補(bǔ)腎益腦片對(duì)加速衰老小鼠腦組織基因表達(dá)的影響

張 沖，曹靖晨，王海燕，張永輝，陳苗苗，江 明

(南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南通 226001)

論 著

補(bǔ)腎益腦片對(duì)加速衰老小鼠腦組織基因表達(dá)的影響

張 沖，曹靖晨，王海燕，張永輝，陳苗苗，江 明

(南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南通 226001)

目的探索中藥補(bǔ)腎益腦片抗衰老的分子機(jī)制。方法使用DDRT-PCR方法研究中藥補(bǔ)腎益腦片對(duì)加速衰老(SAMR1)小鼠腦組織mRNA表達(dá)的影響，觀察SAMR1小鼠腦組織基因表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)并克隆了8個(gè)受補(bǔ)腎益腦片影響而表達(dá)下調(diào)的基因片段，分別編碼為60S核糖體L21蛋白、164kDa中心體蛋白、泛素特異性蛋白酶14、2型神經(jīng)營養(yǎng)性酪氨酸受體激酶、海馬豐富基因轉(zhuǎn)錄物1、Bptf轉(zhuǎn)錄因子、X-染色體連鎖α地貧/智力低下綜合征蛋白和細(xì)胞色素C氧化酶亞單位Ⅱ；3個(gè)受補(bǔ)腎益腦片影響而表達(dá)上調(diào)的基因片段，分別編碼為線粒體反義RNA、生長激素誘導(dǎo)膜蛋白和葡萄糖-果糖氧化還原酶。這些表達(dá)片段多數(shù)與已知的衰老相關(guān)基因同源。它們?cè)隗w內(nèi)涉及能量代謝、信號(hào)傳導(dǎo)、蛋白質(zhì)合成與降解、RNA合成與穩(wěn)定和染色質(zhì)的重塑等多個(gè)方面。結(jié)論補(bǔ)腎益腦片以多基因、多靶點(diǎn)、多效應(yīng)方式發(fā)揮其抗衰老作用。

補(bǔ)腎益腦片；抗衰老；腦組織；基因表達(dá)

衰老又稱為老化，是一種正常而復(fù)雜的生物學(xué)過程，是所有生物的共同特征，是機(jī)體功能退化以及生理功能紊亂的綜合表現(xiàn)，是一個(gè)不可逆的過程。衰老機(jī)制主要與以下3個(gè)方面因素有關(guān)：①自由基等導(dǎo)致的基因損傷積累效應(yīng)；②生物鐘基因控制的細(xì)胞程序衰老；③染色體端粒的縮短與端粒狀態(tài)的改變。從分子水平來說，均與基因表達(dá)水平的改變或基因突變相關(guān)[1-3]。快速衰老小鼠(senescence-accelerated mouse,SAM)是由日本京都大學(xué)胸部疾病研究所從1970年起開始培育而成，其中的SAMR系小鼠的平均壽命僅為13.3個(gè)月，與其他品系小鼠相比存在明顯差異。SAM小鼠是目前研究快速衰老的唯一哺乳類模式動(dòng)物[4]。利用SAM小鼠研究機(jī)體衰老的分子機(jī)制是目前衰老機(jī)制研究的熱點(diǎn)之一，其中利用SAMR1研究衰老對(duì)無老年性相關(guān)病理表型的“正?！崩匣瘷C(jī)制的闡明具有重要意義。而根據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)理論配制而成的中藥補(bǔ)腎益腦片在抗衰老和改善記憶等方面具有顯著效果，但其作用的分子機(jī)制仍不清楚。本研究使用信使核糖核酸(messager ribonuclear acids，mRNA)逆轉(zhuǎn)錄差異顯示聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (reverse transcription differential display polymerase chain reaction,DDRT-PCR)的方法，比較了飼喂補(bǔ)腎益腦片的小鼠與對(duì)照小鼠腦組織的mRNA表達(dá)情況，旨在探討其作用的分子機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)用補(bǔ)腎益腦片 由牡丹江靈泰藥業(yè)公司提供。主要成分為鹿茸(去毛)(Cornu Cervi Pantotrichum)、紅參(Radix Ginseng)、茯苓(Poria)、山藥(炒)(Rhizoma Dioscoreae)、熟地黃(Radix Rehmanniae Preparata)、當(dāng)歸(Radix Angelicae Sinensis)、川芎(Rhizoma Ligustici chuanxiong)、補(bǔ)骨脂(鹽制)(Fructus Psoraleae)、牛膝(Radix seu Caulis Epipremni pinnati)、枸杞子(Fructus Lycii)、玄參(Radix Scrophulariae)、麥冬(Herba Ophiopogonis)、五味子(Fructus Schisandrae)、酸棗仁(炒)(Semen Ziziphi Juiubae)、遠(yuǎn)志(蜜炙)(Polygala tenuifolia Willd.)、朱砂(Cinnabaris)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼喂方式 快速衰老小鼠(SAMR1TA)購自日本京都大學(xué)，委托本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)。選用2月齡雄性小鼠(體質(zhì)量18.0～20.0g)，隨機(jī)分組后采用自由采食方式，12h/12h明暗光周期條件下飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)用飼料：購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼料廠的商品化小鼠繁殖料。補(bǔ)腎益腦片經(jīng)研碎后過100目分樣篩，按1%比例加入商品化小鼠繁殖料中。加藥飼料由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼料廠加工定制。

1.1.3實(shí)驗(yàn)用試劑及試劑盒 RNeasy? Mini kit(Qiagen);QIAshredderTM(Qiagen);PCR管(Axygen)；M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Biolabs?Inc.)；dNTP(Bebco)；Taq DNA聚合酶(Promga)；α-32p-dCTP(亞輝)；RQ1無RNA酶的DNA酶(Promga)；Rnasin? RNA酶抑制劑(Promga)；尿素(Promga)；糖原(Sigma)；瓊脂糖(Biowest)；Wizard? PCR產(chǎn)物純化系統(tǒng)(Promga)；pGEM?-T Easy 載體系統(tǒng)(Promga)；氨芐青霉素(sigma)；IPTG(Promga)；X-Gal(Promga)；DH5α感受態(tài)菌(天威時(shí)代)；UltraPureTM質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒(SBS)；X射線膠片(Fuji Photo Film Co.Ltd.)；BD MarathonTM cDNA擴(kuò)增試劑盒(BD Bioscience Clontech);PROTRAN?硝酸纖維素轉(zhuǎn)印膜(Schleicher&Schuell);預(yù)雜交及雜交液(上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司);隨機(jī)引物DNA標(biāo)記試劑盒(TaKaRa Biotechnology Co.Ltd.)。

1.1.4引物合成 實(shí)驗(yàn)用引物由北京賽百盛公司合成。5’端引物：A1為5’-ACAGA GCACA，M2為5’-CACAG TTTGC，M3為5’-CCACA GAGTA，R1為5’-GGAAC TCCGT，R2為5’-GGCAA GTCAC，R4為5’-AGGAC CGCTA；3’端引物：APG為5’-AAGCT TTTTT TTTTT TG，APC為5’-AAGCT TTTTT TTTTT TC，APA為5’-AAGCT TTTTT TTTTT TA。共18個(gè)組合。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1總RNA提取 小鼠飼喂3個(gè)月后，取試驗(yàn)組與同性別對(duì)照組小鼠，斷頸處死，撕去頭部皮膚，打開頭蓋骨，取出腦組織。切取大腦左前部(約30mg)，按RNeasy mini Kit操作手冊(cè)所述方法提取總RNA。并經(jīng)RQ1RNase-Free DNase處理后備用。

1.2.2RNA逆轉(zhuǎn)錄 每個(gè)樣品取3支PCR管各加入2μL總RNA(1μg)、10×RT緩沖液4μL、2.5mmol/L dNTP 1.6μL、3'引物2μL、Rnasin?RNA酶抑制劑(40IU/μL)0.5μL，加水至19μL。65℃ 5min，42℃ 10min，每管加入M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶1μL(200IU/μL),37℃ 50min,75℃ 5min。

1.2.3逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系：逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2μL、10×緩沖液2μL、25mmol/L MgCl22μL、2.5mmol/L dNTP 1.6μL、2μmol/L 5'端引物和3'端引物(SBS合成)各2μL、Taq DNA聚合酶(5IU/μL) 0.4μL、α-32p-dCTP(10μCi/μL) 0.5μL，加水至20μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃ 10min；94℃ 1min,40℃ 2min，72℃ 1min，40個(gè)循環(huán)；72℃ 5min。

1.2.46%尿素變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及差異條帶的回收再擴(kuò)增 將1.2.3擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)6%尿素變性聚丙烯酰胺凝膠電泳后，X射線片壓片，-20℃曝光72h，從凝膠上切取差異條帶，加入100μL雙蒸水，室溫浸泡10min，煮沸15min。離心取上清，加入3mol/L乙酸鈉(pH 5.2)10μL，糖原(2.0mg/mL)2.5μL,無水乙醇450μL。-20℃過夜，4℃離心10min，沉淀用冰預(yù)冷的85%乙醇洗滌后溶于10μL雙蒸水中。再擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系：回收產(chǎn)物4μL、10×緩沖液4μL、25mmol/L MgCl24μL、2.5mmol/L dNTP 3.2μL、5'端引物(2μmol/L)4μL、3'端引物(2μmol/L)4μL、Taq DNA聚合酶(5IU/μL)0.8μL,加水至40μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃ 10min；94℃ 1min,40℃ 2min，72℃ 1min，20個(gè)循環(huán)；72℃ 5min。94℃ 10min；94℃ 1min,40℃ 2min，72℃ 1min，20個(gè)循環(huán)；72℃ 5min。

1.2.5再擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定及純化 取部分再擴(kuò)增產(chǎn)物，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，其余部分用Wizard? PCR純化系統(tǒng)進(jìn)行純化。

1.2.6純化產(chǎn)物的連接及轉(zhuǎn)化 將純化產(chǎn)物連入pGEM?-T Easy載體。轉(zhuǎn)化E.coil DH5α感受態(tài)菌。SOC培養(yǎng)基37℃，150r/min，培養(yǎng)1.5h。LB/amp/IPTG/X-Gal平板涂布，37℃培養(yǎng)16h。挑取單個(gè)白色菌落，接種LB/amp培養(yǎng)基37℃,150r/min培養(yǎng)過夜。

1.2.7質(zhì)粒提取及鑒定 取單菌落過夜培養(yǎng)物按UltraPureTM質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒使用說明提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。PCR反應(yīng)體系：質(zhì)粒提取物2μL、10×緩沖液2μL、25mmol/L MgCl22μL、2.5mmol/L dNTP 1.6μL、5'端引物(2μmol/L)2μL、3'端引物(2μmol/L)2μL、Taq DNA聚合酶(5IU/μL)0.4μL，加水至20μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃ 10min；94℃ 1min,40℃ 2min，72℃ 1min，40個(gè)循環(huán)；72℃ 5min。

1.2.8測(cè)序及GenBank檢索分析 測(cè)序交由上海生工和上海博亞完成。測(cè)序結(jié)果通過GenBank檢索進(jìn)行同源性比較分析。

1.2.9差異表達(dá)片段的Virtual Northern Blot驗(yàn)證 總RNA按BD MarathonTMcDNA擴(kuò)增試劑盒使用手冊(cè)所述方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄并擴(kuò)增后電泳。按Sambrook等[5]介紹的方法轉(zhuǎn)印至PROTRAN?硝酸纖維素轉(zhuǎn)印膜，目的片段應(yīng)用隨機(jī)引物DNA標(biāo)記試劑盒進(jìn)行標(biāo)記后行雜交分析。

2 結(jié) 果

2.1同性別加藥與對(duì)照的小鼠腦組織材料mRNA DDRT-PCR分析結(jié)果 DDRT-RCD得到11個(gè)差異條帶(見圖1)，對(duì)其進(jìn)行再擴(kuò)增并連接測(cè)序。經(jīng)GenBank檢索，顯示來自SAMR1試驗(yàn)組的片段(片段p8，p24，p31)分別與小鼠線粒體反義RNA、生長激素誘導(dǎo)膜蛋白mRNA和葡萄糖-果糖氧化還原酶結(jié)構(gòu)域1(Gfod1) mRNA同源；來自SAMR1對(duì)照組的片段(p4，p21，p23，p30，p32，p42，p43，p45)分別與60S核糖體

蛋白L21mRNA、164kDa中心體蛋白mRNA(CEP164)、泛素特異性蛋白酶14mRNA、2型神經(jīng)營養(yǎng)性酪氨酸受體激酶(Ntrk2/TrkB) mRNA、小鼠海馬豐富基因轉(zhuǎn)錄物1(Hiat1)mRNA、Bptf轉(zhuǎn)錄因子(Bptf) mRNA、小鼠X-染色體連鎖α地貧/智力低下綜合征(Atrx)mRNA、小鼠細(xì)胞色素C氧化酶亞單位Ⅱ(Cox2) mRNA同源。經(jīng)GenBank檢索對(duì)比的序列同源性結(jié)果見表1。

1，2為對(duì)照組；3，4為試驗(yàn)組；箭頭所示為差異條帶。圖1 DDRT-PCR部分結(jié)果

表1 給藥試驗(yàn)序列比較結(jié)果

注：p4，p21，p23，p30，p32，p42，p43，p45來源于對(duì)照組；p8，p24，p31來源于試驗(yàn)組。

2.2同源基因與衰老相關(guān)性檢索分析 差異表達(dá)基因與衰老相關(guān)性檢索結(jié)果見表2。為驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，對(duì)經(jīng)檢索所得的與衰老相關(guān)的片段進(jìn)行標(biāo)記，進(jìn)行Virtual Northern blot分析。部分衰老相關(guān)片段的Virtual Northern blot結(jié)果見圖2，其中為a為cDNA用advantage 2PCR kit擴(kuò)增結(jié)果；b為ubiquitin specific protease 14同源片段的virtual northern blot結(jié)果。

表2 差異表達(dá)基因與衰老相關(guān)性檢索結(jié)果

M為DL2000marker;T為試驗(yàn)組;C為對(duì)照組。圖2 試驗(yàn)組與對(duì)照組間表達(dá)變化的部分Virtual Northern blot結(jié)果

3 討 論

衰老是所有生物共有的一種正常而復(fù)雜的生物學(xué)過程。我國運(yùn)用中藥養(yǎng)生抗衰老源遠(yuǎn)流長，經(jīng)驗(yàn)豐富。最早的本草學(xué)《神農(nóng)本草經(jīng)》中所載“上品”藥物120種中就有85種注明有“不老”“長年”“耐老”“增年”“不夭”功效。傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為：腎為先天之本，腎虛是促進(jìn)衰老的首要因素，補(bǔ)腎固生命之元是延年抗衰老的首要方法。補(bǔ)“腎”藥能增強(qiáng)機(jī)體的生理功能，改善細(xì)胞的代謝和營養(yǎng)，改善腦組織功能，調(diào)節(jié)內(nèi)分泌，并能提高機(jī)體免疫力，增強(qiáng)抗老能力，減緩衰老進(jìn)程。

補(bǔ)腎益腦片由人參、鹿茸、五味子等16味具有健脾、補(bǔ)腎、益智的中藥所配制而成。本研究通過飼喂該藥試驗(yàn)，在SAMR1小鼠共獲得了11個(gè)差異表達(dá)片段。經(jīng)檢索發(fā)現(xiàn)，多數(shù)陽性片段與已知的衰老相關(guān)基因同源。

2型神經(jīng)營養(yǎng)性酪氨酸蛋白激酶(Ntrk2)是腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)/受體酪氨酸蛋白激酶(Trk)信號(hào)通路的主要成員，在老年性疾病阿爾茨海默病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[11]。Tau蛋白磷酸化改變是阿爾茨海默病的重要病理特征，USP14對(duì)Tau蛋白磷酸化起重要作用[9]。補(bǔ)腎益腦片影響腦組織Ntrk2和USP14基因的表達(dá)而發(fā)揮其抗衰老作用。

細(xì)胞凋亡是機(jī)體衰老的重要因素之一，生長激素可誘導(dǎo)膜蛋白是Bax抑制蛋白家族成員，而Bax抑制蛋白家族是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控因子[18]。Cox2也是細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中的關(guān)鍵因素[17]。補(bǔ)腎益腦片影響生長激素可誘導(dǎo)膜蛋白和Cox2的表達(dá)而影響細(xì)胞凋亡。

能量代謝在衰老進(jìn)程中處于中心地位，糖類是細(xì)胞能量的主要來源，糖類的運(yùn)輸、代謝是細(xì)胞能量代謝的基礎(chǔ)。線粒體作為細(xì)胞的能量供應(yīng)站而發(fā)揮其功能，線粒體呼吸鏈中Cox2基因的表達(dá)變化可直接影響線粒體的呼吸作用而影響細(xì)胞的能量供應(yīng)。補(bǔ)腎益腦片通過影響糖類運(yùn)輸載體Hiat1基因[13]、葡萄糖-果糖氧化還原酶基因(Gfod1)[6，12]和呼吸鏈中Cox2基因的表達(dá)而在抗衰老中發(fā)揮作用。

蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，細(xì)胞蛋白的合成在核糖體進(jìn)行，核糖體蛋白是核糖體組成的主要組分，核糖體蛋白表達(dá)變化直接影響細(xì)胞蛋白整體的合成水平。補(bǔ)腎益腦片可影響核糖體蛋白(RPL21)的表達(dá)。

RNA是蛋白合成的模板，其轉(zhuǎn)錄、加工、成熟、穩(wěn)定受多種因素的調(diào)控。其中，反義調(diào)控是其重要調(diào)控方式之一。本研究顯示，補(bǔ)腎益腦片可影響線粒體反義RNA的表達(dá)。

DNA突變及表觀遺傳學(xué)的改變?cè)谒ダ线^程中起著重要作用。Atrx在染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定和功能發(fā)揮中起著重要作用[15]，同時(shí)也是維持染色體端粒穩(wěn)定的重要因子[19]。CEP164也是維持基因組穩(wěn)定的重要因子[8]。而Bptf則通過對(duì)組蛋白甲基化狀態(tài)的改變影響基因的表達(dá)。補(bǔ)腎益腦片影響Atrx、CEP164和Bptf基因的表達(dá)，進(jìn)而影響DNA的穩(wěn)定性成表觀遺傳的改變而在抗衰老中發(fā)揮作用。

本研究結(jié)果顯示，補(bǔ)腎益腦片可影響多種衰老相關(guān)基因的表達(dá)。這些基因的表達(dá)涉及生命活動(dòng)的各個(gè)方面，包括了從物質(zhì)運(yùn)輸、能量代謝、蛋白質(zhì)合成、RNA轉(zhuǎn)錄到DNA的穩(wěn)定和表觀遺傳學(xué)的改變等多層次多環(huán)節(jié)。這與被廣泛接受的中藥作用是多靶點(diǎn)、多效應(yīng)作用的理論相一致，從分子水平上證明補(bǔ)腎益腦片從多個(gè)方面參與了機(jī)體的抗衰老作用。

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Effect of the Bushen Yinao tablet on the cerebral tissue gene expression of the senescence-accelerated Mouse R1

ZHANG Chong, CAO Jingchen, WANG Haiyan, ZHANG Yonghui, CHEN Miaomiao, JIANG Ming

(Medical College of Nantong University, Nantong 226001, Jiangsu, China)

Objective It is to explore the anti-senescence molecular mechanism of the traditional Chinese medicine Bushen Yinao tablet.Methods DDRT-PCR was applied to compare the cerebral tissue gene expression of the Senescence-Accelerated Mouse R1(SAMR1) which were treated with traditional Chinese medicine 'Bushen Yinao tablet.Results In the TCM given group, we cloned 8up-expression gene fractions which were 60S ribosomal protein L21, centrosomal protein 164kDa (CEP164), ubiquitin specific protease 14, neurotrophic tyrosine kinase receptor type 2(Ntrk2), hippocampus abundant gene transcript 1(Hiat1), bromodomain PHD finger transcription factor (Bptf), alpha thalassemia/ mental retardation syndrome X-linked homolog (human) (Atrx), cytochrome c oxidase subunit Ⅱ (Cox2), and 3down-expression gene fractions which were Mitochondrial antisense RNA, growth hormone-inducible membrane protein mRNA, glucose-fructose oxidoreductase domain containing 1(Gfod1).Most of those were homologous to the known senescence genes.In organism, they involved in energy metabolism, signal transduction, protein synthesis and Degradation, RNA Transcription and stabilization, and chromatin state remodel, etc.Conclusion This research demonstrated that Bushen Yinao tablet produced its effect with multigene, multiple targets and plurivalent effects in anti-senescence.

Bushen Yinao tablet；anti-senescence; cerebral tissues; gene expression

張沖，男，副研究員，博士，研究方向?yàn)橹兴幬镔|(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制。

江蘇省高校自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(11KJB360009)；南通大學(xué)自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(10ZY010)；江蘇省高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目(PAPD)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.19.001

R-332

A

1008-8849(2015)19-2053-05

2014-12-15