樹鼩動物模型研究進(jìn)展

郭爾楚，郭茜茜，鐘振國

(廣西中醫(yī)藥大學(xué) 新藥研究開發(fā)中心，廣西 南寧 530001)

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樹鼩動物模型研究進(jìn)展

郭爾楚，郭茜茜，鐘振國

(廣西中醫(yī)藥大學(xué) 新藥研究開發(fā)中心，廣西 南寧 530001)

樹鼩屬于低等靈長類動物，其形態(tài)、生理機(jī)能和生化代謝等與人類相似，實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果容易推廣到人，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究。研究人員利用樹鼩已經(jīng)建立許多模擬人類疾病的樹鼩動物模型，如肝炎病毒性疾病、糖尿病、腫瘤和老年癡呆模型等。對樹鼩在動物模型中的應(yīng)用研究進(jìn)行概述。

樹鼩；動物模型；綜述

樹鼩學(xué)名：Tupaia belangeri，tree shrew，樹鼩科，分布在東南亞各國。我國主要分布在云南、廣西等地，主要生活在熱帶、亞熱帶森林、灌叢、村落附近。樹鼩是一種新型實(shí)驗(yàn)動物，由于其解剖特征近似于人類，已成功建立了多種人類疾病的動物模型，并在病毒學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、生殖生物學(xué)和社會心理學(xué)等方面有相當(dāng)廣泛的應(yīng)用和研究[1,2]。樹鼩作為代替人類一些重大疾病的動物模型具有舉足輕重的作用，越來越多的國家已經(jīng)開展樹鼩動物模型的研究，并且得到了可喜的成果。本文就國內(nèi)外對樹鼩動物模型的研究進(jìn)展進(jìn)行概述。

1 肝炎病毒模型

1.1 甲型肝炎(Hepatitis A virus，HAV)

詹美云等[3]用試驗(yàn)組9只樹鼩，每只口服5%甲肝病毒陽性病人新鮮大便懸液0.5mL(相當(dāng)于0.025g大便)，3～13天后在動物糞便中可檢出甲肝抗原。其中在感染2～16周的樹鼩血清中可檢測出甲肝病毒抗體，抗體轉(zhuǎn)陽率為78%。同時，感染樹鼩的肝臟出現(xiàn)充血、水腫、顆粒和脂肪性病變，枯否氏細(xì)胞增生。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可初步說明甲肝病毒在樹鼩體內(nèi)復(fù)制，使樹鼩有可能成為人類甲肝病毒的敏感動物模型。

1.2 乙肝病毒模型(Hepatitis B virus，HBV)

乙型肝炎病毒簡稱乙肝病毒。是一種DNA病毒，屬于嗜肝DNA病毒科(hepadnavividae)。根據(jù)已有文獻(xiàn)記載，HBV只對人和猩猩有易感性，引發(fā)乙型病毒性肝炎疾病。目前已有系列研究表明體外培養(yǎng)的樹鼩原代肝細(xì)胞或uPA免疫小鼠體內(nèi)移植的樹鼩肝細(xì)胞可以成功感染人HBV[4-6]。龐其方等[7]用HBV陽性人血清感染40只樹鼩，分析結(jié)果表現(xiàn)類似其他病毒感染的規(guī)律，即早期出現(xiàn)抗原，后期出現(xiàn)抗體。結(jié)果還提示了樹鼩可能是繼黑猩猩和長臂猿之后對HBV敏感的動物。嚴(yán)瑞琪等[8]從人HBV供血者中篩選出有感染性的HBV血清，通過股靜脈注射接種HBV血清到樹鼩體內(nèi)，三天再經(jīng)腹腔注射接種血清一次。利用被動凝血法(pHA)測定血清HBsAg 和抗HBs的滴度，兩者均為陽性，其中陽性持續(xù)至14周樹鼩，用免疫過氧化物酶技術(shù)活檢肝組織，全部檢出HBsAg或HBcAg ，證明HBV已在樹融肝細(xì)胞中立足并復(fù)制了特異性的病毒抗原，為樹鼩能感染HBV提供了證據(jù)。王琦等[9]通過新生期樹鼩經(jīng)皮下接種，以已感染樹鼩的血清或單份乙肝患者血清作感染源、以FQ-PCR 檢測肝組織 HBV DNA 和 ELISA/TRFIA 檢測血清 HBsAg，顯示肝組織 HBV DNA和血清HBsAg均為陽性，且多將發(fā)展為持續(xù)感染者，說明樹鼩能夠感染 HBV并成為HBV長期攜帶者。王樹聲等[10]用含HBV的人血清分6批接種給233只樹鼩后，90%呈急性感染，56%為可持續(xù)1年以上的慢性感染，33%持續(xù)2年2個月，肝細(xì)胞內(nèi)HBAsg陽性率達(dá)80%，說明樹鼩對HVB感染有較高的敏感性，有望成為HBV的動物模型。劉華芳[11]也報道了樹鼩人工感染人HBV后,血清HBsAg陽性率最高時可達(dá)70.6%，肝細(xì)胞中也可檢出HBsAg，同時用環(huán)磷酰胺抑制樹鼩的免疫功能，但環(huán)磷酰胺并不能提高樹鼩對人HBV的易感性。李軍等[12]分別經(jīng)皮下注射和腹腔注射給成年雄性樹鼩接種含有101GE、102GE、104GE 和108HBV人類血清，通過采集樹鼩血清以及活體取肝采集樹鼩肝組織標(biāo)本，結(jié)果顯示，均能在樹鼩血清中檢測到 HBsAg、HBeAg和HBV DNA，并檢測到ALT 水平升高，肝組織免疫組化染色能檢測到 HBsAg 和HBcAg 陽性肝細(xì)胞的存在，并有 HBV cccDNA 的形成，肝組織 HE 染色顯示存在肝細(xì)胞變性壞死和炎性細(xì)胞浸潤等病理改變。充分證實(shí)了樹鼩體內(nèi) HBV 感染的成功建立，也表明 HBV 感染樹鼩能造成與人類乙型肝炎相似的病理變化。黃定瑞等[13]用人乙型肝炎病毒(HHBV)感染樹鼩后,取其HBsAg(或)HBeAg陽性的樹鼩血清傳代感染另一批樹鼩，并分四批感染至第四代，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)樹鼩中血清或肝細(xì)胞中HBV標(biāo)志物呈陽性率達(dá)94.4%，此結(jié)果表明HBV能夠在樹鼩間連續(xù)傳代感染。

以上研究表明，樹鼩感染乙肝病毒的動物模型具有可行性與穩(wěn)定性，不但可能代替黑猩猩進(jìn)行乙肝疫苗安全性和免疫保護(hù)效果的篩選，還可以為開發(fā)治療乙型肝炎的藥物奠定理論基礎(chǔ)。

1.3 丙型肝炎(Hepatitis C virus,HCV)

從 HCV被發(fā)現(xiàn)之初, 缺乏有效的HCV體外培養(yǎng)體系和合適的動物模型,一直阻礙著對 HCV研究的深入。近些年來，很多國內(nèi)外學(xué)者對樹鼩是否能感染HCV并成為HCV的新型動物模型作出了一系列有意義的探索[14-18]。閔峰等[19]采用體外兩步灌流法分離肝細(xì)胞,然后用丙型肝炎病毒(HCV)RNA陽性血清直接感染原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞。用RT-PCR法對感染樹鼩肝細(xì)胞及培養(yǎng)上清進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)在感染后3～5天,細(xì)胞內(nèi)可檢出HCV正負(fù)鏈RNA, 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,細(xì)胞內(nèi)有HCV NS3、NS5特異性抗原表達(dá),原位雜交結(jié)果顯示感染細(xì)胞內(nèi)藍(lán)紫色雜交信號,提示感染細(xì)胞內(nèi)存在HCV負(fù)鏈RNA，證實(shí)了HCV在體外確實(shí)能感染原代培養(yǎng)的樹鼩肝細(xì)胞,并在其細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制?？锏滦萚20]用腹部橫切手術(shù)及肝門靜脈注射法將丙型肝炎病毒迅速足量注射接種到樹鼩體內(nèi)肝臟，手術(shù)后1周進(jìn)行采血、ALT 檢測、HCV病毒載量檢測、肝臟病理檢測及 HCV-RNA抗原檢測，有 60%的樹鼩出現(xiàn)一過性的病毒血癥或間歇性病毒血癥，感染樹鼩的病毒載量最高可達(dá)到1×10拷貝/mL，肝功能中 ALT指標(biāo)最高可達(dá)到 192U/L，肝臟活體組織病理檢查發(fā)現(xiàn)不同程度的肝炎癥狀，肝組織能檢測到HCV-RNA抗原。該法為HCV樹鼩模型提高了感染率，并為進(jìn)一步深入研究HCV感染樹鼩奠定基礎(chǔ)。付喜花[21]通過Yanagi 于1997年構(gòu)建的全長HCV克隆[22]，通過體外轉(zhuǎn)錄合成全長HCV RNA經(jīng)股靜脈注射到樹鼩體內(nèi)，并同時分別接種HCV RNA陽性人血清進(jìn)行比較研究，兩組實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi)均檢測到顯著升高的 ALT水平和間歇性的病毒血癥，在樹鼩體內(nèi)初步建立 HCV感染，為HCV感染樹鼩模型的建立提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。謝春志[23]、馮悅[24]通過含HCV人血清感染樹鼩，均發(fā)現(xiàn)樹鼩可感染人HCV。Barth等[25]研究發(fā)現(xiàn)樹鼩肝細(xì)胞上I型清道夫受體，CD81分子在HCV包膜粘合到樹鼩肝細(xì)胞中起了重要作用。隨后，嚴(yán)石、華顯等[26,27]分別報道了樹鼩CD81分子可介導(dǎo)HCV感染、樹鼩Claudin-1分子可介導(dǎo)假HCV顆粒的感染。綜上所述，樹鼩可感染HCV，亦可原代肝細(xì)胞分離培養(yǎng)后可感染HCV。隨著研究的深入發(fā)展，樹鼩可能成為理想的HCV感染動物模型。

1.4 丁型肝炎(Hepatitis D virus，HDV)

HDV為一種有缺陷的單股負(fù)鏈RNA病毒，肝臟經(jīng)過HDV與HBV重疊感染后，可促使肝損害加重，并易發(fā)展為慢性活動性肝炎、肝硬化和重型肝炎。丁明權(quán)[28]將HDV/HBV陽性人血清經(jīng)同時和重疊感染方式接種于成年樹鼩，檢測血清中HBsAg、HDAg、抗-HD、HBV DNA及HDV RNA可知HBsAg陽性率為75%，感染樹鼩血清中可出現(xiàn)HDAg及抗-HD,經(jīng)分子雜交證實(shí)其血清及肝內(nèi)均有HDV RNA和HBV DNA存在,且可導(dǎo)致明顯的肝細(xì)胞損傷，表明成年樹鼩既可感染人HBV也可感染HDV,可作為研究HDV人工感染的實(shí)驗(yàn)動物。蔣業(yè)貴等[29]采用HDV/HBV同時感染和重疊感染8只樹鼩，用免疫組織化學(xué)技術(shù)對HDV/HBV感染樹鼩肝組織中HDAg、Fas和CIE的表達(dá)進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示Fas和ICE在肝細(xì)胞質(zhì)和(或)膜上表達(dá),以肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)為主。HDAg表達(dá)與Fas和CIE表達(dá)之間有顯著相關(guān)性(χ2值為29.2和36.2,P<0.01),HDAg表達(dá)越強(qiáng),Fas和CIE表達(dá)也越強(qiáng)。以上實(shí)驗(yàn)表明，樹鼩可作為感染HDV的實(shí)驗(yàn)動物模型。

2 疾病模型

2.1 肝癌模型

肝癌是全球常見的癌癥，近些年來，對于樹鼩能否作為肝癌動物模型方面，國內(nèi)外的研究工作者進(jìn)行了十分有益的嘗試，且取得了一定的成果。據(jù)文獻(xiàn)報導(dǎo),黃曲霉毒素Bl(AFB1)的攝入和乙型肝炎病毒(HBV)感染不僅能誘發(fā)樹鼩肝癌,并且AFBI和HBV在誘發(fā)樹鼩肝癌形成中還具有協(xié)同作用[30,31]。陳曉燕等[32]利用黃曲霉毒素B1(AFB1)與乙肝病毒(HBV)協(xié)同誘發(fā)樹鼩肝細(xì)胞癌并比較生長不同階段蛋白質(zhì)表達(dá)譜的改變，用雙向凝膠電泳(2-DE)及基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜法(MALD-TOF-MS/MS)對同一動物自身的癌發(fā)生前的肝組織(C45w)、癌發(fā)生后的肝癌組織(CCa)及未經(jīng)AFB1處理的對照組動物肝組織(E45w、E105w)進(jìn)行了相互比較，研究結(jié)果對找出肝癌關(guān)鍵蛋白、闡釋肝癌發(fā)生機(jī)制有較大幫助。Li 等[33]采用RT-PCR和Western blot 技術(shù)，對過氧化物酶PrxII 在樹鼩肝癌組織中過表達(dá)進(jìn)行更深入的研究，發(fā)現(xiàn)過氧化物酶 PrxII在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。蘇建家等[34]用生物素標(biāo)記的HBV DNA探針對經(jīng)83～158周實(shí)驗(yàn)的55只樹鼩肝組織進(jìn)行原位雜交研究，結(jié)果有41只攝入了AFB1,其中肝HBV DNA陽性的A組22只，有10只發(fā)生PLC；19只HBV DNA陰性的B組，只發(fā)現(xiàn)2例PLC，兩組差別顯著(P<0.05)。結(jié)果表明了HHBV和AFB1在PLC發(fā)生中起協(xié)同作用，為建立樹鼩肝癌動物模型提供了依據(jù)。

2.2 糖尿病模型

糖尿病是繼心血管疾病和腫瘤之后另一種嚴(yán)重危害人類健康的重要慢性疾病，在已有的報道中，樹鼩糖尿病動物模型的糖尿病病程、病癥與人類的糖尿病最為相似。吳曉云等[35]通過多次對樹鼩小劑量注射鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)，隨后樹鼩出現(xiàn)明顯的多飲、多食和多尿癥狀，平均體重未減輕，高血糖癥狀持續(xù)8～16周，尿糖顯著陽性，腎功能及糖耐受明顯受損，糖脂代謝紊亂，但未出現(xiàn)糖尿病乳酸中毒和高血糖高滲等并發(fā)癥。結(jié)果表明多次小劑量STZ注射可誘導(dǎo)樹鼩出現(xiàn)類似2型糖尿病癥狀和糖尿病腎臟損傷，且兩次注射80mg/kg 劑量的STZ較適合用于創(chuàng)建樹鼩2型糖尿病模型。章玲等[36]分兩組樹鼩同步注射鏈脲佐菌素(STZ)或生理鹽水后8周時進(jìn)行肝組織活檢，在光鏡下觀察分析血小板衍生生長因子(PDGF-BB)及血小板衍生生長因子受體(PDGFR-β)在兩組動物肝組織中的表達(dá)，數(shù)據(jù)表明糖尿病組PDGF-BB/PDGFR-β的表達(dá)與膠原纖維的表達(dá)的面積密度呈顯著正相關(guān)(γ=0.879,0.850，均P<0.01)，由此可知，PDGF-BB及PDGFR-β可能參與糖尿病早期肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展。李海燕等[37]用高糖高脂飼料聯(lián)合地塞米松(dexamehtasnoe,DEx)誘導(dǎo)樹勃糖代謝和脂代謝紊亂，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高糖高脂飲食聯(lián)合地塞米松皮下注射后能夠在短時間內(nèi)使樹鼩血糖升高，體重降低，同時發(fā)生脂代謝紊亂,糖耐量異常。這為建立實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病疾病模型提供前期基礎(chǔ)。上述實(shí)驗(yàn)充分表明樹鼩能夠作為糖尿病的模型，并為糖尿病的預(yù)防與治療奠定了基礎(chǔ)。

2.3 老年癡呆模型(AD)

老年癡呆是目前最常見的一種神經(jīng)退行性疾病，對老年癡呆的治療研究至今尚未取得突破性進(jìn)展。近年來，很多研究者就樹鼩是否能成為老年癡呆模型做了積極的探索。何保麗等[38]用β-淀粉樣蛋白(Aβ)側(cè)腦室注射建立樹鼩老年癡呆模型。從模型制作后第 8 天開始，治療組樹鼩連續(xù) 30天灌胃給予天麻素。通過RT-PCR 檢測海馬腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)mRNA 的表達(dá)，結(jié)果顯示天麻素能在一定程度上上調(diào)樹鼩海馬BDNF的表達(dá)。何亮等[39]用光化學(xué)建立腦缺血模型,氟代檸檬酸(FC)抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞(AS)代謝，在腦缺血成模后建立缺血后適應(yīng)(PC)模型，經(jīng)檢測腦缺血后，海馬HFI-1α/iNOS/No在缺血24h達(dá)高峰，iNOS的催化活性在缺血4h顯著增強(qiáng)，PC干預(yù)使缺血海馬神經(jīng)元損傷程度減輕。表明了AS可能通過HIF-1/iNOS/NO通路參與CP的海馬神經(jīng)元缺血耐受。以上實(shí)驗(yàn)研究為老年癡呆動物模型的建立和發(fā)病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

2.4 社會挫敗抑郁模型

抑郁癥是一種常見精神疾病, 主要表現(xiàn)為持續(xù)2周以上的情緒低落。世界衛(wèi)生組織預(yù)測在2030年抑郁癥的疾病負(fù)擔(dān)將高居所有疾病、傷殘總負(fù)擔(dān)的榜首。創(chuàng)制理想的動物模型是突破抑郁癥研究的技術(shù)難點(diǎn)之一。長期以來，應(yīng)用抑郁癥嚙齒類模型的眾多研究并未取得實(shí)質(zhì)性進(jìn)展，樹鼩是靈長類近親, 具有更接近于人類的大腦功能。所以，多年來研究者就建立樹鼩社會挫敗抑郁模型做了很多有益的探索。祁可可[40]根據(jù)來自進(jìn)化研究的證據(jù)提示, 樹鼩屬靈長類近緣的一種小型動物,具有較為發(fā)達(dá)的神經(jīng)系統(tǒng)和與人類相似的應(yīng)激系統(tǒng),因而可能成為創(chuàng)制精神疾病行為模型的較佳選擇。而已有的研究也表明，樹鼩社會挫敗模型可能具有比嚙齒類更好的表面效度、預(yù)測效度及結(jié)構(gòu)效度。由于樹鼩與人類的近緣關(guān)系，對其抑郁行為的腦機(jī)制研究或藥物評價可能更具潛在價值。而王靜[41]也通過闡述樹鼩可作為模型動物的潛在優(yōu)勢和樹鼩抑郁癥社會競爭失敗模型的疾病同源性、表象一致性、疾病同源性表明樹鼩有可能成為抑郁癥的動物模型，并為進(jìn)一步深入研究解決抑郁癥的難題提供了一條新途徑。

2.5 其他

隨著人類對樹鼩研究的越來越深入，越來越多的樹鼩動物模型建立成功。邵曉麗等[42]利用RT-PCR技術(shù)克隆了樹鼩Treg細(xì)胞表面標(biāo)志CD25，并對該基因的核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行了分析和同源比較，結(jié)果顯示tsCD25與靈長類同源基因有高度相似性，并為下一步制備tsCD25的單克隆抗體抑制CD4+、CD25+、Tregs功能和利用樹鼩為感染性疾病的宿主免疫應(yīng)答模型研究奠定了基礎(chǔ)。孫永梅等[43]在實(shí)驗(yàn)中, 將樹鼩連續(xù)7天、每天3次接受肌肉注射遞增劑量(5、10、15、20 mg/kg 體重)嗎啡后對嗎啡產(chǎn)生耐受和依賴；嗎啡注射完成后，腹腔注射納洛酮(1.25 mg/kg 體重)催癮，可誘導(dǎo)其條件性位置厭惡(conditioned place aversion, CPA)及相應(yīng)嗎啡戒斷癥狀的出現(xiàn)。該結(jié)果提示了樹鼩慢性嗎啡依賴模型的建立并且可用于研究嗎啡依賴和耐受的生物學(xué)機(jī)制以及減輕戒斷癥狀藥物的篩選。 王東坤等[44]采用免疫抑制的方法，將B、C、D 組依次給予 6Gy、8Gy、10Gy 加速器電子線照射處理，E 組給予環(huán)磷酰胺免疫抑制處理；之后各組均接種惡性腫瘤細(xì)胞懸液。觀察結(jié)果后可知建立樹鼩腫瘤模型的最佳條件為 8Gy的加速器電子線照射，接種的宣威女性肺腺癌細(xì)胞(XWLC-05)量為 5×106。其生存率為 63.89%，成瘤率為 61.11%。郭學(xué)軍等[45]先用甲Ⅲ流感病毒攻擊成年樹鼩造模，再通過“升降散”控制其體溫，并對接種前后樹鼩的鼻腔排毒情況和體溫變化結(jié)果進(jìn)行比較；經(jīng)病理切片和鼻洗液檢測表明流感病毒感染了樹鼩，導(dǎo)致其肺部的炎癥發(fā)生，并能在其鼻洗液中分離出流感病毒。

3 結(jié)語

綜上所述，由于在模擬人類疾病模型方面比嚙齒類動物與人類更有親緣性，人類疾病樹鼩動物模型成功的建立不僅使樹鼩可望在某些方面替代獼猴等高成本靈長類動物，成為有效的人類疾病動物模型；而且在建立人類疾病樹鼩模型對治療藥物的篩選與評價方面具有良好的優(yōu)勢，解決人類疾病機(jī)理和新藥研發(fā)中廣泛應(yīng)用的瓶頸。然而，其他更多的與人類疾病相關(guān)的動物模型尚未完全成熟。因此，人類疾病的樹鼩動物模型需要更多工作，更長時間，更持續(xù)的探索。可以預(yù)見隨著研究手段和檢測設(shè)備的發(fā)展，很多的樹鼩動物模型將得到完善，樹鼩也將會在醫(yī)學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。

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(責(zé)任編輯：魏 曉)

2014-11-26

廣西科學(xué)技術(shù)廳項(xiàng)目(桂科攻1347003-1)

郭爾楚(1986-)，男，廣西中醫(yī)藥大學(xué)新藥研究開發(fā)中心碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幩幮ШY選與新藥研究。

R-332

A

1673-2197(2015)09-0031-04

10.11954/ytctyy.201509013