新型缺氧保護因子胞紅蛋白的研究進展

李 維，范文靜綜述，屈順林審校

0 引 言

珠蛋白家族是一類有著相似一級結構和三級結構的蛋白質，均含有血紅素輔基。作為呼吸鏈蛋白之一，珠蛋白可通過鐵卟啉環(huán)和組氨酸多肽鏈來與氧分子結合［1］。研究表明，脊椎動物中有多種結構、功能和組織分布不同的珠蛋白。目前，在脊椎動物中，已知的且被正式命名的珠蛋白類型有4 種:血紅蛋白、肌紅蛋白、腦紅蛋白和胞紅蛋白。其中，胞紅蛋白是由Kawada 等［2］于2001 年運動蛋白質組學方法研究大鼠肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSCs)激活的分子機制時發(fā)現(xiàn)的一種肝星狀細胞激活相關蛋白。文中主要就珠蛋白家族中的胞紅蛋白的生理特征及功能作一綜述。

1 珠蛋白家族簡介

珠蛋白是一類小分子金屬類蛋白質，通常由150個氨基酸組成［3］，有8 個α-螺旋(命名為A-H)呈現(xiàn)出典型的三明治夾心α-螺旋折疊結構［1］。這種保守的“珠蛋白折疊”結構是珠蛋白超家族所特有的。珠蛋白均含有血紅素輔基(鐵卟啉環(huán))，能夠可逆的與氧氣、一氧化碳和一氧化氮結合［4］。在動植物演化進程中，珠蛋白很早就出現(xiàn)了，并且普遍存在于細菌、真菌、植物、無脊椎動物和脊椎動物中。起初，認為血紅蛋白和肌紅蛋白是脊椎動物中僅有的兩種珠蛋白。然而，隨后的相關研究和報道推翻了這一說法，隨著腦紅蛋白和胞紅蛋白的相繼發(fā)現(xiàn)，研究人員又于2005年在低等脊椎動物中發(fā)現(xiàn)了珠蛋白家族中的第五位成員，但因其功能不明，暫且稱其為X 珠蛋白［5］。根據脊椎動物珠蛋白序列特征分析發(fā)現(xiàn)，胞紅蛋白和肌紅蛋白有30%同源性，起源于同一進化分支，“祖先蛋白”分化為兩支，一支特異性的分布于神經系統(tǒng)而進化成腦紅蛋白，另一支則分布于全身而進化成為了血紅蛋白、胞紅蛋白和肌紅蛋白［1］。在人類和脊椎動物中，血紅蛋白主要位于紅細胞中，然后通過呼吸系統(tǒng)將呼吸器官中的氧氣運送到組織中，將組織中的二氧化碳運送到呼吸器官從而排出體外［6］。脊椎動物中，單體結構的肌紅蛋白主要作用是存儲氧氣以及促進細胞內的氧氣擴散至線粒體。

2 胞紅蛋白的結構和分布

胞紅蛋白是一類小的呼吸蛋白，廣泛表達于生物體中。人的胞紅蛋白定位于17q25.3 染色體片段上，含有3 個內含子和4 個外顯子［7］。根據已發(fā)現(xiàn)的肌紅蛋白的生理功能，可推斷出胞紅蛋白的某些生理功能。與其他珠蛋白相比，哺乳動物胞紅蛋白通常較長，約有190 個氨基酸，其三級結構表現(xiàn)出典型的三明治夾心α-螺旋折疊結構，相對分子質量為21 000［2］;中間為蛋白核心區(qū)域，具有攜氧珠蛋白結構和功能意義的關鍵性殘基如PheCD1、HisE7、HisE8 等［8］;在其N-末端和C-末端約有20 個氨基酸的延伸。胞紅蛋白中包含2 個半胱氨酸，分子內存在二硫鍵［9］。二硫鍵的斷裂可能會降低胞紅蛋白的氧親和力。

多項研究表明哺乳動物的胞紅蛋白在各組織及各發(fā)育階段均有表達，如大腦、心臟、肝、肺等。不同組織中的胞紅蛋白水平不同，且濃度均相對較低。最近的一些研究利用免疫組織化學、Western Blot 等方法檢測各種器官中胞紅蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)胞紅蛋白更多的表達于結締組織的成纖維細胞以及和成纖維細胞相關的細胞系中，如軟骨細胞、成骨細胞、HSCs 和肌成纖維細胞［10］。然而，一些研究表明在神經元細胞、肌細胞、肝實質細胞和上皮細胞中也有胞紅蛋白的表達［11］。這些均說明了胞紅蛋白廣泛表達于各個器官中。成纖維細胞中的胞紅蛋白主要分布在細胞質中，而神經元細胞中的胞紅蛋白既表達于細胞核中，又表達于細胞質中［12］。胞紅蛋白在中樞神經系統(tǒng)內分布廣泛，其中在海馬、丘腦和下丘腦中表達顯著，而這三個區(qū)域能夠感應缺氧應激，表明胞紅蛋白可能在缺氧損傷中起到重要作用［13］。最近，有研究發(fā)現(xiàn)人骨髓組織和孤束核(nucleus of the solitary tract，NTS)中也有胞紅蛋白的表達。胞紅蛋白在NTS 中作為一種“神經珠蛋白”發(fā)揮作用，為呼吸系統(tǒng)提供氧氣的改變情況［14］。

3 胞紅蛋白的生理功能

3.1 氧氣的儲存和運輸以及氧傳感器 胞紅蛋白具有氧結合能力。因為與肌紅蛋白的同源性，提出了胞紅蛋白參與氧氣的運輸以及促進細胞內氧氣的擴散。也有研究者認為胞紅蛋白可以貯存氧氣，微小的需氧環(huán)境能夠促進還原劑(H+、NADH)的積累［15］，從而改變細胞的氧化還原狀態(tài)，破壞胞紅蛋白的二硫鍵結構，進而改變胞紅蛋白的結構并釋放氧氣。胞紅蛋白與氧氣結合之后，其構象發(fā)生改變，進而關聯(lián)信號傳感器與氧感受器。如在細胞核中，胞紅蛋白可能將信號傳送到轉錄機制中，從而影響基因的表達。但是到目前為止，還未有證據表明胞紅蛋白能夠直接傳遞信號。

3.2 胞紅蛋白與纖維化 器官纖維化是一種慢性病變過程，其顯著特征之一就是膠原沉積［16］。在越來越嚴重的肝纖維化過程中，胞紅蛋白的蛋白和mRNA 的表達量是逐漸增強的，說明胞紅蛋白與肝纖維化之間可能存在一定的作用。正常生理情況下，HSCs 負責血流的控制以及維生素A 的儲存。慢性肝損傷的情況下，被激活的HSCs 能夠轉化成肝成纖維細胞并促進細胞外基質沉積導致器官纖維化［17］。在纖維化的刺激下，胰腺星狀細胞和腎間質細胞中的胞紅蛋白表達增加，同時發(fā)現(xiàn)合成的膠原蛋白也增加。將胞紅蛋白轉染進NIH 3T3 細胞中發(fā)現(xiàn)與對照組相比細胞中膠原蛋白的生成量增加［18］。此外，缺氧能夠上調胞紅蛋白的表達，同時也能引起器官的纖維化，傷口愈合，骨生成和軟骨形成，而這些過程均需要氧依賴性膠原蛋白的產生。然而在纖維化中，胞紅蛋白還起到了一種保護作用。眾所周知，胞紅蛋白具有抗氧化應激的作用，同時在纖維化模型中胞紅蛋白的過表達也被證明可抗氧化應激。胞紅蛋白可清除組織損傷時產生的活性氧類(reactive oxygen species，ROS)，從而起到一定的保護作用［19］。近來有研究發(fā)現(xiàn)，在纖維化的患者肝中，胞紅蛋白表達于HSCs 中，而在肌成纖維細胞中卻無胞紅蛋白的表達。由此可見，胞紅蛋白可作為一種有效的標記物來區(qū)分損傷肝中的HSCs 和肌成纖維細胞［20］。

3.3 神經保護作用 在神經病變性過程中，胞紅蛋白的上調可能與應激有關。視網膜內血流的不穩(wěn)定會造成局部缺血，從而導致神經損傷和青光眼的發(fā)生發(fā)展［21］。有學者利用免疫組化檢測5 例癲癇和/或精神性運動發(fā)育遲緩患者的大腦樣本，發(fā)現(xiàn)2 例患者中就有1 例星狀細胞內含物中的胞紅蛋白呈陽性染色。神經元活動過度會引起能量、氧氣以及血糖水平的降低，同時還會增加乳酸以及谷氨酸的濃度。神經元活動過度還會導致核轉錄因子κB(nuclear transcription factor，NF-κB)誘導的神經型一氧化氮合酶的上調以及一氧化氮的產生［22］，且可與過氧化物一起導致神經損傷［23］。因此推測，胞紅蛋白的過表達可能是由氧化還原/氧氣失衡誘導的，且極有可能是通過NF-κB 途徑。綜上所述，可認為胞紅蛋白的神經保護作用主要是通過抗氧化應激作用來實現(xiàn)的。

3.4 胞紅蛋白與癌癥 人的17q 染色體上富含抑癌基因，基因敲除、基因過表達及胞紅蛋白基因上、下游區(qū)域的分析表明位于此處的胞紅蛋白基因具有抑癌活性［7］。對多種惡性腫瘤的研究已經證實胞紅蛋白常發(fā)生基因失衡或基因沉默現(xiàn)象。首次證明胞紅蛋白和癌癥之間有遺傳關聯(lián)的是在胼胝癥食管癌綜合征中［24］。卵巢癌中，胞紅蛋白的表達下調了，且有證據顯示胞紅蛋白可調節(jié)卵巢癌細胞的增殖和入侵能力［25］。最近有研究為肺癌中胞紅蛋白基因甲基化顯著增強提供了初步證據。通過對肺癌和乳腺癌細胞系以及支氣管和乳腺上皮細胞系的特異性DNA 序列甲基化分析，證明了胞紅蛋白的表達和啟動子110 bp 區(qū)域富含CpG 島的甲基化呈顯著負相關［23］。研究發(fā)現(xiàn)，可利用活體組織和痰液樣本進行胞紅蛋白基因的甲基化分析，從而對肺癌患者進行診斷［26］。對于多種上皮細胞和血液細胞腫瘤的分析也證實了胞紅蛋白基因甲基化分析的特異性作用。

3.5 胞紅蛋白與肌肉再生 哺乳動物的骨骼肌能夠改變、修復以及利用自身的衛(wèi)星細胞達到再生。但成人骨骼肌的再生并不是不受限制的。肌祖細胞的減少通常被認為是進行性肌無力、伴有各種骨骼肌疾病的外圍骨骼肌萎縮以及正常老化過程中的一個重要的促進因素［27］。在整個哺乳動物的生命周期中，骨骼肌的維持、適應以及修復均是依賴于肌細胞持續(xù)不斷生成的能力。當肌肉出現(xiàn)損傷時，位于肌膜之間的肌祖細胞被激活并開始增殖。有研究證明缺氧能夠誘導C2C12 成肌細胞(由肌祖細胞衍生而來的)中的胞紅蛋白的表達［28］。有證據表明，胞紅蛋白定位于肌祖細胞的細胞核中，并且在肌肉再生過程中有短暫的誘導表達。同時，胞紅蛋白能夠減輕由ROS 刺激的細胞凋亡。當肌祖細胞缺乏胞紅蛋白的時候，該細胞的增殖和分化的能力就會受到影響，從而不能形成成熟的肌小管。當小鼠體內的胞紅蛋白特異性缺失時，小鼠肌肉的修復和再生會受到嚴重損傷［29］。許多研究均表明，肌祖細胞的氧化還原狀態(tài)是骨骼肌再生能力的主要決定因素，氧化狀態(tài)下的肌祖細胞更易分化和出現(xiàn)細胞死亡，而還原狀態(tài)下的肌祖細胞更易增殖并存活［30］。值得注意的是，研究人員發(fā)現(xiàn)在激活的肌祖細胞細胞核中出現(xiàn)了胞紅蛋白和成肌分化抗原(myogenic differentiation antigen，MyoD)的共同活化［31］。在敲除胞紅蛋白的小鼠中，用環(huán)磷酰胺誘導其產生骨骼肌損傷之后發(fā)現(xiàn)，雖然骨骼肌再生期間有MyoD 表達，但這一過程中卻無肌細胞生成素的表達?？傊t蛋白能夠促進肌祖細胞的存活，從而為肌肉的產生和骨骼肌的再生起關鍵作用。

4 胞紅蛋白與缺氧

4.1 缺氧對胞紅蛋白表達的影響 暴露于氧化劑下發(fā)現(xiàn)內源性的胞紅蛋白表達顯著提高。研究顯示，用各種應激因素如過氧化氫、紅藻氨酸、熱休克和高滲透壓處理可誘導神經母細胞瘤細胞N2a 胞紅蛋白表達。過氧化氫處理也可上調MCF7 乳腺癌細胞株中胞紅蛋白表達。在圍產期缺氧缺血引起的腦損傷的情況下，發(fā)育的大腦中內源性胞紅蛋白的mRNA 和蛋白表達量均上調［32］。

心臟疾病、癌癥、腦血管疾病等是引起死亡的最常見的原因。在這些病癥中，氧平衡的破壞是一個重要方面。即使是短暫的局部缺氧，也會產生不可逆的細胞損傷，尤其是那些有著較高代謝活動的組織。目前，越來越多的研究表明胞紅蛋白與缺氧相關途徑有關聯(lián)。缺氧能夠引起大多數(shù)動物以及組織中的胞紅蛋白表達增加，實驗已證明，缺氧能引起神經元HN33 細胞、轉化的支氣管上皮細胞BEAS-2b、子宮癌HeLa 細胞和多形性成膠質細胞瘤細胞株中胞紅蛋白的表達上調［33］。在成神經細胞瘤缺血模型中顯示，缺血能夠誘導胞紅蛋白的表達下調，而缺氧卻能誘導胞紅蛋白的表達上調［34］。缺氧能夠促進頭部、頸部、肝以及腎癌細胞株中胞紅蛋白的表達上調。有研究表明，胞紅蛋白的mRNA 水平升高是腫瘤組織缺氧的一個顯著特征。而對于暴露在缺氧或缺血的細胞中，胞紅蛋白表現(xiàn)出一種細胞保護作用［35］。將小鼠暴露在缺氧環(huán)境中發(fā)現(xiàn)在小鼠的心臟和肝中胞紅蛋白上調了2 ～3 倍，這與胞紅蛋白基因上保守的缺氧反應序列有關［36］。

4.2 缺氧影響胞紅蛋白表達的機制 對胞紅蛋白的基因結構進行研究之后發(fā)現(xiàn)，胞紅蛋白啟動子5'非編碼區(qū)域內含有與調節(jié)氧平衡相關的重要轉錄因子——缺氧誘導因子［37］，5'和3'端非編碼區(qū)域分別含有2 個保守的缺氧反應元件(hypoxic response elements，HRE)及2 個候補的HRE，3'端非編碼區(qū)域另包含2 個缺氧誘導蛋白結合位點［38］，這個結合位點的模序被證實能夠穩(wěn)定各種缺氧應答基因的mRNA。許多涉及氧穩(wěn)態(tài)的過程均由HIF 來調控，而HIF 又可轉錄介導數(shù)十種靶基因的表達。在不同的靶基因中已經證實，HRE 包含了HIF-1 發(fā)揮其功能必備的HIF-1 結合位點以及一段共有序列5'-RCGTG-3'［37］。胞紅蛋白的啟動子區(qū)域含有多種保守的HREs，說明在缺氧情況下胞紅蛋白的表達上調。但是，胞紅蛋白在缺氧下表達的具體機制，仍然有待進一步證明。

心室肥厚是心臟應對外界各種應激時所做的適應性應答。這種肥大可進一步增強心輸出量以及心室壁的壓力，進而導致適應性變差，最終導致心臟代償失調和心臟衰竭［28］。在心室肥大中存在氧化還原狀態(tài)、各種信號轉導通路和應激反應性蛋白的改變。胞紅蛋白是一種應激反應性血紅素蛋白，體外實驗證明胞紅蛋白可結合氧氣、一氧化氮以及自由基［39］，且胞紅蛋白清除氧自由基的作用較其調節(jié)氧代謝的作用更加重要。但是目前，胞紅蛋白的基因調控區(qū)還未得到充分的研究。然而，研究人員卻發(fā)現(xiàn)其家族的另一位成員肌紅蛋白的轉錄受到鈣依賴性轉錄因子:活化T 細胞核因子(nuclear factor of activated T cells，NFAT)和激活蛋白AP-1(activator protein-1)的調控，由于胞紅蛋白與肌紅蛋白高度同源，因此就推測胞紅蛋白可能和肌紅蛋白相同，轉錄也受到鈣依賴性轉錄因子NFAT 和AP-1 的調控。

體外和體內實驗均已經證明，缺氧狀態(tài)下，胞紅蛋白的mRNA 和蛋白水平均得到上調。胞紅蛋白基因的5'端上游有一個關鍵區(qū)域能夠調節(jié)缺氧下胞紅蛋白的轉錄。有發(fā)現(xiàn)缺氧下胞紅蛋白轉錄的激活是由鈣調磷酸酶介導的。鈣調磷酸酶是一種重要的鈣-鈣調蛋白激活的磷酸酶，并且可通過參與各種心臟基因調節(jié)涉及的信號轉導途徑來調節(jié)心臟的生長/重構、肥大、細胞凋亡以及新陳代謝。當環(huán)境中存在應激反應時(如缺氧、局部缺血等)，鈣-鈣調蛋白激活鈣調磷酸酶，使得肌細胞通過細胞中鈣調磷酸酶改變各種轉錄因子(如AP-1、NFAT 等)以及基因表達的能力來應對外界的應激［28］。根據體外轉錄分析胞紅蛋白啟動子區(qū)域所得數(shù)據發(fā)現(xiàn)，在轉基因小鼠模型中有不同程度的鈣調磷酸酶的激活，在涉及抑制內源性鈣調磷酸酶活性的實驗中也清楚的證明了鈣調磷酸酶能夠調節(jié)肌細胞中胞紅蛋白的轉錄激活。這些體外和體內實驗均已證明，胞紅蛋白的轉錄是受到鈣調磷酸酶活性的影響的。盡管鈣調磷酸酶能夠通過改變各種轉錄因子來調節(jié)基因的轉錄，但其中鈣調磷酸酶/NFAT 途徑最為顯著，尤其是在心臟重構以及心室肥大中。在調節(jié)胞紅蛋白轉錄過程中可能存在NFAT 和AP-1 之間的相互作用。因為刪除了保守的NRE 結合位點和抑制NFAT的活性的實驗均證明NFAT 不是單獨調節(jié)胞紅蛋白的轉錄，可能是與AP-1 相互作用調節(jié)。首先，NFAT和AP-1 能直接結合到胞紅蛋白的啟動子區(qū)域，然后發(fā)揮協(xié)同作用一起調節(jié)胞紅蛋白的轉錄。第二，NFAT 也有可能不是直接結合到胞紅蛋白的啟動子區(qū)域，而是先和AP-1 形成復合物，然后再結合到啟動子區(qū)域并發(fā)揮調節(jié)轉錄的作用［28］。

5 展 望

綜上所述，胞紅蛋白結構特殊，廣泛分布且具有多樣的生理功能。隨著時間的推移，科學的進步和發(fā)展，對于對胞紅蛋白的研究也正日益深入。尤其是胞紅蛋白的抗氧化應激作用，以及在缺氧條件下的保護作用，更是備受重視。鑒于氧氣對生命的重要性，氧代謝一直是備受關注的研究領域。胞紅蛋白的發(fā)現(xiàn)和深入研究無疑為臨床代謝相關疾病的治療及相關應用均提供了新的觀點和思路。同時，胞紅蛋白的其它生理功能的發(fā)現(xiàn)，無疑也是為許多疾病帶來了新的希望。但是珠蛋白家族的研究還未結束，尤其是對胞紅蛋白的研究還未結束，相信經過廣大科研工作人員的不懈努力，在不久的將來，會有更多、更深入的功能研究應用于生活中，從而造福人類。

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