脂肪干細(xì)胞聯(lián)合富血小板血漿修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨研究進(jìn)展

朱　江(綜述)，馬　潔(審校)

(天津市康婷生物工程有限公司生物醫(yī)學(xué)研究院，天津 300385)

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脂肪干細(xì)胞聯(lián)合富血小板血漿修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨研究進(jìn)展

朱江※(綜述)，馬潔(審校)

(天津市康婷生物工程有限公司生物醫(yī)學(xué)研究院，天津 300385)

摘要：關(guān)節(jié)軟骨容易受到損傷，而且缺乏自我修復(fù)的能力，傳統(tǒng)治療方法效果并不理想。隨著再生醫(yī)學(xué)和組織工程學(xué)的發(fā)展，越來越多的研究表明，自體脂肪干細(xì)胞聯(lián)合富血小板血漿(PRP)修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨療效顯著。干細(xì)胞是尚未分化的原始細(xì)胞，在一定條件下可以向骨、軟骨和脂肪等細(xì)胞分化；PRP是高度濃縮的血小板提取物，含有多種細(xì)胞生長因子。將干細(xì)胞與PRP聯(lián)合應(yīng)用，雙重強化了關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)作用，且來源自體，安全可靠。

關(guān)鍵詞：脂肪干細(xì)胞；間充質(zhì)干細(xì)胞；富血小板血漿；關(guān)節(jié)軟骨；生長因子

關(guān)節(jié)軟骨是一種高度分化的組織，一旦受到損傷，其自身修復(fù)能力非常有限，因為它無神經(jīng)支配，亦無血管分布，祖細(xì)胞無法到達(dá)患處，而且周圍的軟骨細(xì)胞也不能遷移至患處產(chǎn)生修復(fù)基質(zhì)。輕微的軟骨損傷能夠發(fā)展成為大范圍的骨性關(guān)節(jié)炎，治療難度很大，特別是年輕患者，不宜做關(guān)節(jié)置換。臨床上用于治療關(guān)節(jié)軟骨損傷的外科手術(shù)主要分為兩類：一類側(cè)重于緩解癥狀，例如軟骨下鉆孔等；另一類側(cè)重于徹底修復(fù)，如自體/異體軟骨移植等。隨著再生醫(yī)學(xué)和組織工程學(xué)的發(fā)展，研究者嘗試?yán)酶杉?xì)胞作為種子細(xì)胞，再配合富血小板血漿(plated-rich plasma,PRP)中豐富的細(xì)胞因子，修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷，臨床效果顯著。現(xiàn)就脂肪干細(xì)胞聯(lián)合PRP修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨的研究進(jìn)展予以綜述。

1多向分化潛能的脂肪干細(xì)胞

1.1干細(xì)胞的概念干細(xì)胞是一類未分化的，能夠自我復(fù)制更新的，具有多向分化潛能的原始細(xì)胞，根據(jù)其來源的不同，可以分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。理論上，胚胎干細(xì)胞來自于受精卵，具有全能性，可以分化為三胚層的任何一種組織，然而在實際研究應(yīng)用中受到了宗教、政治和倫理等諸多因素的限制。成體干細(xì)胞在個體出生后，仍然保持未分化及穩(wěn)定狀態(tài)，被激活后可以向多種方向的細(xì)胞組織增生和分化，因此又被稱之為多能干細(xì)胞。在身體的很多組織中含有大量的成體干細(xì)胞，脂肪和骨髓是其主要的來源。

與骨髓一樣，脂肪組織起源于中胚層，含有大量的微血管網(wǎng)絡(luò)，包括胞外基質(zhì)和血管周圍間質(zhì)等，在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有非常廣闊的應(yīng)用前景。理想的干細(xì)胞種子應(yīng)該滿足以下條件：①含量豐富；②獲取方法盡可能對身體造成較小的創(chuàng)傷；③能夠通過常規(guī)的且可重復(fù)的途徑向多方向分化；④能安全、有效的移植[1]。

1.2脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells,AD-SCs)的優(yōu)勢早在20世紀(jì)90年代，研究者發(fā)現(xiàn)一些與肌肉骨骼組織相關(guān)的祖細(xì)胞參與了結(jié)締組織的修復(fù)，由于它們可以向間質(zhì)組織分化，而且是組織修復(fù)過程中非常重要的元素，1991年Caplan[2]首次將其定義為“間充質(zhì)干細(xì)胞”(mesenchymal stem cells,MSCs)。

傳統(tǒng)觀點認(rèn)為骨髓富含MSCs，后來研究發(fā)現(xiàn)，脂肪組織也含有相當(dāng)數(shù)量的MSCs，而且同樣具有纖維樣形態(tài)、集落形成能力、特異免疫表型(CD44+，CD73+，CD90+，CD105+，CD14-，CD34-，CD45-)、易分離和多向分化等特點[3-6]。嚴(yán)格意義上來說，脂肪組織中除了含有大量的MSCs以外，在細(xì)胞外基質(zhì)中還含有脂肪前體細(xì)胞(祖細(xì)胞)、外膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等，它們在組織修復(fù)中都扮演了重要的角色，所以統(tǒng)稱為AD-SCs，而不僅僅是脂肪MSCs(adipose-derived MSCs，AD-MSCs)。研究者認(rèn)為，脂肪是一個復(fù)雜的組織，相比骨髓而言，不僅更容易獲取，而且含有更多數(shù)量的未分化的MSCs，是骨髓的500～1000倍[7]。另外，脂肪是天然的活性生物支架，為干細(xì)胞生長、增殖和分化營造良好的微環(huán)境。

1.3AD-SCs的研究AD-SCs參與修復(fù)多種類型的細(xì)胞損傷，例如軟骨損傷、骨關(guān)節(jié)炎血管再生、肌腱損傷、韌帶損傷、椎間盤損傷、心肌缺血、移植物抗宿主病以及成骨不全癥等。研究者在犬[8]、兔[9]、馬[10]、鼠[11]等動物身上做了大量的實驗研究，同時也做了大量的Ⅰ期、Ⅱ期臨床試驗，結(jié)果表明，AD-SCs極大地改善了關(guān)節(jié)軟骨功能，而且無不良反應(yīng)[12]。

2富含生長因子的PRP

2.1PRP的概念PRP是指血小板濃度超過正常生理濃度數(shù)倍的血漿濃縮物，一般認(rèn)為其濃度應(yīng)至少高于生理全血濃度4倍才能達(dá)到有效治療濃度[13]。正常外周血僅含有6%的血小板，即每毫升含有大約2500個。而在高濃度PRP中，其濃度可高達(dá)94%，即每毫升含有大約10 000個血小板。根據(jù)含有白細(xì)胞的多少又可以將PRP分為貧白細(xì)胞PRP和富白細(xì)胞PRP。后者有更好的抗炎作用，因為白細(xì)胞釋放出的遞質(zhì)會誘導(dǎo)包括炎性細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞聚集和黏附，利于組織修復(fù)。所以該文研究的是富白細(xì)胞PRP。根據(jù)應(yīng)用形式，又可將PRP分為未激活PRP和激活PRP，后者通常具有凝膠和提取物等形態(tài)。血小板被激活釋放生長因子的同時，釋放出的纖維蛋白原聚合為纖維蛋白，連接成網(wǎng)狀，形成肉眼可見的凝膠狀，有一定的黏附性和強度，可以作為種子細(xì)胞生長依附的支架，在組織工程學(xué)中有廣泛應(yīng)用。而PRP提取物是指血小板活化后釋放入血漿或血清中含有的生長因子和活性蛋白的上清液，可以作為種子細(xì)胞的溶劑或者培養(yǎng)細(xì)胞的營養(yǎng)物。

2.2PRP作用機制早在20世紀(jì)90年代，PRP應(yīng)用于外科手術(shù)中，加速傷口愈合。當(dāng)時設(shè)備龐大，造價昂貴，且只能在醫(yī)院手術(shù)室中開展。最近10年，設(shè)備越來越小，成本越來越低，在普通的潔凈房間內(nèi)就能實施治療，所以PRP的臨床應(yīng)用越來越廣泛。

長期以來，人們認(rèn)為血小板在凝血止血方面發(fā)揮著重要的作用。而實際上，這只是其中一個功能。血小板中含有大量的重要的信號蛋白、生長因子、化學(xué)因子、細(xì)胞因子和其他生物活性因子，例如血小板衍生生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子β、類胰島素生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、表皮生長因子、上皮細(xì)胞生長因子等[14]，它們能夠啟動和調(diào)節(jié)一系列炎癥級聯(lián)反應(yīng)，最終起到修復(fù)組織和愈合傷口的作用[15]。而且，一定濃度的血小板還可以激活間質(zhì)細(xì)胞等修復(fù)細(xì)胞，使其增殖、分化和遷移至損傷部位。

2.3PRP制備方法美國食品藥品管理局認(rèn)證并商業(yè)化生產(chǎn)的PRP制備系統(tǒng)有9種[16]，其中部分制備系統(tǒng)能快速、穩(wěn)定地獲得PRP。但在國內(nèi)，這樣的裝置并不多，多采用開放式二次離心法制備。基本原理是將采集的外周血通過離心，分為3層，上層為上清液，下層為紅細(xì)胞，中間淺黃色層即為PRP。

從2010年起，世界反興奮劑組織禁止肌肉應(yīng)用PRP，同時要求其他的應(yīng)用方法也必須符合治療應(yīng)用的國際標(biāo)準(zhǔn)。所以，局部注射PRP是否對整體產(chǎn)生影響[17]，臨床應(yīng)用PRP有無不良反應(yīng)，還有待進(jìn)一步研究。

3AD-SCs聯(lián)合PRP修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨

該方法起源于20世紀(jì)30年代，當(dāng)時采用葡萄糖來治療肌肉骨骼損傷，效果良好。到21世紀(jì)初，研究者開始嘗試應(yīng)用PRP或者干細(xì)胞來治療，取得了一定的成果。后來，將干細(xì)胞特別是AD-SCs和PRP聯(lián)合應(yīng)用，效果顯著。2013年，Koh等[18]對18例膝關(guān)節(jié)損傷的患者進(jìn)行了臨床試驗，觀察AD-SCs聯(lián)合PRP的治療效果，結(jié)果顯示該方法緩解了疼痛，提高了膝關(guān)節(jié)功能。

3.1理想的種子細(xì)胞庫AD-SCs為結(jié)締組織和關(guān)節(jié)修復(fù)提供了種子細(xì)胞庫。研究表明[19]，AD-SCs能夠激活成纖維細(xì)胞，使其增殖、遷移以及分泌膠原蛋白等，增強結(jié)締組織的韌性強度，促進(jìn)其愈合。如前所述，AD-SCs有分化為軟骨、肌腱、韌帶、骨骼和肌肉等組織的能力，并且能夠分泌多種生長因子，影響和控制著損傷區(qū)域周圍的細(xì)胞[20]。所以，當(dāng)傳統(tǒng)的葡萄糖療法或者PRP療法治療不甚理想時，嘗試干細(xì)胞療法是不錯的選擇。

3.2良好的營養(yǎng)環(huán)境高濃度PRP為組織修復(fù)營造了良好的營養(yǎng)環(huán)境。高濃度PRP含有大量的生長因子，能夠激活肌肉骨骼自我修復(fù)能力，這對于骨組織修復(fù)至關(guān)重要，特別是肌腱的早期修復(fù)[21]。而且，AD-SCs的增殖和分化與PRP的濃度息息相關(guān)。高濃度PRP能夠釋放大量的血小板衍生生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子β1和其他生長因子，能夠顯著提高干細(xì)胞增殖和血管再生能力。

3.3立體微環(huán)境脂肪為干細(xì)胞生存和發(fā)揮作用提供了立體的微環(huán)境，細(xì)胞與細(xì)胞之間一系列復(fù)雜的物理、化學(xué)信號的傳遞影響著干細(xì)胞的功能和狀態(tài)[22]，因此未分化的間質(zhì)細(xì)胞一定要依附于其他細(xì)胞才能夠有效的增殖和分化。2010年，Little等[23]將AD-MSCs植入一個模擬的由韌帶成分和膠原凝膠構(gòu)成的韌帶基質(zhì)中，成功地證明了細(xì)胞向韌帶組織分化，而且基因和表型表達(dá)與韌帶一致。Albano和Alexander[24]報道,將富含MSCs和活性生物支架的自體脂肪組織成功修復(fù)了髕骨肌腱撕裂。

3.4獲取AD-SCs吸脂的部位大多在腹部或者側(cè)腹，吸脂的方法有多種[25]。2013年，Van Pham等[26]利用無菌注射器抽吸40～80 mL脂肪組織，通過試劑盒(AD-SCs Extraction kit,GeneWorld,Vietnam)提取分離出基質(zhì)血管層細(xì)胞，經(jīng)過離心、洗滌和消化等步驟，接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)擴增。2011年，Alderman 等[27]利用TulipTM裝置獲得5～20 mL脂肪組織，經(jīng)簡單處理但無需培養(yǎng)擴增。是否需要培養(yǎng)擴增，取決于研究者的理論、治療所需要的細(xì)胞數(shù)量以及當(dāng)?shù)氐恼叻ㄒ?guī)等。

3.5注射方法不同的臨床醫(yī)師依據(jù)多年的經(jīng)驗和理論會有不同的注射方法。Alderman等[27]在超聲的引導(dǎo)和定位下，利多卡因局部麻醉，通過螺口注射器和穿刺針將AD-SCs和PRP混合物注射到損傷部位，組織釋放出凝血酶和其他調(diào)節(jié)因子激活PRP，并且吸引生長因子和AD-SCs向損傷部位聚集。利多卡因?qū)τ诟杉?xì)胞的活性是否有影響一直存在爭議，有待進(jìn)一步研究。

經(jīng)國內(nèi)外研究者多次臨床試驗證明，自體AD-SCs聯(lián)合PRP修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨是安全而有效的。評價該方法應(yīng)從以下3點考慮：①方法安全、有效；②簡單易行，在門診區(qū)內(nèi)就可以完成；③符合當(dāng)?shù)氐恼叻ㄒ?guī)。盡管有很多文獻(xiàn)報道了干細(xì)胞療法的諸多優(yōu)點，但是臨床界內(nèi)并沒有形成統(tǒng)一的、標(biāo)準(zhǔn)的操作方法和指南，因此在治療方法、治療效果和評價標(biāo)準(zhǔn)等方面存在很大差異。

另外，在干細(xì)胞來源方面，不同的研究者也有各自不同的見解。MSCs主要存在于骨髓、脂肪以及臍帶等組織中。Centeno等[28]利用骨髓MSCs治療膝關(guān)節(jié)炎效果顯著。考慮到抽取骨髓的過程使患者感到痛苦，臍帶又來源于異體存在安全風(fēng)險，所以脂肪干細(xì)胞受到更多研究者的青睞，不僅獲取方法簡單，而且其數(shù)量也是骨髓的近千倍。但也有研究指出，AD-SCs大量表達(dá)和分泌血管內(nèi)皮生長因子α，阻止軟骨細(xì)胞再生[29]。

4結(jié)語

關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)一直是臨床上尚未解決的難題，傳統(tǒng)治療方法效果并不理想。脂肪干細(xì)胞和PRP的聯(lián)合應(yīng)用為臨床醫(yī)學(xué)界提供了一個新的思路和有效的治療方法。具有多向分化潛能的種子細(xì)胞，在多種生長因子的滋養(yǎng)下，在立體的微環(huán)境中，增殖分化，修復(fù)損傷的結(jié)締組織。其療效還有待更多的臨床病例觀察和確認(rèn)，其方法和標(biāo)準(zhǔn)還需要更多的研究者統(tǒng)一和制訂。但是有理由相信，再生醫(yī)學(xué)發(fā)展具有廣闊的應(yīng)用前景。

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Adipose-derived Stem Cells Combined with Platelet-rich Plasma for Injured Articular CartilageZHUJiang,MAJie.(BiomedicalResearchInstitute,KangtingBiotechnologyCo.Ltd,Tianjin300385,China)

Abstract:Articular cartilage is vulnerable to damage,and lack of the ability of self-repair.Traditional treatments are not ideal.With the development of regenerative medicine and tissue engineering,more and more studies show that the method combining autologous adipose-derived stem cells with platelet-rich plasma(PRP) for injured articular cartilage has remarkable effect.Stem cells are primitively undifferentiated cells which can differentiate into the bone,cartilage and fat cells under certain conditions;PRP is a highly concentrated platelet extract containing a variety of cell growth factors.The joint application doubly strengthens the effect of articular cartilage repairing,and is safe and reliable because of the autologous resources.

Key words:Adipose-derived stem cells; Mesenchymal stem cells; Platelet-rich plasma; Articular cartilage; Growth factors

收稿日期：2014-10-27修回日期：2015-01-17編輯：伊姍

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.14.016

中圖分類號：R684.3

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)14-2535-03