慢性淋巴細胞白血病的遺傳基礎

劉宇宏，李曉勇(綜述)，張王剛(審校)

(1.延安大學附屬醫(yī)院 a.血液免疫科,b.普外科，陜西 延安 716000; 2.西安交通大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院血液科,西安 710004)

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慢性淋巴細胞白血病的遺傳基礎

劉宇宏1a，李曉勇1b(綜述)，張王剛2※(審校)

(1.延安大學附屬醫(yī)院 a.血液免疫科,b.普外科，陜西 延安 716000; 2.西安交通大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院血液科,西安 710004)

摘要：慢性淋巴細胞白血病(CLL)首次提出疾病中體細胞突變和甲基化改變。這個觀點總結(jié)了本領域的最新發(fā)現(xiàn)和對腫瘤影響。從患者僅有的10%～15%基因突變到低頻率相對大范圍基因突變，基因組的研究揭示了疾病顯著的分子異質(zhì)性。NOTCH1和SF3B1突變啟動了疾病進展。廣泛的基因組研究顯示CLL轉(zhuǎn)變和增強子區(qū)大范圍低甲基化有關。這種表觀遺傳學程序保留了原始和記憶B細胞起源假設。CLL表觀遺傳學和基因組研究為更多個體化診斷和潛在治療靶點提供了新的前景。

關鍵詞：慢性淋巴細胞白血??；DNA甲基化；基因突變

慢性淋巴細胞白血病(chronic lymphocytic leukemia,CLL)是免疫功能缺陷的B淋巴細胞惡性增殖性疾病，它的特點是富有單克隆CD5+B 細胞和多樣化的臨床進展[1-2]。CLL分為兩類，不同的臨床特點主要與uCLL(無IgVH突變)和mCLL (有IgVH突變)相關，這兩個亞型根據(jù)體細胞在免疫球蛋白重鏈可變區(qū)數(shù)量的增減而分。尤其伴有11q22~q23和17p13缺失等染色體的改變和疾病的不良預后有關，但是，13q14的缺失往往伴有疾病好的預后[3]。突變基因在不同路徑聚集，包括NOTCH1信號路徑及RNA剪接，先天炎癥反應，DNA損害和細胞周期調(diào)控涉及的信號路徑，最終啟動疾病進展。另外基因組的變化，癌細胞顯示表觀遺傳修飾密碼的改變。這些機制包括：DNA甲基化，組蛋白乙酰化，核染色質(zhì)的可取性，通過非編碼RNAs的基因調(diào)控[4]。和其他白血病相似，CLL顯示諸如腫瘤抑制因子啟動子區(qū)高甲基化導致基因沉默[5]。相對遺傳修飾，CLL表觀遺傳學改變的臨床影響還沒有很好的建立。

1CLL的細胞起源

CLL的細胞起源假設是有爭論的。免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(IgVH)基因體細胞突變差異，序列組成，B細胞受體反應性反映了CLL在B細胞的不同成熟階段，缺乏重要的體細胞IgVH突變uCLL和存在IgVH體細胞突變mCLL[6]?；虮磉_的分析研究已經(jīng)證實了uCLL和mCLL有較小的差異，這表明兩者的亞型起源于單個細胞(比如經(jīng)典抗原，記憶B細胞)[7]。在全基因組的表觀遺傳學研究已經(jīng)證實，分析uCLL和mCLL DNA甲基化差異有助于理解不同B細胞亞群的相似性。尤其是uCLL與幼稚B細胞(IgD+和CD27-)和CD5+成熟B細胞生發(fā)中心(CD5+,IgD+，CD27+)相似，然而，mCLL和類別轉(zhuǎn)換的記憶B細胞(IgM/D+IgA/G+,CD27+)更相似。有趣的是，這項研究證實了第三組CLL起源于B細胞，比如，經(jīng)典抗原、獨立B細胞生發(fā)中心均是從低水平的體細胞高突變獲得[6]。

Seifert等[8]研究提出通過詳細的CLL轉(zhuǎn)錄分析和來自外周血及脾臟多樣化B細胞亞型確認uCLL和mCLL細胞起源。Seifert等[8]也檢測了CD5+前體生發(fā)中心成熟B細胞(CD5+和CD27+)作為uCLL起源，卻沒有意識到CD5+后原始中心B細胞亞型(CD5+和CD27+)極可能是mCLL的起源。另外，在uCLL和mCLL中，IgVH突變階段、基因重組、傳統(tǒng)模型和兩個正常CD5+B細胞亞群相似。

CLL最初獲得于造血干細胞階段。Kikushige等[9]觀察了異基因移植的CLL患者，CLL表型克隆起源缺少VDJ基因重排。這次發(fā)現(xiàn)表明造血干細胞移植的CLL患者攜帶早期的遺傳改變，接觸了抗原的造血干細胞進一步分化，帶來了CLL的發(fā)展過程。盡管這項發(fā)現(xiàn)和CLL的病因機制和治療前景相關，但有效性還需進一步研究。

2CLL白血病突變現(xiàn)象

2012年起，CLL的幾個全基因組序列和多于200個外顯子已經(jīng)貫穿了人們對疾病的理解[10]。這項研究揭示了標記分子的異質(zhì)性，在10%～15%病例中僅有2%～5%的基因突變。且大約1/3病例突變是不可逆的[11]。大部分突變基因聚集在少部分路徑中，解釋了uCLL和mCLL亞型的差異。NOTCH1信號通路(NOTCH1和FBXW7)，mRNA剪接，加工和運輸SF3B1,U2AF2,SFRS1,XPO1及 DDX3X。在uCLL中，DNA損害路徑(ATM,TP53和POT1)是普遍的。在mCLL中，先天性炎癥通路(MYD88,TLR2和MAPK1)占主要作用[10]。這種現(xiàn)象表明了兩種CLL亞型的不同臨床表現(xiàn)與各種下調(diào)分子機制有關。

CLL分子機制異質(zhì)性著重于兩大類外顯子不同的突變分布研究。在Quesada等[11]研究105例CLL患者，大部分共同的突變基因是NOTCH1(12%) 和 SF3B1(10%)，接下來是POT1(5%)，CHD2(5%)和LRP1B(5%)。Wang等[10]研究91例患者中，最多的突變基因是TP53(15%)，SF3B1(15%)，MYD88(10%)和ATM(9%)。在后期研究中，僅有4%病例存在NOTCH1突變，TTP53 和ATM 突變分別為1%和4%。在這兩項研究中，患者的臨床特征有明顯的差異。在Quesada研究集中在疾病早期階段，包括診斷的或尚未治療的，而Wang研究集中在相對年輕的患者(中位年齡54歲比62歲)，很高比例的患者有相反預后參數(shù)(兩者比例為 21% 比8%,不利的細胞突變?yōu)?3%比15%,高表達 ZAP70為46 %比29%)。這些發(fā)現(xiàn)表明了不同研究中突變基因的分布反映了CLL先天分子的異質(zhì)性和患者的臨床特征。但是，它不能被排除研究中部分差異是應用高通量測序?qū)е碌摹?/p>

尤其是來源于整個基因組的數(shù)據(jù)序列研究使人們看清腫瘤突變現(xiàn)象的機制。核苷酸不同的置換在不同的癌癥類型中是有區(qū)別的，也許反映了諸如暴露在射線，煙草致癌物環(huán)境下特殊的突變機制[12-14]。在發(fā)展過程中，CLL的這兩類分子亞型暴露在不同的免疫微環(huán)境中，也就是說，mCLL從IgHV基因獲得突變是在原始生發(fā)中心，而uCLL缺乏這些突變。在mCLL基因突變中，攜帶有胞苷脫氨酶誘導活化的體細胞高度突變產(chǎn)生的標記[15]。另外，Pente等[15]觀察了mCLL比未突變IgVH有顯著的高比例A>C/T>G突變。突變標記顯然是由DNA聚合酶導致的，當DNA修復后是可恢復的。DNA聚合酶高表達在濾泡生發(fā)中心細胞，易導致胞苷脫氨酶的錯誤行為，造成免疫球蛋白基因多樣性。DNA聚合酶無需轉(zhuǎn)錄但可以影響整個基因組。因此，在mCLL和uCLL中觀察到，生發(fā)中心免疫微環(huán)境可有A>C這樣的標記，反映了兩類CLL亞型不同的細胞起源是有差異的[15]。

3CLL的DNA甲基化

CLL基因組特征，尤其是DNA甲基化序列已經(jīng)得到研究，在少部分病例和正常B細胞亞型以及上百例高密度和以啟動子為基礎的基因芯片進行全基因組亞硫酸氫鹽測序技術和簡化的亞硫酸氫鹽測序[16]。這些報道已經(jīng)證實了在CLL及不同預后的CLL亞型中的個別基因，微小RNA，表觀修飾路徑的下調(diào)[17]。在uCLL和mCLL中，不同差異表達的基因，比如LPL、ZAP70、CRY1、SPG20、CLLU1或LAG1，在兩種亞型的疾病中顯示不同的甲基化模式，這顯然與假定的細胞起源有關[17]。

除了個別基因，研究已經(jīng)揭示大量CpG位點的表觀調(diào)控，大部分形式為低甲基化。尤其是全基因組亞硫酸氫鹽測序技術證實在uCLL和幼稚B細胞中，有3.79億CpG位點甲基化差異，在mCLL和記憶B細胞中，有1.84億CpG位點甲基化差異[18]。整體分析這些數(shù)據(jù)可揭示基因調(diào)控的機制。盡管報道CLL低甲基化經(jīng)常影響DNA復制[19]，但缺乏甲基化會伴隨增強子區(qū)的不均衡。DNA甲基化的全面分析和一系列CLL的基因表達檢測到了僅5%～10%的基因顯示有意義的關聯(lián)。觀察到基因體不同甲基化能雙向調(diào)整基因表達，進一步證實了啟動子區(qū)域基因表達水平和DNA甲基化的負相關[18]。另外，基因甲基化和不同啟動子應用相關連，比如RB1基因，CD45和BCL2L1基因亞基選擇性剪接[18]。

在原始B細胞和記憶B細胞可以獲得不同水平的表觀基因組重排而分別產(chǎn)生uCLL和mCLL。基因芯片分析顯示在各自的細胞起源上，uCLL有多于mCLL幾倍的甲基化改變。這些發(fā)現(xiàn)闡明了盡管起源于B細胞不同成熟階段，CLL的兩個亞型為什么會具有相似的基因表達和表型特征。尤其，原始B細胞轉(zhuǎn)換uCLL發(fā)生2/3DNA甲基化改變，可檢測到進入記憶B細胞生理區(qū)別。另外，CLL基因低甲基化和B細胞信號轉(zhuǎn)導路，T細胞共刺激，細胞因子相互作用相聯(lián)系，影響幼稚B細胞到uCLL的發(fā)展[18]。

總之，CLL的DNA甲基化較復雜，包括啟動子區(qū)改變、啟動子內(nèi)的改變、選擇性剪接、增強子DNA甲基化模式的高頻改變。在DNA甲基化和基因表達水平上僅有小部分基因顯示關聯(lián)。因此，這些發(fā)現(xiàn)明顯表明基因調(diào)控并不主要是DNA 甲基化。假如在CLL臨床檢測前的多階段發(fā)展致癌過程中，DNA 甲基化起作用，那么，DNA甲基化就可負責CLL的發(fā)展中基因表達的歷史改變。這包括細胞起源及所有活化階段表觀遺傳學最終使腫瘤克隆發(fā)展成為CLL。

4CLL表觀遺傳學的臨床影響

CLL最初的表觀遺傳學研究提供了可供臨床參考的資料。無IgVH突變的CLL細胞中，NOTCH1和SF3B1突變更普遍，在早期的臨床階段高表達ZAP70和CD38[15,20-22]。在11q缺失的CLL，SF3B1突變頻率更高[10]。NOTCH1突變與12號染色體三體相關[23]，這些基因的改變和臨床不良預后有關。攜有NOTCH1突變的CLL比有野生型NOTCH1表達的CLL更易進展為彌漫大B細胞淋巴瘤[15,20-22]。NOTCH1和SF3B1突變帶來了患者不良預后，但尚不明確它們是否獨立于IgVH的突變階段[20-22]。

近年的研究顯示，其他突變率低的基因關聯(lián)性。363例患者，3%出現(xiàn)MYD88突變，主要是年輕和有利生物學特征，比如低水平表達ZAP70和CD38及有IgVH 突變的患者[15]。在對化療耐受的CLL患者，更易出現(xiàn)BIRC3突變[24]。127例CLL患者，3.5%出現(xiàn)POT1突變，POT1突變增加了末端著絲粒的脆性和染色體的異常，未突變的IgHV和ZAP70高表達出現(xiàn)在重病期[25]。研究105例CLL患者，有4%產(chǎn)生蔗糖酶突變。這些突變的結(jié)果導致酶作用缺失，CLL轉(zhuǎn)錄組分析顯示了重要的新陳代謝路徑模式的變化[26]，符合CLL細胞其他新陳代謝變化的觀察結(jié)果[27]。相對CLL高頻低數(shù)量的基因突變，表觀遺傳學研究顯示與正常細胞相比，腫瘤細胞內(nèi)有數(shù)千基因的表觀遺傳學改變。單個基因，比如ZAP70[28-29]的預后影響已經(jīng)證實了表觀遺傳的復雜性和uCLL或mCLL相關。最近的研究描述了ZAP70基因整體甲基化水平中單個CpG島與CLL的臨床表現(xiàn)相關[28]。Kulis等[18]應用1649個CpGs甲基化位點與假定的正常細胞起源相關，證實了以下三型CLL：幼稚細胞型預后差，記憶細胞型預后相對好，中間型有中等程度預后。這一發(fā)現(xiàn)，如果驗證在獨立的體系中，也許可以作為新的策略分類CLL患者。

5結(jié)語

在最初的表觀遺傳學研究中突出了分子的復雜性和疾病的異質(zhì)性。高表達的基因和路徑的改變帶來了不同分組患者的生物學行為。不同突變的靶基因成為治療的目的基因。然而這些發(fā)現(xiàn)的臨床意義尚未完全理解。突變基因的低頻率水平增加了作用關聯(lián)的證據(jù)，在一批疾病分子異質(zhì)性患者中的驅(qū)動突變的事實尚未完全清楚[30]。這種復雜性使表觀遺傳信息轉(zhuǎn)變?yōu)榕R床疾病成為真正的挑戰(zhàn)。新的診斷方法需要完整的基因組和有臨床數(shù)據(jù)的表觀遺傳信息。這種觀點將允許有更多的個體化的分子診斷，根據(jù)疾病生物危險度分層患者，確定更有效的治療方案。

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Genetic and Epigenetic Basis of Chronic Lymphocytic LeukemiaLIUYu-hong1a，LiXiao-yong1b,ZHANGWang-gang2.(1a.DepartmentofHematology,1b.DepartmentofSurgery,theAffiliatedHospitalofYan′anUniversity,Yan′an716000,China; 2.DepartmentofHematology,theSecondAffiliatedHospital,MedicineSchoolofXi′anJiaotongUniversity,Xi′an710004,China)

Abstract：Chronic lymphocytic leukemia(CLL) has provided the first comprehensive view of somatic mutations and methylation changes in this disease,which summarizes the recent findings in this field and the impact on neoplasm.Genomic studies have revealed a remarkable molecular heterogeneity of the disease,with only few genes mutated in up to 10%-15% of the patients and a relatively large number of genes recurrently mutated at low frequency.NOTCH1 and SF3B1 mutations are emerging as new drivers of aggressive forms of the disease.Genome-wide methylation studies have shown that CLL transformation is associated with a massive hypomethylation phenomenon frequently affecting the enhancer regions.This epigenetic reprogramming maintains an imprint of the putative cell of origin from naive and memory B-cells.Genomic and epigenomic studies of CLL are reshaping our understanding of the disease and provide new perspective for a more individualized diagnosis and new potential therapeutic targets.

Key words：Chronic lymphocytic leukemia; DNA methylation; Gene mutation

收稿日期：2014-08-11修回日期：2015-01-12編輯：相丹峰

基金項目：陜西省教育廳科研項目(14JK1823)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.13.010

中圖分類號：R733.72

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)13-2329-04