參麥注射液對兔實驗性心肌缺血預(yù)處理的實驗研究

李翠芳，鄒佩霞，姚 遠，陳德森，朱克剛

(1.湖北省十堰市太和醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學院附屬醫(yī)院)，湖北 十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學院，湖北 十堰 442000)

參麥注射液對兔實驗性心肌缺血預(yù)處理的實驗研究

李翠芳1，鄒佩霞1，姚 遠1，陳德森2，朱克剛2

(1.湖北省十堰市太和醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學院附屬醫(yī)院)，湖北 十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學院，湖北 十堰 442000)

目的 觀察參麥注射液對兔實驗性心肌缺血預(yù)處理后血管內(nèi)皮生長因子表達及氧化應(yīng)激的作用，探討其潛在機制。方法 選取8只健康日本大耳白兔為對照組，另取24只隨機分為缺血再灌注組、缺血預(yù)處理1組、缺血預(yù)處理2組，除對照組外，其余組均采用手術(shù)結(jié)扎左側(cè)冠狀動脈前降支45 min后再灌注60min，反復(fù)3次以造成實驗性心肌缺血再灌注損傷動物模型。缺血預(yù)處理1組、缺血預(yù)處理2組經(jīng)耳緣靜脈給予參麥注射液2 mL/(kg·d)、4 mL/(kg·d)連續(xù)缺血預(yù)處理7 d，對照組和缺血再灌注組給予等量生理鹽水預(yù)處理7 d。采用雙抗體夾心EUSA法測定兔缺血預(yù)處理7 d血清VEGF蛋白質(zhì)及VEGF mRNA表達情況；酶聯(lián)免疫吸附法檢測兔血清乳酸脫氫酶(LDH)、血清總超氧化物歧化酶(T-SOD)及心肌丙二醛(MDA)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)等指標。結(jié)果 預(yù)處理7 d后缺血預(yù)處理1組、缺血預(yù)處理2組VEGF蛋白質(zhì)及VEGF mRNA表達和T-SOD酶活性均高于缺血再灌注組(P均<0.05)，MDA及LDH、CK-MB含量均低于缺血再灌注組(P均<0.05)。結(jié)論 參麥注射液對兔實驗性心肌缺血再灌注損傷有一定的保護作用。其作用機制可能是促進VEGF分泌，抑制心肌缺血時脂質(zhì)過氧化，促進氧自由基清除酶清除氧自由基，加快兔缺血心肌血管內(nèi)皮新生進而改善再灌注損傷后受損血管內(nèi)皮功能。

參麥注射液；心肌缺血預(yù)處理；血管內(nèi)皮生長因子；總超氧化物歧化酶;乳酸脫氫酶;丙二醛；肌酸激酶同工酶

Key works: Shenmai Injection; myocardial ischemic preconditioning; vascular endothelial growth factor; total superoxide dismutase; malondialdehyde; lactate dehydrogenase; isoenzyme of creatine kinase

近年來的流行病學統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，我國急性心肌梗死發(fā)病率呈升高趨勢[1]。急性心肌梗死及冠脈溶栓術(shù)、冠脈搭橋術(shù)、心肌梗死再通術(shù)等常引起急性心肌缺血再灌注損傷[2]，而在發(fā)生心肌缺血再灌注損傷前及時進行干預(yù)(即缺血預(yù)處理)顯得尤其重要。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)具有增加微、小靜脈血管的通透性，促使血管內(nèi)皮細胞分裂增殖及誘導血管生成等作用[3]。參麥注射液可提高心肌細胞耐缺氧能力,增強心肌收縮力，擴張冠狀動脈，進而改善心臟功能,具有預(yù)防和治療血管再狹窄及保護缺血心肌等作用[4]。本研究通過制備兔心肌缺血再灌注損傷模型，探討了參麥注射液對兔實驗性心肌缺血后VEGF表達及氧化應(yīng)激的作用，旨在為其臨床應(yīng)用提供實驗及理論依據(jù)。

1 實驗資料

1.1實驗動物 日本大耳白兔32只，兔齡100～120d，體質(zhì)量(1.5±0.2)kg。由湖北醫(yī)藥學院實驗動物中心提供，實驗動物設(shè)施使用許可證SYXK(鄂)2011-0031，實驗動物生產(chǎn)許可證SCXK(鄂)2011-0008。動物房溫度18～25 ℃，濕度50%～75%，12 h交替光照，分籠飼養(yǎng)，自由飲水，普通飼料喂養(yǎng)，每日觀察動物進食情況，稱體質(zhì)量，及時清理糞便。采用隨機數(shù)字表編號隨機分為對照組、缺血再灌注組、缺血預(yù)處理1組和缺血預(yù)處理2組，每組8只。

1.2 儀器及藥品 BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)(成都泰盟電子有限公司)，參麥注射液(正大青春寶藥業(yè)有限公司，國藥準字Z33020021)，VEGF試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，提取mRNA試劑及反轉(zhuǎn)錄試劑(美國Invitrogen公司)，乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、丙二醛(MDA)測試盒(上海江萊生物科技有限公司，批號：KB13297)。

1.3 兔心肌缺血動物模型制備 參照文獻[5]，動物經(jīng)腹腔注射2%戊巴比妥鈉(120mg/kg )麻醉，腹部向上固定于兔臺，用BL-420F生物信號采集系統(tǒng)觀察Ⅱ?qū)?lián)心電圖。缺血再灌注組、缺血預(yù)處理1組和缺血預(yù)處理2組均經(jīng)碘伏消毒兔胸部，第5—6肋開胸暴露心臟，打開心包找到冠狀動脈并確定左側(cè)冠狀動脈前降支后，用8號小圓針自肺動脈圓錐進針，左心房邊緣處出針，結(jié)扎左側(cè)冠狀動脈前降支。當出現(xiàn)明顯的ST段上移、T波高聳、竇性心動過緩、期前收縮等心律失常性心電圖即提示模型復(fù)制成功。

1.4 兔缺血預(yù)處理方法 動物模型復(fù)制成功后，缺血預(yù)處理1組和缺血預(yù)處理2組分別耳緣靜脈注射參麥注射液按2 mL/(kg·d)和4 mL/(kg·d)連續(xù)缺血預(yù)處理7 d，對照組、缺血再灌注組給予等量生理鹽水預(yù)處理7 d。

1.5 檢測指標 4組分別于缺血預(yù)處理7 d后經(jīng)頸靜脈各取1mL靜脈血暫存至-30℃低溫冰箱保存待測。檢測時以3 000r/min高速離心(離心半徑 70mm)，低溫分離血清后取上清液，嚴格按SP試劑盒說明操作，采用雙抗體夾心EUSA法測定血清VEGF、VEGF mRNA表達情況；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測靜脈血LDH、CK-MB、T-SOD活性及心肌組織中MDA含量。

2 結(jié) 果

2.1各組VEGF、VEGF mRNA表達情況 缺血再灌注組在缺血預(yù)處理7 d后VEGF、VEGF mRNA表達水平均低于對照組(P均<0.05)；缺血預(yù)處理1組和缺血預(yù)處理2組VEGF、VEGF mRNA表達水平明顯高于缺血再灌注組及對照組(P均<0.05)，但缺血預(yù)處理1組和缺血預(yù)處理2組比較差異無統(tǒng)計學意義。見表1。

表1 各組缺血預(yù)處理7 d后VEGF、VEGF mRNA表達情況

注：①與對照組比較，P<0.05；②與缺血再灌注組比較，P<0.05。

2.2 各組MDA及CK-MB含量比較 缺血預(yù)處理7 d后，缺血再灌注組MDA及CK-MB含量均明顯高于對照組(P均<0.05)；缺血預(yù)處理1組和缺血預(yù)處理2組MDA及CK-MB含量明顯低于缺血再灌注組(P均<0.05)，但缺血預(yù)處理1組和缺血預(yù)處理2組比較差異無統(tǒng)計學意義。見表2。

表2 各組缺血預(yù)處理7 d后MDA及CK-MB含量比較

注：①與對照組比較，P<0.05；②與缺血再灌注組比較，P<0.05。

2.3 各組T-SOD、LDH含量比較 缺血預(yù)處理7 d后，缺血再灌注組T-SOD含量較對照組明顯降低(P<0.05)，LDH含量明顯升高(P<0.05)；缺血預(yù)處理1組和缺血預(yù)處理2組T-SOD含量較缺血再灌注組明顯升高(P均<0.05),LDH含量則明顯低于缺血再灌注組(P均<0.05)，但缺血預(yù)處理1組和缺血預(yù)處理2組比較差異無統(tǒng)計學意義。見表3。

表3 各組缺血預(yù)處理7 d后血清T-SOD、LDH含量比較

注：①與對照組比較，P<0.05；②與缺血再灌注組比較，P<0.05。

3 討 論

機體正常情況下，氧自由基的生成與清除維持著動態(tài)平衡，血管內(nèi)皮及功能保持在正常狀態(tài)，當心肌缺血時，機體會產(chǎn)生大量的氧自由基，心和肝臟等組織由于缺血再灌注產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，此時自由基清除酶活性降低，造成自由基清除酶對氧自由基清除能力下降，導致血管內(nèi)皮細胞嚴重受損。VEGF是一種高度特異性的促血管生長因子，可促進多種血管活性物質(zhì)合成、血管內(nèi)皮細胞增殖遷移及再生，參與冠狀動脈側(cè)支循環(huán)形成的調(diào)節(jié)[6]，故VEGF在臨床上常作為血管內(nèi)皮功能的重要指標之一。LDH、MDA及CK-MB存在于心肌細胞的胞質(zhì)中，當心肌細胞嚴重受損或者少量壞死時均會大量被釋放入血液中，故此類心肌酶譜常作為早期診斷心肌梗死等缺血性疾病的高敏感度及高特異度性指標[7]。

參麥注射液是由紅參、麥冬經(jīng)提取、純化、精制而成的中藥注射劑，主要含有人參皂苷、人參多糖、麥冬皂苷、有機酸等成分，具有益氣固脫、養(yǎng)陰生津之功效。參麥注射液可擴張冠脈，增加冠脈血流量及心肌能量儲備,改善心肌收縮力[8]，提高機體免疫力，增強心腦組織耐缺氧力，抑制脂質(zhì)過氧化, 增加心排血量等[9]。本實驗結(jié)果顯示，預(yù)處理7 d后，缺血再灌注組VEGF及VEGF mRNA表達降低， T-SOD酶的活性下降，LDH、MDA 及CK-MB含量明顯增高，說明兔實驗性心肌缺血、缺氧造成心肌細胞及血管內(nèi)皮嚴重損傷。在應(yīng)用參麥注射液預(yù)處理7 d后，VEGF及VEGF mRNA表達較缺血再灌注組明顯增強， T-SOD酶的活性明顯升高，LDH、MDA 及CK-MB含量明顯降低，說明參麥注射液具有促進VEGF分泌、誘導缺血心肌血管再生、促進受損血管內(nèi)皮修復(fù)的功能。分析認為，可能是參麥注射液不僅能促進Ca2+-ATP酶活性恢復(fù),增強Na+，K+-ATP酶活力,減少細胞內(nèi)鈣超載,還通過Na+，K+-ATP酶調(diào)節(jié)鈉氫交換來抑制鈉鈣交換,阻止Ca2+內(nèi)流,改善心肌組織能量代謝[10]，改善微循環(huán)，增加冠脈灌注和心肌供氧[11]，進而改善心肌缺血而起到保護作用。

綜上所述，參麥注射液具有促進VEGF分泌，抑制心肌缺血時脂質(zhì)過氧化，促進氧自由基清除酶清除氧自由基，減輕血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)及損傷程度，加快兔缺血心肌血管內(nèi)皮新生進而改善再灌注損傷后受損血管內(nèi)皮功能的作用。

[1] 陳灝珠，鐘南山，陸再英，等． 內(nèi)科學[M]． 8版． 北京：人民衛(wèi)生出版社，2013：236-255

[2] 劉永國． 心肌缺血/再灌注損傷的機制研究進展[J]． 醫(yī)學綜述，2010，16(21)：3267-3269

[3] 尹瑞興，馮建章，林秋雄，等． 靜脈應(yīng)用血管內(nèi)皮生長因子治療實驗性急性心肌梗死的實驗研究[J]． 中華心血管病雜志，2000，28(4)：297-298

[4] 鄒海東，何英，李勇，等.參麥注射液輔助治療老年舒張性心力衰竭的臨床觀察[J].中國實用醫(yī)藥，2007，9(10)：131-132

[5] 張彤,劉元峰,宋憲波，等.補腎活血中藥動員大鼠骨髓EPC修復(fù)內(nèi)皮功能的實驗研究[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2007，12(1)：76-77

[6] 王琚楠，劉斌，宋春莉，等.丹紅注射液對大鼠心肌缺血損傷的保護作用[J].中國老年學雜志，2010，30(17)：2481-283

[7] 許建平． 肌酸激酶同工酶MB在診斷急性心肌梗死中的價值[J]． 贛南醫(yī)學院學報，2013，33(2)：278-279

[8] 林紹彬,謝玲芳,鄭伯仁,等.血栓通聯(lián)合參麥注射液治療老年非ST段抬高型急性心肌梗死的臨床觀察[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志,2008,6(7):838-839

[9] 賈鳳玖,姚衛(wèi)華,趙青山，等． 參麥注射液和參麥注射液聯(lián)合應(yīng)用對急性心肌梗死患者肌鈣蛋白T的影響[J]． 中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2013，11(11)：1385-1386

[10] 薛搖燕，肖荷妹，王艷飛，等． 低分子肝素聯(lián)合參麥注射液治療不穩(wěn)定型心絞痛療效觀察[J]． 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2011，20(6)：707-708

[11] 王全河． 急性心肌梗死患者血清中hs-CRP、cTnI、Myo及CK-MB的表達及其臨床意義[J]． 中國醫(yī)藥導報，2012，9(25)：111-112

Experimental study on Shenmai Injection in rabbits with experimental myocardial ischemic preconditioning

LI Cuifang1,ZOU Peixia1,YAO Yuan1, CHEN Desen2,ZHU Kegang2

(1.Taihe Hospital ( The Affiliated Hospital of Hubei University of Medicine), Shiyan 442000, Hubei, China; 2.Hubei University of Medicine, Shiyan 442000,Hubei, China)

Objective It is to observe the effect of Shenmai Injection on the expression of vascular endothelial growth factor and oxidative stress in rabbits with experimental myocardial ischemic preconditioning, and to explore its potential mechanism.Methods Eight Japanese white rabbits were selected as control group (MG), another 24 ones were selected and randomly divided into ischemia/reperfusion group (IR group), ischemic preconditioning group I(group I), ischemic preconditioning group II(group II),except MG group, the rabbits in the other three groups were operated by ligation of the left anterior descending branch of coronary artery for 45min and reperfusion for 60min, repeated 3 times to establish the animal models of experimental myocardial ischemia reperfusion injury.Group I and group II were given Shenmai Injection at the dose of 2 mL/(kg·d) and 4 mL/(kg·d) through ear vein for ischemic preconditioning for 7 days.MG group and IR group were given the same volume of normal saline.Serum VEGF protein and VEGF mRNA expression were determined by double antibody sandwich EUSA method before and after preconditioning; serum LDH, T-SOD and MDA, CK-MB in heart tissue were determined by enzyme linked immunosorbent assay test (ELISA).Results After 7 days’ preconditioning, the levels of VEGF and VEGF mRNA, the activity of T-SOD were higher, while the contents of MDA, LDH and CK-MB in group I and group II than those in IR group (allP<0.05).Conclusion Shenmai Injection has a protective effect on the rats with experimental myocardial ischemia reperfusion.The mechanism may be that it can promote the secretion of VEGF, inhibit lipid peroxidation induced by myocardial ischemia, promote oxygen free radical scavenging enzymes to clear oxygen free radicals, speed up vascular endothelial growth, thus to improve the impaired vascular endothelial functions after ischemia reperfusion injury.

李翠芳，女，主管技師，研究方向為肝移植、影像學及臨床藥理學。

朱克剛，E-mail:cdscds1226@126.com

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.10.007

R-332

A

1008-8849(2015)10-1049-03

2014-11-04