長鏈非編碼RNA在干細(xì)胞中的研究進(jìn)展

蔡　慧，王　琪，葉小娟(綜述)，高　勇※(審校)

(1.同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院腫瘤科，上海 200120； 2.同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院肺癌免疫實(shí)驗(yàn)室，上海 200433)

長鏈非編碼RNA在干細(xì)胞中的研究進(jìn)展

蔡慧1△，王琪2，葉小娟1(綜述)，高勇1※(審校)

(1.同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院腫瘤科，上海 200120； 2.同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院肺癌免疫實(shí)驗(yàn)室，上海 200433)

摘要：長鏈非編碼RNA(LncRNAs)是一類長度大于200個(gè)核苷酸且不具有蛋白質(zhì)編碼功能的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。早先，LncRNAs被認(rèn)為不具有生物學(xué)功能，只是轉(zhuǎn)錄過程中的副產(chǎn)物。近年來，隨著對(duì)LncRNAs 研究的不斷深入，人們的觀念正在發(fā)生改變?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，LncRNAs參與細(xì)胞生長、分化、增殖、凋亡等多項(xiàng)生命活動(dòng)，且與人類多種疾病密切相關(guān)。近年來有關(guān)LncRNAs與干細(xì)胞的研究正在引起人們的關(guān)注，這些研究提示LncRNAs參與多種干細(xì)胞自我更新和分化的調(diào)控。

關(guān)鍵詞：長鏈非編碼RNAs；干細(xì)胞；自我更新；分化；腫瘤

隨著人類基因組計(jì)劃的不斷推進(jìn)，人們發(fā)現(xiàn)90%以上的基因組DNA能轉(zhuǎn)錄成RNA，而其中不足2%編碼蛋白質(zhì)[1-2]，其余不能編碼蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物被稱為非編碼RNA(non-coding RNAs,ncRNAs)[3]。根據(jù)長度不同，ncRNAs可以分為短鏈ncRNAs和長鏈ncRNAs(long ncRNAs,LncRNAs)。LncRNAs 缺乏特異完整的開放閱讀框，幾乎不具有蛋白編碼功能。近年來有研究報(bào)道LncRNA參與干細(xì)胞多種生物學(xué)特性的調(diào)控[4]?，F(xiàn)將對(duì)LncRNAs在干細(xì)胞中的研究進(jìn)展予以綜述，重點(diǎn)剖析LncRNAs與干細(xì)胞自我更新和多向分化之間的關(guān)聯(lián)。

1LncRNAs的概念

LncRNAs是一類長度通常大于200個(gè)核苷酸，缺少特異完整的開放閱讀框，不具有或幾乎不具有蛋白質(zhì)編碼功能的RNA，在總ncRNAs中占有相當(dāng)大的比例。LncRNA起初被認(rèn)為是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”，因其數(shù)量、種類、功能狀況均不明確，且尚缺乏有效的研究手段，故又被稱作基因組中的“暗物質(zhì)”[5]。盡管這些RNA不能編碼蛋白質(zhì)，卻能在基因表達(dá)的多個(gè)環(huán)節(jié)(包括表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等)發(fā)揮調(diào)控作用。

2LncRNAs的結(jié)構(gòu)、分類和功能

LncRNAs與mRNA相似，經(jīng)過剪切，具有多聚腺苷酸(polyA)尾和啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)。LncRNAs具有較低的進(jìn)化保守性，其在細(xì)胞中的表達(dá)水平也明顯低于編碼蛋白的RNAs。大約2/3的LncRNAs來源于基因之間的廣大基因組區(qū)域，其余的則來源于與編碼蛋白的基因重疊、反義或基因內(nèi)區(qū)域。根據(jù)與編碼蛋白基因的位置關(guān)系，LncRNAs大致分為正義(sense)、反義(antisense)、雙向(bidirectional)、基因內(nèi)(intronic)和基因間(intergenic)5種類型[6]。通過在不同組織和細(xì)胞中進(jìn)行高通量的RNA測序?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)LncRNAs的表達(dá)還具有明顯的組織和細(xì)胞特異性[7-13]。近年來大量研究表明，LncRNAs 與許多細(xì)胞學(xué)功能有著密切的聯(lián)系[14-17]。如LncRNA 可以作為短鏈ncRNAs的前體，形成微RNA以及內(nèi)源小干擾RNA，還可以作為微RNA“分子海綿”，對(duì)有活性的微RNA產(chǎn)生長效的抑制作用[15]；在細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)以及蛋白復(fù)合物的形成過程中LncRNA發(fā)揮“腳手架”的作用[16]，可以將兩個(gè)或兩個(gè)以上的蛋白分子“綁和”形成復(fù)合物。簡言之，LncRNAs可以通過與ncRNAs，mRNA，基因組DNA以及多種蛋白質(zhì)相互作用在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯水平以及表觀遺傳等多個(gè)層面影響細(xì)胞的生命活動(dòng)。

3LncRNAs與干細(xì)胞

干細(xì)胞是一類能夠自我更新并具有多向分化潛能的細(xì)胞。在一定條件下，它們能夠分化成多種成熟的功能細(xì)胞。近年來關(guān)于LncRNAs在干細(xì)胞中的研究層出不窮。

3.1LncRNA與胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells,ESCs) ESCs通常是由早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(如桑葚胚，囊胚)或原始生殖細(xì)胞經(jīng)體外分化抑制培養(yǎng)篩選出的一類多能干細(xì)胞，在體外具有無限增殖、自我更新和多向分化的能力。最近研究已經(jīng)證實(shí)LncRNAs在維持人類ESCs自我更新能力和多能性方面具有重要作用[17]。

Guttman等[14]最先對(duì)基因間的長鏈ncRNAs(large intergenic non-coding RNA，LincRNAs)在ESCs中的表達(dá)和功能做了一系列研究，RNA測序結(jié)果顯示有226條LincRNAs在鼠ESCs中顯著高表達(dá)。他們發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)的LincRNA(約93%)對(duì)ESCs中的基因表達(dá)有明顯的調(diào)控作用，有26條LincRNAs 能夠顯著影響多能性調(diào)控因子Nanog的表達(dá)水平，表明LincRNAs在維持干細(xì)胞多能性以及抑制細(xì)胞分化中起到重要作用。他們還發(fā)現(xiàn)，有13條LincRNAs與ESCs內(nèi)胚層的分化有關(guān)，7條與外胚層的分化有關(guān)，5條與神經(jīng)外胚層分化相關(guān)，7條與中胚層的分化相關(guān)，2條與滋養(yǎng)外胚層的分化相關(guān)。這說明LincRNA在ESCs的種系特異性分化中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。隨后他們還研究了ESCs中的LincRNA是否受到多能性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Oct4,Sox2,Nanog,cMyc,nMyc,KLF4,ZFX,Smad and TCF30)的調(diào)控。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有75%的LincRNA的啟動(dòng)子區(qū)域能與至少一條多能性轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合，說明這些LincRNAs是多能性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的作用靶點(diǎn)。此外還發(fā)現(xiàn)有74條(30%)的LincRNAs與ESCs中重要的染色質(zhì)修飾蛋白密切相關(guān)。

Dinger等[18]在鼠ESCs中發(fā)現(xiàn)了12條LncRNAs與轉(zhuǎn)錄因子Pou5f1、Nanog、Sox2的表達(dá)譜相似，這些轉(zhuǎn)錄因子在維持ESCs多能性狀態(tài)中具有重要作用。隨后運(yùn)用染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)以及抗-Pou5f1和抗-Nanog抗體進(jìn)一步證實(shí)了這些LncRNAs確實(shí)與Pou5f1和Nanog相結(jié)合[19]。

Ng等[20]也發(fā)現(xiàn)了36條LncRNAs的表達(dá)譜與Oct4和Nanog相似，而Oct4和Nanog在ESCs中普遍高表達(dá)且在分化成熟的細(xì)胞中表達(dá)降低。LncRNAs表達(dá)譜芯片結(jié)果顯示，在人類ESCs和神經(jīng)前體細(xì)胞中有934條LncRNAs的表達(dá)有明顯差異，其中有36條LncRNAs在神經(jīng)前體細(xì)胞中顯著下調(diào)。隨后他們挑選了3條LncRNAs(ES1，ES2，ES3)做進(jìn)一步的功能性研究，發(fā)現(xiàn)這3條LncRNA中任意一條被沉默以后，均會(huì)促使ESCs分化。RNA免疫沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞核內(nèi)ES1和ES2與多梳基因家族成員SUZ12以及多能性調(diào)控因子SOX2密切相關(guān)。

Sheik Mohamed等[21]通過免疫沉淀反應(yīng)，找到了一組與Oct4和Nanog結(jié)合的LncRNAs，并對(duì)這些RNAs做了后續(xù)的測序?qū)嶒?yàn)，隨后干擾了這些LncRNAs的表達(dá)并觀察了ESCs分化活動(dòng)的變化，結(jié)果提示，有部分與Oct4和Nanog結(jié)合的LncRNAs具有調(diào)控Oct4和Nanog的作用。

這些研究表明，ESCs的多能性以及種系特異性分化受到LncRNA作用網(wǎng)絡(luò)的嚴(yán)密調(diào)控，而這些LncRNAs中又有很大一部分受到ESCs內(nèi)眾多轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。

3.2LncRNAs與誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(Induced pluripotent stem cells，iPSCs) 已經(jīng)分化成熟的體細(xì)胞(如纖維母細(xì)胞、卵母細(xì)胞等)可以在OCT4、SOX2、 KLF4 (OSK)、c-myc等轉(zhuǎn)錄因子的誘導(dǎo)下，通過重編碼形成與ESCs及其類似的一類多能干細(xì)胞，稱為iPSCs[22-23]。這類干細(xì)胞具有多向分化的能力，可以分化成幾乎所有的細(xì)胞類型。近年來關(guān)于iPSCs與LncRNAs 的研究也受到人們的廣泛關(guān)注。

在絕大多數(shù)iPSCs中，LncRNA-Gtl2的表達(dá)常被抑制，Gtl2基因呈母系表達(dá)，且能抑制父系基因Dlk1的表達(dá)，后者與Gtl2處于同一個(gè)基因簇(Dlk1-Dio3)并參與胎兒生長的調(diào)控[24]。此外，定位于Dlk1-Dio3基因簇中的26條miRNAs在非四倍體互補(bǔ)態(tài)和四倍體互補(bǔ)態(tài)的iPSCs中也呈差異表達(dá)。iPSCs中Dlk1-Dio3基因簇的沉默可直接導(dǎo)致這些iPSCs的發(fā)育受到阻滯。

Loewer等[25]對(duì)iPSCs中LncRNAs的表達(dá)與ESCs進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn) 28條lncRNAs對(duì)生成iPSCs有選擇性優(yōu)勢。隨后他們又從中篩選出3條可以與多能性轉(zhuǎn)錄因子(Nanog,Oct4,Sox2)結(jié)合的LncRNAs(lncRNA-SFMBT2,lncRNAVLDLR和lncRNA-ROR)。lncRNA-ROR在iPSCs中顯著高表達(dá)，并受到多能性轉(zhuǎn)錄因子(OCT4,SOX2和NANOG)的直接調(diào)控。進(jìn)一步的研究顯示，ROR被下調(diào)以后，可以明顯抑制iPSCs的成球能力，而反之則能促進(jìn)iPSCs的成球能力[25]。ROR還可以抑制p53的活性，這提示ROR之所以能夠促進(jìn)iPSCs的自我更新和分化，原因之一可能是它抑制了iPSCs的凋亡。

Wang等[26]對(duì)ROR的功能進(jìn)行了更深入的研究，同樣發(fā)現(xiàn)ROR在調(diào)節(jié)干細(xì)胞多能性方面起重要調(diào)控作用。由于LncRNAs 可以作為“分子海綿”對(duì)miRNA起競爭性抑制作用從而阻斷這些miRNAs下游靶基因的功能，研究者隨后就ROR是否可以作為miRNA“海綿”從而對(duì)Oct4和Nanog進(jìn)行調(diào)控進(jìn)行了驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)證明ROR可以降低體內(nèi)環(huán)境中miR145的表達(dá)水平，從而阻斷miR145對(duì)Oct4,Sox2和Nanog的依賴性抑制作用，促進(jìn)了干細(xì)胞的分化[26]。

3.3lncRNAs與成體干細(xì)胞由于成體干細(xì)胞可以從人體各個(gè)不同的組織中分離獲得，并具有分化成多種成熟細(xì)胞系的能力，所以被人們廣泛應(yīng)用于臨床研究，相比于ESCs而言，這避免了許多倫理和法律的約束。

Zuo等[27]在間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化的研究中發(fā)現(xiàn)有116條LncRNAs在分化過程中呈差異性表達(dá)。另外，Kretz等[28]在研究中發(fā)現(xiàn)，LncRNA-ANCR在上皮細(xì)胞分化過程中表達(dá)量有所下降，它能夠調(diào)節(jié)一系列基因的表達(dá)從而抑制上皮細(xì)胞的分化。Ramos等[29]研究表明，LncRNA-Six3os和Dix1as在神經(jīng)干細(xì)胞中對(duì)膠質(zhì)神經(jīng)元種系特異性具有調(diào)節(jié)作用。此外，Yildirim等[30]證實(shí)了LncRNA-Xist在維持造血干細(xì)胞活性中占有不可或缺的地位。

Sun等[31]對(duì)體外培養(yǎng)的前脂肪細(xì)胞、棕色和白色脂肪細(xì)胞以及單個(gè)的成熟脂肪細(xì)胞進(jìn)行RNA測序，結(jié)果顯示有20條 LncRNA在脂肪形成的過程中呈上調(diào)趨勢。隨后利用RNA干擾技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，這些LncRNAs的表達(dá)沉默可以導(dǎo)致幾乎所有的成熟脂肪細(xì)胞向前體脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)變。此外，Pang等[32]研究表明，PU.1基因的反義LncRNA可以與PU.1基因的mRNA結(jié)合形成mRNA/LncRNA二聚體抑制PU.1的翻譯，促進(jìn)前脂肪細(xì)胞的分化成熟。

3.4LncRNAs與腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs) CSCs的概念最早是在19世紀(jì)60年代由Cohnheim提出的，研究者認(rèn)為腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是由于腫瘤中存在一類為數(shù)不多但具有干細(xì)胞特征的細(xì)胞[33]。近年來隨著技術(shù)水平的提高(如流式細(xì)胞分析和細(xì)胞分選技術(shù)等的廣泛應(yīng)用)，以及各種動(dòng)物模型的建立，CSCs的概念已經(jīng)被越來越多的學(xué)者所認(rèn)可并加以研究。CSCs具有干細(xì)胞的多種特征，包括自我更新和多向分化的潛能。它們可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、分裂，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的分化[34]。

最近的研究表明，在ESCs的分化中起到關(guān)鍵作用的信號(hào)通路(如OCT4,SOX2,KLF4和PcG等)在CSCs中同樣處于激活狀態(tài)[35-38]。同時(shí)有報(bào)道，OCT4、SOX2等信號(hào)通路受到LncRNAs 的調(diào)控[26]，并且LncRNAs與腫瘤的相關(guān)研究近年來受到廣泛關(guān)注。這些信息提示LncRNAs與CSCs分化也極有可能存在重要的調(diào)控關(guān)系。

研究表明，多梳基因如PcG在調(diào)節(jié)ESCs的自我更新和分化過程中起關(guān)鍵作用，而多梳基因信號(hào)通路又與多種腫瘤有密不可分的聯(lián)系[38]。有研究者推斷，LncRNA有可能通過與多梳基因復(fù)合物相互作用，抑制CSCs分化的進(jìn)行[38]。

先前已有多項(xiàng)研究證明有部分ncRNAs尤其是miRNAs在CSCs的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。如Han等[39]在2010年報(bào)道了miR-29a可以調(diào)控早期的造血過程，并誘導(dǎo)急性髓細(xì)胞白血病的發(fā)生，其中重要的機(jī)制之一就是miR-29a可以通過影響多個(gè)腫瘤抑制基因和細(xì)胞周期蛋白的活性，導(dǎo)致骨髓祖細(xì)胞往白血病干細(xì)胞方向轉(zhuǎn)變。Bitarte等[40]則發(fā)現(xiàn)miR-451可以調(diào)控CSCs的多種干細(xì)胞能力，包括自我更新，腫瘤形成以及耐藥性。在細(xì)胞成球培養(yǎng)中，下調(diào)miR-451可以增加巨噬細(xì)胞移動(dòng)因子和多能性轉(zhuǎn)錄因子SOX2的表達(dá)，使細(xì)胞獲得自我更新和腫瘤形成的能力。巨噬細(xì)胞移動(dòng)因子和SOX2同時(shí)又參與Wnt信號(hào)通路的激活，而Wnt信號(hào)通路對(duì)于結(jié)腸癌干細(xì)胞活性的維持是至關(guān)重要的[41]。這又進(jìn)一步說明miR-451可以通過調(diào)控Wnt信號(hào)通路來影響干細(xì)胞活性。近期有學(xué)者提出LncRNAs在調(diào)節(jié)CSCs分化的過程中，其中可能的一個(gè)機(jī)制是作為“分子海綿”，對(duì)miRNAs產(chǎn)生長效的抑制作用，從而對(duì)CSCs的干細(xì)胞活性產(chǎn)生間接調(diào)控的作用。如Kallen等[42]最近的研究發(fā)現(xiàn)LncRNA-H19就可以作為Let-7 家族的miRNAs的“分子海綿”從而影響Let-7的多種生物學(xué)功能。而此前Yu等[43]已經(jīng)證實(shí)Let-7是乳腺癌干細(xì)胞中重要的調(diào)控因子，分別通過影響RAS和高遷移率族蛋白A2來調(diào)控干細(xì)胞的自我更新和分化的能力?？茖W(xué)家們期待有更多的研究能夠針對(duì)LncRNA作為“分子海綿”影響CSCs活性方面提供更多更有力的證據(jù)。

4結(jié)語

近年來，LncRNAs對(duì)干細(xì)胞的調(diào)控作用引起人們廣泛關(guān)注[17]。LncRNAs對(duì)干細(xì)胞的自我更新及分化能力確有明顯的調(diào)控作用。然而，現(xiàn)有研究絕大部分局限于分子水平，尚缺乏可靠的體內(nèi)試驗(yàn)為這些結(jié)論提供更加強(qiáng)有力的支持。今后的研究除了要對(duì)LncRNAs在干細(xì)胞中的作用機(jī)制做更深入的探討，動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也同樣重要，這將為人們提供更強(qiáng)有利的證據(jù)以揭示LncRNAs在人類多種疾病中發(fā)揮的功能，使LncRNAs有望成為人們?cè)\斷疾病的重要分子標(biāo)志物，并為疾病的治療提供新的手段。

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Research Advances of Long-non Coding RNAs in Stem CellsCAIHui1,WANGQi2,YEXiao-juan1,GAOYong1. (1.DepartmentofOncology,EastHospital,TongjiUniversity,Shanghai200120,China; 2.DepartmentofLungCancerandImmunology,ShanghaiPulmonaryHospital,TongjiUniversity,Shanghai200433,China)

Abstract:Long non-coding RNAs(LncRNAs) are a sort of non-protein-coding transcriptional products that are composed of more than 200 nucleotides.In the past,LncRNAs were thought as non-functional by-products of transcription,however,the notion is changing with increasing studies for LncRNAs function.It has been shown that LncRNAs are involved in the regulation of cell growth,differentiation,proliferation and apopatosis,and are associated with multiple human diseases.Recently，studies concerning LncRNAs and stem cells are attracting people′s attention,the results indicated that LncRNAs are involved in self-renew and differentiation of various stem cells.

Key words：Long non-coding RNAs; Stem cells; Self-renewal; Differentiation; Tumor

收稿日期：2015-03-24修回日期：2015-06-01編輯：相丹峰

基金項(xiàng)目：上海市醫(yī)學(xué)重點(diǎn)?？平ㄔO(shè)(ZK2012A26);浦東新區(qū)衛(wèi)生系統(tǒng)重點(diǎn)學(xué)科群建設(shè)(PWZxq2014-04);上海市浦東新區(qū)衛(wèi)生系統(tǒng)領(lǐng)先人才培養(yǎng)計(jì)劃(PWRL2013-02)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.24.005

中圖分類號(hào)：R394

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-2084(2015)24-4429-04