微RNA在胰腺癌診斷及治療中的研究進(jìn)展

葉秋文，甘　平(綜述)，譚　晶(審校)

(昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 云南省腫瘤醫(yī)院腹部外科，昆明 650118)

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微RNA在胰腺癌診斷及治療中的研究進(jìn)展

葉秋文△，甘平(綜述)，譚晶※(審校)

(昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 云南省腫瘤醫(yī)院腹部外科，昆明 650118)

摘要：胰腺癌是常見的惡性程度較高的消化道腫瘤，除手術(shù)切除外缺少有效的治療手段，患者5年內(nèi)生存率<5%。微RNA(miRNAs)家族在分子層面影響著RNA-RNA的相互作用，miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平對細(xì)胞的代謝、生長、分化、增殖、凋亡發(fā)揮著重要作用，這種對細(xì)胞的作用同樣存在于腫瘤細(xì)胞中。近幾年來已發(fā)現(xiàn)20種以上的miRNAs，在胰腺癌的生物學(xué)行為、發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及化療的敏感性中的表達(dá)存在差異。

關(guān)鍵詞：胰腺癌；微RNA；診斷；治療

胰腺癌是一種常見的消化系統(tǒng)腫瘤，惡性程度高，早期診斷困難，一般診斷時已是晚期。其局部侵犯，早期轉(zhuǎn)移，對放化療不敏感，預(yù)后差，病死率高，治愈率低是胰腺癌的主要特點(diǎn)。在西方國家，胰腺癌的病死率居于第4位[1]，據(jù)美國2011年的統(tǒng)計，胰腺癌的發(fā)病率為44 030例/年， 37 660例患者死亡[2]。在中國腫瘤登記地區(qū)胰腺癌的發(fā)病占全部癌的2.64%，位居第7位，死亡占全部癌癥4.04%，位居第6位[3]。近年來國內(nèi)外胰腺癌的發(fā)病率均成上升趨勢，但目前的治療主要以手術(shù)為主，放化療效果不令人滿意，缺少有效的治療手段，患者5年內(nèi)生存率仍<5%[4]。1997年吉西他濱被美國食品藥品管理局[5]認(rèn)證作為治療胰腺癌的一線化療藥物，但其對胰腺癌的抑制并不理想。隨著分子生物學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，基因在腫瘤中的作用也逐漸被肯定，分子水平上通過對腫瘤靶基因的沉默從而抑制腫瘤的生長已成為研究的熱點(diǎn)。微RNA(microRNA,RNA)被證實在許多腫瘤中參與了腫瘤的生物調(diào)控作用，如乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、肝癌等，這種miRNA間接地發(fā)揮著抑癌基因和致癌基因的作用[6]?，F(xiàn)就目前對胰腺癌的診斷和治療中涉及miRNA的研究進(jìn)行綜述，希望對胰腺癌未來的診斷和治療提供幫助。

1miRNA的形成與作用

miRNA是一種小的內(nèi)源性非編碼RNA分子。首先，RNA聚合酶Ⅱ及RNA聚合酶Ⅲ啟動子指導(dǎo)miRNA基因轉(zhuǎn)錄成初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(pri-miRNA)，動物pri-miRNA第一次剪切位于細(xì)胞核內(nèi)，由核內(nèi)的核糖核酸酶-Ⅲ Dorsha/DGCR8復(fù)合體(RNase-ⅢDorsha/DGCR8)將pri-miRNA剪切成由60～70個核苷酸組成的具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的miRNA前體(pre-miRNA)[7]。其3′端具有2nt的突出臂與Ran-GTP依賴性核漿轉(zhuǎn)運(yùn)子Exprotin5(Exp5)結(jié)合，從核內(nèi)轉(zhuǎn)移至胞質(zhì)[8-9]，由另一種RNase-Ⅲ酶Dicer將pre-miRNA剪切成為由21～25個核苷酸組成的不完全配對的雙鏈RNA雙體，即成熟miRNA和其互補(bǔ)序列所組成的二聚體。成熟miRNA整合入RNA-蛋白復(fù)合物(RNA-induced silencing complex，RISC)后形成miRISC復(fù)合物(miRNA-蛋白復(fù)合物)，miRISC與靶信使RNA結(jié)合發(fā)揮降解作用，使信使RNA翻譯抑制，在轉(zhuǎn)錄后水平對細(xì)胞的代謝、生長、分化、增殖和凋亡起重要作用[10]。

2miRNA與胰腺癌的診斷

2.1胰腺癌組織中的miRNA目前，公認(rèn)的與胰腺癌聯(lián)系最緊密的miRNA是miR-21，Dillhoff等[11]對80例胰腺癌患者的研究將miR-21在胰腺中的表達(dá)分為強(qiáng)陽性、弱陽性和陰性，miR-21陽性表達(dá)的患者63例，陽性率為79%，其中14例患者miR-21有強(qiáng)陽性超表達(dá)；對照組12例正常胰腺組織中有1例miR-21陽性表達(dá)，陽性率為8%(P<0.0001)；45例慢性胰腺炎(chronic pancreatitis,CP)患者中有12例miR-21陽性表達(dá)，陽性率為27%(P<0.0001)，強(qiáng)陽性表達(dá)只存在于腫瘤中，慢性胰腺眼和正常胰腺陽性表達(dá)僅為弱陽性，提示miR-21 的檢測可以區(qū)別腫瘤的良惡性的敏感指標(biāo)。

鄭巖松等[12]利用miRNA芯片技術(shù)比較胰腺癌組織和癌旁正常胰腺組織的miRNA表達(dá)差異，用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)驗證得到，與正常胰腺組織相比，胰腺癌組織中表達(dá)上調(diào)超過1.5倍的miRNA有15個，miR-10a、miR-12、miR-106a、miR-21、miR-199a-5p、miR-34a、miR-143、miR-222、miR-23b、miR-221、miR-17、miR-196a、miR-29b、miR-181d、let-7a；旨在對microRNA譜的測定，為診斷胰腺癌提供更多可用指標(biāo)。

Szafranska等[13]通過對胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)及正常胰腺組織和CP組織中190種microRNA的分析，發(fā)現(xiàn)PDAC中41種miRNA下調(diào)(主要是miR-216、miR-217)，32種miRNA上調(diào)(主要是miR-155、miR-146、miR-221、miR-223)。同時還指出，miR-18a、miR-31、miR-93、miR-221、miR-224僅在PDAC細(xì)胞株中表達(dá)，可能是早期PDAC潛在的生物學(xué)標(biāo)志物。

某些microRNA在胰腺癌中低表達(dá)，扮演著胰腺癌中抑癌基因的角色。Lee等[14]對體外兩個細(xì)胞株MiaPACA-2和PANC-1的研究中發(fā)現(xiàn)miR-107低表達(dá)，通過增強(qiáng)miR-107的表達(dá)，細(xì)胞株的體外生長受到抑制，其他4個microRNA(miR-29a、miR-29b、miR-103、miR-320)通過甲基化CPG島的方式抑制細(xì)胞株的生長。鄭巖松等[12]對miRNA譜的測定也顯示，表達(dá)下調(diào)超過1.5倍的microRNA有11個，即miR-107、miR-130b、miR-516b、miR-637、miR-5481、miR-375、miR-516b、miR-431、miR-5481、miR-622、let-7d*。

對這些在胰腺癌中低表達(dá)的microRNA的研究，可能對臨床提供更多早期診斷胰腺癌的新指標(biāo)，也可成為基因治療胰腺癌的新靶點(diǎn)，通過刺激這些microRNA的表達(dá)，抑制胰腺癌的生長。

2.2胰腺癌血清學(xué)miRNA的檢測目前臨床上應(yīng)用的胰腺癌腫瘤標(biāo)志物是癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)與 糖類抗原19-9(carbohydrate antigen 19-9，CA 19-9)，雖然這兩個指標(biāo)對檢測腫瘤有一定的幫助，但是對胰腺癌的檢測缺乏較好的特異性與敏感性，因此能開發(fā)出一種特異性及敏感性高的生化檢測指標(biāo)是胰腺癌能早期診斷、正確診斷的必經(jīng)之路，最近許多研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌的血清學(xué)改變中加以對miRNA的檢測，能對胰腺癌的診斷提供更好的診斷基礎(chǔ)。

Kong等[15]利用實時PCR的方法對35例PDAC志愿者及15例CP患者、15例正常人的血清miRNA進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-21在PDAC組的血清中高表達(dá)，miR-21能鑒別CP組和正常人組；miR-155和miR-196a在PDAC組和CP組高表達(dá)，能對PDAC組和CP組與正常人組進(jìn)行鑒別；還發(fā)現(xiàn)miR-196a 可能是一個潛在提示胰腺癌患者的預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)，TNM分期在Ⅲ~Ⅳ期的胰腺癌患者中miR-196a的表達(dá)水平高于分期在Ⅰ~Ⅱ期的胰腺癌患者，而且對PDAC患者跟蹤調(diào)查，排除miR-196a升高的CP患者，miR-196a高表達(dá)的PDAC患者平均存活時間為6.1個月，miR-196a低表達(dá)的PDAC患者平均存活時間為12個月。

Liu等[16]利用實時PCR技術(shù)對140例胰腺癌患者(PC組)，111例CP患者(CP組)和68例正常人(正常組)血清中的RNA進(jìn)行檢測，對比這些人血清中的CA19-9及miRNAs進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)7個miRNA(miR-16、miR-21、miR-155、miR-181a、miR-181b、miR-196a、miR-210)的表達(dá)在PC組顯著增高，與在CP組和正常組的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其中miR-155、miR-181a、miR-181b、miR-196a在CP組高表達(dá)，與正常組的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.005)；其中，miR-16、miR-196a在鑒別胰腺腫瘤與非腫瘤疾病中發(fā)揮著重要作用，聯(lián)合血清CA19-9對胰腺癌組(PC組)與非胰腺癌組(CP+正常組)的鑒別診斷的靈敏度為92%、特異度為95.6%，PC組與CP組的鑒別診斷靈敏度為88.4%、特異度為96.3%。這可能對胰腺癌的早期診斷提供更準(zhǔn)確的生物學(xué)指標(biāo)。

上述對胰腺癌血清學(xué)及組織學(xué)miRNA檢測的研究都提到胰腺癌患者升高的miRNA，尤其是miR-16、miR-21、miR-155、miR-196a等，在胰腺癌的早期診斷與鑒別診斷甚至預(yù)后評估中發(fā)揮重要作用。胰腺癌胰液中表達(dá)的miRNA也有研究報道[17]，但胰液的獲取比較困難，使胰液檢查受到了局限。如果能更深地研究miRNA的基因譜，發(fā)現(xiàn)更多胰腺癌患者血清中上調(diào)和下調(diào)的miRNA與CA19-9聯(lián)合，旨在對胰腺癌早期的血液生化改變進(jìn)行更準(zhǔn)確的診斷。

3miRNA與胰腺癌的治療

3.1miRNA-胰腺癌靶向治療的新靶點(diǎn)現(xiàn)階段認(rèn)為胰腺癌發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切的原癌基因包括K-ras基因、HER2/neu基因、絲/蘇氨酸激酶2基因、EGFR基因等，其中K-ras基因被認(rèn)為是與胰腺癌關(guān)系最密切的[18]。K-ras基因編碼的p21蛋白石膜相關(guān)G蛋白，通過與細(xì)胞膜上酪氨酸激酶受體結(jié)合調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化。針對miRNA的靶向治療是一種新的治療方法，可以通過miRNA的再表達(dá)或抑制表達(dá)來抑制胰腺癌原癌基因的表達(dá)。Pramanik等[19]認(rèn)為miR-34a是p53基因轉(zhuǎn)錄信使RNA的組成部分并能調(diào)節(jié)腫瘤干細(xì)胞的生存，miR-34a和miR-143/145復(fù)合體聯(lián)合能抑制K-ras2及其效應(yīng)蛋白RREB1的表達(dá)，從而抑制胰腺癌的增殖和增加胰腺癌的凋亡。Zhao等[20]對4個PDAC細(xì)胞株(PANC-1、MIAPaCa-2、AsPC-1、BxPC-3)及人PDAC標(biāo)本進(jìn)行研究，認(rèn)為miR-217 是K-ras基因的1個靶點(diǎn)，上調(diào)miR-217能減少K-ras基因的蛋白水平和減少絲/蘇氨酸激酶的磷酸化水平，miR-217可以作為miRNA治療PDAC的一個新靶點(diǎn)。Nalls等[21]在對以5-Aza-dC 和SAHA治療的人類胰腺癌細(xì)胞株的研究中也證明miR-34a在胰腺癌腫瘤干細(xì)胞中的再表達(dá)很強(qiáng)地抑制腫瘤細(xì)胞的代謝、生長、分化、增殖，以及腫瘤的侵襲與間質(zhì)轉(zhuǎn)化，在胰腺癌的腫瘤干細(xì)胞中，miR-34a通過激活caspase-3/7來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。由此可見miR-34a在胰腺癌的miRNA靶向治療中越來越被認(rèn)可，miR-217和miR-143/145復(fù)合體等新靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)也為胰腺癌miRNA靶向治療提供了更多依據(jù)，也可聯(lián)合胰腺癌中已被熟知的miR-21[22]、miR-155[17]等設(shè)計成miRNA治療中同時被抑制的靶點(diǎn)。

3.2miRNA與胰腺癌的耐藥性目前根治性手術(shù)切除仍是目前胰腺癌患者獲得長期生存的唯一方法，胰腺癌的早期診斷是根治性手術(shù)的基礎(chǔ)，術(shù)后進(jìn)行放化療[23]。單獨(dú)利用miRNA進(jìn)行胰腺癌的靶向治療還在臨床試驗中，許多研究報道胰腺癌化療藥物的耐藥和不敏感與胰腺癌生長中某些miRNA的表達(dá)有關(guān)。LaConti等[24]證明了血清中miR-10與miR-155的表達(dá)水平與吉西他濱的敏感性與耐藥性有關(guān)，建議化療前檢測血清中這兩個miRNA的水平，不同的miRNA表達(dá)水平化療效果不同。Preis等[25]通過對PDAC的標(biāo)本分析，發(fā)現(xiàn)miR-10b在PDAC標(biāo)本中超高表達(dá)，而且證明了miR-10b的過度表達(dá)降低了吉西他濱新輔助化療的敏感性，miR-10b低表達(dá)的患者對吉西他濱化療敏感，手術(shù)后存活時間長，并推斷miR-10b是診斷PDAC的一個新生物學(xué)指標(biāo)，還能預(yù)測新輔助療法的治療效果和判斷預(yù)后。Ohuchida等[26]研究發(fā)現(xiàn)，在吉西他濱抵抗的PDAC的胰腺標(biāo)本中，miR-142-5p、miR-204低表達(dá)，這兩個miRNA高表達(dá)的患者存活時間比低表達(dá)的患者長，miR-142-5p 的表達(dá)可以作為預(yù)測患者對吉西他濱敏感性的指標(biāo)。雖然目前化療藥物的耐藥機(jī)制尚不清楚，有學(xué)者認(rèn)為[27]是多因素、多因子作用的共同結(jié)果，但是隨著miRNA的深入研究，通過對miRNA的再表達(dá)與抑制表達(dá)可能會成為減小胰腺癌耐藥性的新方法。

4展望

miRNA的發(fā)現(xiàn)對于深入探討生命現(xiàn)象的本質(zhì)，解釋細(xì)胞行為和疾病發(fā)生機(jī)制，具有重要的理論意義，到目前為止已有上百種miRNA被證明在疾病發(fā)展過程中異常表達(dá)，為許多腫瘤的治療提供了新穎的治療手段，比如乳腺癌、腎腫瘤和白血病等，但在胰腺癌中的治療創(chuàng)新尚少。miRNA對靶基因信使RNA的特異性較低，一個突變不影響miRNA的抑制作用，作用于靶基因的同時，靶基因也會反作用于miRNA，所以在胰腺癌的進(jìn)展中不可能只是單個的miRNA就能影響腫瘤的生長，可能是多個miRNA的共同作用才能對胰腺癌的抑制發(fā)揮顯著作用，需要更進(jìn)一步研究胰腺癌中多種miRNA與腫瘤間的相互作用，更加明確miRNA在胰腺癌中的作用機(jī)制。再者，目前的實驗設(shè)計都是在動物模型、胰腺癌標(biāo)本以及體外胰腺癌細(xì)胞株層面進(jìn)行的，需要更多、更大樣本的動物體內(nèi)實驗及基因功能實驗。

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Advanced Research in MicroRNA in Pancreatic Adenocarcinoma Diagnosis and TreatmentYEQiu-wen,GANPing,TANJing. (DepartmentofAbdominalSurgery,YunnanProvinceTumorHospital/theThirdAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming650118,China)

Abstract：Pancreatic cancer is a common and malignant gastrointestinal tumor,which is lack of effective treatment besides surgery,5 years survival rate is less than 5%.MicroRNAs are molecules influencing RNA-RNA interaction,performing a regulatory role in the metabolism,development,differentiation,proliferation and apoptosis of normal cells,as well as in carcinogenesis.More than 20 microRNAs have been identified,being involved in pancreatic adenocarcinoma biology,affecting tumor growth,metastatic potential,and chemotherapy sensitivity.

Key words：Pancreatic adenocarcinoma; MicroRNA; Diagnosis; Ttreatment

收稿日期：2014-08-25修回日期：2014-12-03編輯：相丹峰

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.14.027

中圖分類號：R446.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)14-2569-03