腺病毒載體的研究進(jìn)展

劉　陽(綜述),杜聯(lián)芳(審校)

(上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院超聲科，上海 200080)

腺病毒載體的研究進(jìn)展

劉陽△(綜述),杜聯(lián)芳※(審校)

(上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院超聲科，上海 200080)

摘要：基因治療正在成為腫瘤治療的有效手段，用于攜帶外源基因的載體在腫瘤的基因治療中發(fā)揮了重要作用。其中腺病毒載體因宿主范圍廣、感染率高、病毒相對容易制備且不會與受染細(xì)胞發(fā)生整合等諸多優(yōu)點，成為基因治療中應(yīng)用最為廣泛的載體系統(tǒng)。腫瘤的基因病毒治療是指在腫瘤特異性增殖病毒中加入抗癌基因，將腫瘤的基因治療與病毒治療各自的優(yōu)勢結(jié)合起來，可靶向殺傷腫瘤細(xì)胞，保護(hù)正常細(xì)胞免受嚴(yán)重傷害。

關(guān)鍵詞：基因治療；腺病毒載體；靶向轉(zhuǎn)導(dǎo)；基因病毒治療

基因治療是一項治療惡性腫瘤的新策略，它將一段具有外源功能的基因?qū)胫聊[瘤細(xì)胞從而補(bǔ)償其基因缺失，達(dá)到抑制或殺傷腫瘤細(xì)胞的目的[1]。近年來，隨著腫瘤分子生物學(xué)的發(fā)展以及人們對腫瘤病因、分子機(jī)制的不斷深入研究，腫瘤基因治療也日趨成熟。由于腫瘤基因治療直接針對疾病根源，在惡性腫瘤治療方面較傳統(tǒng)治療方法顯示出獨特的優(yōu)勢，成為攻克惡性腫瘤領(lǐng)域的研究熱點，因而越來越受到醫(yī)學(xué)科研界的關(guān)注?，F(xiàn)對腺病毒載體的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1腺病毒載體的分類及特點

基因轉(zhuǎn)運技術(shù)是腫瘤基因治療的重要環(huán)節(jié)之一，因此尋找合適的基因轉(zhuǎn)運載體一直是研究的熱點。由于腺病毒載體具有諸多獨特的優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于人類疾病的基因治療。腺病毒是一種無被膜的二十面體病毒，目前已發(fā)現(xiàn)有50余種血清型，其中2型和5型研究得較多。腺病毒通過纖維蛋白與感染細(xì)胞表面的柯薩奇腺病毒受體結(jié)合繼而進(jìn)入細(xì)胞。在人體，柯薩奇腺病毒受體表達(dá)于各種正常上皮組織，但在許多腫瘤組織中存在柯薩奇腺病毒受體不同程度的下調(diào)或缺失[2-3]。因此，通過構(gòu)建腫瘤靶向性腺病毒載體，實現(xiàn)腺病毒對腫瘤細(xì)胞的靶向感染，從而完成目的基因的靶向轉(zhuǎn)導(dǎo)[3]。目前，腺病毒載體根據(jù)殺傷腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制不同分為兩類：復(fù)制缺陷型腺病毒和條件復(fù)制型腺病毒。

1.1復(fù)制缺陷型腺病毒復(fù)制缺陷型腺病毒能起到運輸載體，攜帶外源基因(抑癌基因、自殺基因等)的作用，將這些外源基因靶向轉(zhuǎn)導(dǎo)至腫瘤細(xì)胞，從而引起細(xì)胞死亡[4]。C系中的2型和5型人類復(fù)制缺陷型腺病毒載體由于以下優(yōu)勢成為基因治療，特別是腫瘤基因治療的常用傳遞工具：其在體內(nèi)穩(wěn)定存在，可插入較大的外源基因片段，容易制備且病毒滴度較高，宿主范圍廣，對許多分化和非分化細(xì)胞均具有較高的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)率，且不會整合入宿主基因組，在具有免疫活性的人體內(nèi)不會導(dǎo)致嚴(yán)重疾病。但復(fù)制缺陷型腺病毒表達(dá)外源基因的時間相對較短，這是由于該病毒沒有復(fù)制能力以及機(jī)體免疫系統(tǒng)的清除作用造成的[5]。

1.2條件復(fù)制型腺病毒條件復(fù)制型腺病毒能以高度的特異性在靶細(xì)胞中增殖并最終裂解該細(xì)胞，同時釋放出子代病毒再感染鄰近的腫瘤細(xì)胞，直至殺死所有腫瘤細(xì)胞，而對非靶細(xì)胞無殺傷作用[6]。近年來，特異性腫瘤細(xì)胞內(nèi)條件復(fù)制型腺病毒成為研究熱點，顯示出強(qiáng)大而特異的殺傷腫瘤細(xì)胞效應(yīng)[7]。

正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞存在差異表達(dá)的基因，有些基因在正常細(xì)胞內(nèi)是病毒復(fù)制及增殖所必需的，但在腫瘤細(xì)胞內(nèi)卻可以缺失，去除這些基因有望控制病毒僅在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，而對正常細(xì)胞無影響。另一種方法就是利用腫瘤特異性啟動子調(diào)控病毒復(fù)制所必需的基因，如E1A、E1B基因[8]。將腫瘤特異性啟動子插入至腺病毒復(fù)制必需基因E1A的上游，使該基因僅在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，而在其他細(xì)胞中不表達(dá)，如前列腺癌特異抗原啟動子、肝癌甲胎蛋白啟動子、結(jié)腸癌癌胚抗原啟動子等，但這些啟動子活性較弱，僅能針對特定組織起源的腫瘤，不能廣泛應(yīng)用于大多數(shù)腫瘤的治療[9]。另外，還有一種廣譜的腫瘤特異性啟動子hTERT。第三種方法是構(gòu)建嵌合型的腺病毒載體，使其不依賴于細(xì)胞表面的柯薩奇腺病毒受體，而通過腫瘤細(xì)胞表面其他特異性高表達(dá)受體進(jìn)入細(xì)胞，從而大大提高與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合能力。

2腺病毒載體的應(yīng)用現(xiàn)狀

基因的靶向轉(zhuǎn)導(dǎo)是通過載體與腫瘤細(xì)胞表面特有受體之間的特異識別完成的。實現(xiàn)特定細(xì)胞的靶向性，抗體與重組抗體結(jié)合域很有可能起重要作用，因為它們具有極好的親和力和特定的結(jié)合靶細(xì)胞表面受體的功能。在此基礎(chǔ)上，開發(fā)帶有遺傳學(xué)上抗體衍生部分的腺病毒載體一直是研究者的長期目標(biāo)。雖然可以利用具有遺傳作用的衣殼蛋白整合靶向配體(如單鏈抗體和生長因子)，然而卻被靶向配體和腺病毒衣殼蛋白之間內(nèi)在的生物不兼容性所嚴(yán)重阻礙。腺病毒衣殼蛋白的翻譯和折疊發(fā)生在由于核轉(zhuǎn)運和核內(nèi)病毒體組裝導(dǎo)致的細(xì)胞質(zhì)不斷減少的環(huán)境中[10]，與此相反，單鏈抗體的合成則發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的有氧環(huán)境中，然后通過高爾基體的連續(xù)分泌運送到細(xì)胞表面[11]。因此，腺病毒衣殼-單鏈抗體融合蛋白的細(xì)胞質(zhì)途徑抑制具有抗原識別能力的單鏈抗體的正確折疊，同時也減少了腺病毒病毒體的組裝和復(fù)制[12]。

目前的研究熱點是單鏈抗體靶向腺病毒載體對分泌的單鏈抗體的翻譯后修飾。單鏈抗體靶向腺病毒載體的實現(xiàn)是通過腺病毒與靶向單鏈抗體高度特異的結(jié)合，單鏈抗體利用合成的亮氨酸拉鏈樣二聚體結(jié)構(gòu)域與腺病毒衣殼蛋白在結(jié)構(gòu)相容性上達(dá)到最優(yōu)化，從而使兩者更好地結(jié)合[13]。研究結(jié)果表明，包含拉鏈結(jié)構(gòu)的腺病毒纖維分子三聚體整合到成熟病毒體中，在不需要切除靶向識別的情況下，拉鏈結(jié)構(gòu)就可以與抗體達(dá)到基因上的融合[10-12]。更重要的是，實驗證明拉鏈標(biāo)記的病毒體和單鏈抗體可以提供特定靶向的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)[14]。

單鏈抗體靶向腺病毒載體的研究描述了一種新的途徑，即利用分泌的單鏈抗體分子來生產(chǎn)靶向的腺病毒載體，避免腺病毒與一種復(fù)雜的靶向配體之間在結(jié)構(gòu)及生物上的不兼容性。這種方法通過使用種類繁多的靶向配體直接與多樣的細(xì)胞受體結(jié)合，使腺病毒靶向作用變得更加容易。

目前，腺病毒載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)仍面臨兩大難題：①某些靶細(xì)胞表面與腺病毒特異結(jié)合的受體表達(dá)不足或缺失，使腺病毒載體不能將目的基因有效地導(dǎo)入這些細(xì)胞(如腫瘤細(xì)胞、造血干細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等)，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率較低；②缺乏靶向性。由于腺病毒的宿主范圍較廣，在感染靶組織的同時也能感染其他正常組織，在體內(nèi)應(yīng)用時存在明顯的組織細(xì)胞非特異性分布，特別是易在肝臟內(nèi)聚集，產(chǎn)生不良反應(yīng)[15]。以上問題隨著腺病毒在臨床實踐中的應(yīng)用而日見突出，因此，臨床應(yīng)用時大都直接或通過介入方式將腺病毒注射到腫瘤內(nèi)，但是大量的腺病毒仍然會泄漏到循環(huán)血液中，產(chǎn)生非特異性分布[16]。這一問題已成為制約腺病毒在基因治療臨床實踐中廣泛應(yīng)用的瓶頸，迫切需要提高腺病毒載體的靶向性,構(gòu)建針對特定組織、細(xì)胞的靶向性腺病毒。

3溶瘤腺病毒及腫瘤的靶向基因病毒治療

溶瘤病毒又稱腫瘤增殖型病毒，近年來，溶瘤腺病毒作為潛在的腫瘤治療方法被不斷研究，溶瘤腺病毒載體可靶向地在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制數(shù)百倍到數(shù)千倍，其所攜帶的基因也可增加數(shù)百到數(shù)千倍，故大大增強(qiáng)了其對腫瘤細(xì)胞的殺傷性和特異性，其機(jī)制是通過直接溶解、分泌毒性蛋白以及激發(fā)免疫疫苗反應(yīng)等，與傳統(tǒng)化療及放療的作用機(jī)制完全不同，幾乎無交叉耐受性[17]。2001年，Kirn等[18]提出“病毒治療”這一概念，但單用病毒治療殺傷力不足。在腫瘤特異性增殖病毒中加入抗腫瘤基因，將腫瘤的基因治療與病毒治療各自的優(yōu)勢結(jié)合起來，這就是劉新垣[19]倡導(dǎo)的一種腫瘤治療新策略——癌癥的靶向基因病毒治療。該方法克服了傳統(tǒng)腫瘤基因治療轉(zhuǎn)染率低、靶向性殺傷腫瘤細(xì)胞能力差的缺點[20-21]。

溶瘤腺病毒特異性感染腫瘤細(xì)胞并在腫瘤細(xì)胞中大量復(fù)制，最終裂解腫瘤細(xì)胞并釋放出子代病毒以感染更多的腫瘤細(xì)胞，從而形成了感染、復(fù)制、裂解、再感染的多重?zé)o限循環(huán)，同時這些病毒因無法在正常機(jī)體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制而不具有殺傷作用，理論上溶瘤病毒具有更高的抗腫瘤效應(yīng)和更低的不良反應(yīng)，溶瘤腺病毒載體還可以攜帶治療基因，該治療基因可隨著病毒復(fù)制不斷表達(dá)，從而起到疊加的抑瘤效果[21-22]。此外，病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制通過誘導(dǎo)細(xì)胞因子和腫瘤抗原的釋放，可能有助于調(diào)動免疫系統(tǒng)。許多臨床試驗都是基于溶瘤病毒進(jìn)行的，目前已研制成功并已在腫瘤臨床研究中應(yīng)用的主要有腺病毒、新城疫病毒、單純皰疹病毒1、呼吸道腸道病毒等，其中腺病毒基因的結(jié)構(gòu)及其表達(dá)調(diào)控研究得較為深入[23]。

人類C系5型腺病毒的很多特征使其成為一個特別具有吸引力的溶瘤病毒構(gòu)建平臺，而不會導(dǎo)致任何嚴(yán)重疾病，并且人類C系5型腺病毒基因組已經(jīng)被很好地特征化，允許相對簡單的基因修飾[24]。據(jù)此，對衣殼蛋白特別是纖維做了修飾，從而能高效而特異地感染腫瘤細(xì)胞。最后它可以增長到高滴度，相對穩(wěn)定地存在于循環(huán)的血液中，從而提高對遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移治療的可能性。

4條件復(fù)制型腺病毒的應(yīng)用價值

條件復(fù)制型腺病毒作為腫瘤病毒治療的作用劑有很多優(yōu)勢且被安全地應(yīng)用于人類臨床試驗中，然而，其在溶瘤能力方面存在局限性，因此其效能還有待提高[25]。為此，條件復(fù)制型腺病毒被設(shè)計來表達(dá)具有治療作用的轉(zhuǎn)基因，其抗腫瘤作用的發(fā)揮與病毒直接溶瘤作用無關(guān)。在自身基因控制元素下這些轉(zhuǎn)基因被表達(dá)，這種情況下，轉(zhuǎn)基因在基因組中的位置決定了表達(dá)譜，或者它們能被外源啟動子所控制。用于包裝復(fù)制型腺病毒的治療轉(zhuǎn)基因大致可以分成3類：①介導(dǎo)殺死受感染的細(xì)胞；②調(diào)制腫瘤微環(huán)境；③具有免疫調(diào)節(jié)功能[26]?？傮w而言，對動物模型的研究，迄今結(jié)果已表明，選擇合適的治療轉(zhuǎn)基因包裝條件復(fù)制型腺病毒能提高其抗腫瘤效能。然而，要充分發(fā)揮包裝的條件復(fù)制型腺病毒在人類臨床中的作用，必須克服許多障礙。因此，通過靜脈注射直接擴(kuò)散到癌細(xì)胞已成為目前的研究熱點，既克服了免疫反應(yīng)，也增強(qiáng)了體內(nèi)生物分布的監(jiān)視以及包裝的條件復(fù)制型腺病毒的活性。

5結(jié)語

近年來，腺病毒載體的發(fā)展已取得不錯的成果，多種能夠靶向感染腫瘤細(xì)胞且具有腫瘤殺傷性的重組腺病毒正在被研發(fā)[27]。雖然有很多研究成果已經(jīng)進(jìn)入了臨床試驗階段，但是由于一些不可控因素，目前還沒有很理想的可應(yīng)用于臨床的腫瘤基因治療藥物。但隨著腺病毒研究的深入以及相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，相信在不久的將來，利用腺病毒載體基因治療腫瘤將會成為手術(shù)、化療、放療的補(bǔ)充治療手段，并將成為生物治療的常規(guī)方法。

參考文獻(xiàn)

[1]Das SK,Menezes ME,Bhatia S,etal.Gene therapies for cancer:strategies,challenges and successes[J].J Cell Physiol,2015，230(2)：259-271.

[2]Lee CH,Kasala D,Na Y,etal.Enhanced therapeutic efficacy of an adenovirus-PEI-bile-acid complex in tumors with low coxsackie and adenovirus receptor expression[J].Biomaterials,2014,35(21):5505-5516.

[3]毛晨宇.腺病毒載體介導(dǎo)的靶向性腫瘤基因治療研究[D].杭州：浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院,2009.

[4]Diaz-San Segundo F,Dias CC,Moraes MP,etal.Poly ICLC increases the potency of a replication-defective human adenovirus vectored foot-and-mouth disease vaccine[J].Virology,2014,468/470:283-292.

[5]Braucher DR,Henningson JN,Loving C,etal.Intranasal vaccination with replication-defective adenovirus type 5 encoding influenza virus hemagglutinin elicits protective immunity to homologous challenge and partial protection to heterologous challenge in pigs[J].Clin Vaccine Immunol,2012,19(11):1722-1729.

[6]Kim KH,Dmitriev IP,Saddekni S,etal.A phase I clinical trial of Ad5/3-Delta24,a novel serotype-chimeric,infectivity-enhanced,conditionally-replicative adenovirus (CRAd),in patients with recurrent ovarian cancer[J].Gynecol Oncol,2013,130(3):518-524.

[7]Xu J,Mo Y,Wang X,etal.Conditionally replicative adenovirus-based mda-7/IL-24 expression enhances sensitivity of colon cancer cells to 5-fluorouracil and doxorubicin[J].J Gastroenterol,2013,48(2):203-213.

[8]Wei F,Wang H,Chen X,etal.Dissecting the roles of E1A and E1B in adenoviral replication and RCAd-enhanced RDAd transduction efficacy on tumor cells[J].Cancer Biol Ther,2014,15(10):1358-1366.

[9]任繼鴻,龍敏,溫志遠(yuǎn),等.雙啟動子調(diào)控的條件復(fù)制腺病毒制備及其體外抑瘤作用[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2010,18(5):848-852.

[10]Reddy VS,Nemerow GR.Structures and organization of adenovirus cement proteins provide insights into the role of capsid maturation in virus entry and infection[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2014,111(32):11715-11720.

[11]Parker AL,Bradshaw AC,Alba R,etal.Capsid modification strategies for detargeting adenoviral vectors[J].Methods Mol Biol,2014,1089:45-59.

[12]Kaliberov SA,Kaliberova LN,Buggio M,etal.Adenoviral targeting using genetically incorporated camelid single variable domains[J].Lab Invest,2014,94(8):893-905.

[13]Ueyama K,Mori K,Shoji T,etal.Ocular localization and transduction by adenoviral vectors are serotype-dependent and can be modified by inclusion of RGD fiber modifications[J].PLoS One,2014,9(9):e108071.

[14]Hassan MH,Salama SA,Zhang D,etal.Gene therapy targeting leiomyoma:adenovirus-mediated delivery of dominant-negative estrogen receptor gene shrinks uterine tumors in Eker rat model[J].Fertil Steril,2010,93(1):239-250.

[15]Lam E,Falck-Pedersen E.Unabated Adenovirus replication following activation of the cGAS/STING dependent antiviral response in human cells[J].J Virol,2014,88(24):14426-1439.

[16]Trovato FM,Catalano D,Garozzo A,etal.ADV36 adipogenic adenovirus in human liver disease[J].World J Gastroenterol,2014,20(40):14706-14716.

[17]Martinez-Quintanilla J,He D,Wakimoto H,etal.Encapsulated stem cells loaded with hyaluronidase-expressing oncolytic virus for brain tumor therapy[J].Mol Ther,2015,23(1):108-118.

[18]Kirn D,Martuza RL,Zwiebel J.Replication-selective virotherapy for cancer:Biological principles,risk management and future directions[J].Nat Med,2001,7(7):781-787.

[19]劉新垣.一種抗癌新策略——腫瘤的基因病毒治療[J].中國腫瘤生物治療雜志,2001,8(1):1.

[21]齊榮.攜帶XAF1的復(fù)制型溶瘤腺病毒治療惡性腫瘤的研究[D].上海：上海交通大學(xué),2008.

[22]Fillat C,Maliandi MV,Mato-Berciano A,etal.Combining oncolytic virotherapy and cytotoxic therapies to fight cancer[J].Curr Pharm Des,2014,20(42):6513-6521.

[23]Fernandes P,Simao D,Guerreiro MR,etal.Impact of adenovirus life cycle progression on the generation of canine helper-dependent vectors[J].Gene Ther,2015,22(1):40-49.

[24]Hu H,Eller MA,Zafar S,etal.Preferential infection of human Ad5-specific CD4T cells by HIV in Ad5 naturally exposed and recombinant Ad5-HIV vaccinated individuals[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2014,111(37):13439-13444.

[25]Paupoo AA,Zhu ZB,Wang M,etal.A conditionally replicative adenovirus,CRAd-S-pK7,can target endometriosis with a cell-killing effect[J].Hum Reprod,2010,25(8):2068-2083.

[26]Lu Q,Yu DH,Fang C,etal.Influence of E3 region on conditio-nally replicative adenovirus mediated cytotoxicity in hepatocellular carcinoma cells[J].Cancer Biol Ther,2009,8(12):1125-1132.

[27]Fujimoto T,Yamane S,Ogawa T,etal.A novel complex recombinant form of type 48-related human adenovirus species d isolated in Japan[J].Jpn J Infect Dis,2014,67(5):416.

Research Progress of Adenovirus VectorLIUYang,DULian-fang.(DepartmentofUltrasound,ShanghaiJiaotongUniversityAffiliatedFirstPeople′sHospital,Shanghai200080,China)

Abstract:Gene therapy is becoming an effective mean of cancer treatment,and the carrier carrying exogenous gene has played an important role in tumor gene therapy.Adenovirus vector has many advantages,such as a wide range of hosts,high infection rate,easier to prepare and won′t be integrated into infected cells.Therefore,it has become the most widely used gene-carrier system.Adding anti-cancer gene into tumor-specific proliferation virus,banding together the advantages of gene therapy and virus therapy,known as gene-virotherapy,has an advantage of targeted killing of tumor cells while protecting normal cells from serious injury.

Key words:Gene therapy; Adenovirus vector; Targeted transduction; Gene-virotherapy

收稿日期：2015-02-05修回日期：2015-06-04編輯：相丹峰

基金項目：國家自然科學(xué)基金(81171352；81271596)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.24.008

中圖分類號：R730.59

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)24-4438-03