起搏家兔早期心房肌細(xì)胞的保護(hù)作用，可能為辛伐他汀防治心房顫動的分子機(jī)制之一，為他汀類藥物在臨床上抗心律失常的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Influence of Rapid Atrial Pacing on the Expression of L-type Calcium Channel and the Protective Effect of Simvastatin in RabbitsZHANGBang-zhu,WANGLian-fa，CHENChen，HUANGMeng-xun. (DepartmentTwoofCardiology，PLA105thHospital,Hefei230031,China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of simvastatin on mRNA expression of atrial α1c subunit of L-type calcium channel on atrial remodeling through establishing rapid atrial pacing rabbit models.MethodsTotal of 30 rabbits were divided into 3 groups according to random number table method：control group(n=10)，rapid pacing group(n=10) and simvastatin group(n=10).Simvastatin 5 mg/(kg·d) was given intragastricaly daily for two weeks before electrophysiology study in simvastatin group,normal saline was given intragastricaly in control and rapid pacing group instead.Control group with no pacing,while in simvastatin group and rapid pacing group,right atrium was paced at 800 beats/min for 8 hours to establish acute atrial fibrillation models,right atrium tissue was obtained for measurement of mRNA expression of α1c subunit of L-type calcium channel by reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR).ResultsIn the control group,the relative copy number of α1c subunit mRNA of L-type calcium channel was 1.00±0.04; 0.89±0.04 in simvastatin group,0.78±0.03 in rapid atrial pacing group.The relative copy number of α1C subunit mRNA of L-type calcium channel in rapid pacing group and simvastatin group were significantly lower than the control group(P<0.05),rapid pacing group lower than simvastatin group(P<0.05).ConclusionPretreatment with simvastatin can improve the degree of mRNA expression of α1c subunit of L-type calcium channel in rapid atrial pacing rabbit models.

Key words:Simvastatin； Rapid atrial pacing； L-type calcium channel

收稿日期：2014-12-29修回日期：2015-05-26編輯：相丹峰

基金項(xiàng)目：南京軍區(qū)聯(lián)勤部資助課題(11YG04)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.24.041

中圖分類號：R541.7

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)24-4534-03