壯藥白花九里明提取物急性毒性和體內(nèi)抗菌作用的研究

寧 天，黃維真，寧小清，李軍芳，梁 紅，張 清，黃薏霏

(1. 廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530023；2. 廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院/婦產(chǎn)醫(yī)院，廣西 南寧 530003；3. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530001；4. 廣西南寧市婦幼保健院，廣西 南寧 530002)

論 著

壯藥白花九里明提取物急性毒性和體內(nèi)抗菌作用的研究

寧 天1，黃維真2，寧小清3，李軍芳3，梁 紅1，張 清2，黃薏霏4

(1. 廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530023；2. 廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院/婦產(chǎn)醫(yī)院，廣西 南寧 530003；3. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530001；4. 廣西南寧市婦幼保健院，廣西 南寧 530002)

[摘要]目的 研究壯藥白花九里明提取物的急性毒性和體內(nèi)抗菌的作用。方法 序貫法測定壯藥白花九里明水、醇提物對小鼠的急性毒性；感染動物保護實驗測定壯藥白花九里明不同劑量水提物對金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌感染的小鼠體內(nèi)保護作用。結(jié)果 壯藥白花九里明水提取物小鼠灌胃的LD50為(134.17±9.043)g生藥/kg，95%的可信區(qū)間為(125.127，143.213)；醇提取物L(fēng)D50為(107.37±17.665)g生藥/kg，95%的可信區(qū)間為(89.705，125.035)。壯藥白花九里明水提物6.7 g/kg、13.4 g/kg、26.8 g/kg均能不同程度地降低金黃色葡萄球菌感染小鼠的病死率并延長平均存活時間。結(jié)論 壯藥白花九里明提取物為低毒，大劑量服用比較安全；對金黃色葡萄球菌感染的小鼠有一定的體內(nèi)保護作用，值得進一步研究與開發(fā)。

壯藥白花九里明；急性毒性；體內(nèi)抗菌；抗菌作用

壯藥白花九里明來源于菊科艾納香屬植物東風(fēng)草[Blumeamegacephala(Randeria)ChangetTseng]干燥全草入藥，味苦、微辛，性涼，具有清熱明目、祛風(fēng)止癢、解毒消腫之功效，主治目赤腫痛、翳膜遮睛、風(fēng)疹、疥瘡、跌打紅腫等[1]。艾納香屬植物有抗菌作用，如Geda等[2]報道艾納香屬中二葉艾納香(Blumea bifoliata)葉片水提物的伯克B.membranacea揮發(fā)油有抗真菌作用，對其反應(yīng)最敏感的是支孢霉菌、分支著色霉菌，鐮袍菌則對其完全免疫。艾納香(Blumea balsamifera),Blumea membranace及Blumea eriantha的揮發(fā)油也分別具有殺菌作用或可與別的草藥配伍制成殺菌精油[3-5]。但迄今為止，關(guān)于壯藥白花九里明的急性毒性和體內(nèi)抗菌研究尚少見報道。筆者通過研究其水、醇提物的急性毒性和水提物的體內(nèi)抗菌作用，旨在為進一步對其開發(fā)、臨床應(yīng)用及相關(guān)研究提供實驗依據(jù)。

1 實驗資料

1.1實驗動物 健康SD小鼠，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：SCKX桂2003-0001。飼養(yǎng)于空調(diào)室內(nèi)，室溫(22±2)℃，濕度(70±5)%，喂標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，自由飲水和攝食。

1.2 菌株及儀器、試藥 金黃色葡萄球菌ATCC25923、肺炎克雷伯菌ATCC13883由廣西臨床檢驗中心提供。METTLER-AE100電子分析天平，瑞士METTLER公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；101A-3E(T) 電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海實驗儀器有限公司；水浴鍋，上海亞榮生化儀器廠。廣西南寧市郊采集壯藥白花九里明，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)寧小清高級實驗師鑒定為菊科植物東風(fēng)草的地上部分。壯藥白花九里明水提物制備：剪碎陰干藥材，加過面水浸泡30 min后煎煮3次， 每次1 h，過濾后合并3次濾液，濃縮至濃度為3 g/mL 水煎物，取3 g/mL水提物20 mL稀釋為1 g/mL，備用，水提物提取率為12.3%。白花九里明醇提取物制備：把粗粉藥材6.5 kg放入95%乙醇浸泡72 h后滲漉提取，收集約20倍量的滲漉液，減壓回收乙醇；藥渣再用50%乙醇浸泡72 h后滲漉提取，收集約10倍量的滲漉液，減壓回收乙醇，合并干燥后得乙醇總提取物約750 g，備用，醇提物提取率為11.5%。實驗時將其用水配置成所需要的濃度。頭孢氨芐片(清遠(yuǎn)華能制藥有限公司，批號：140201)，梅山干酵母粉(河北馬利食品有限公司，批號：140628)。

1.3 實驗方法

1.3.1 序貫法急性毒性實驗 參照文獻[6-7]方法。取雌雄SD小鼠各30只，按雌雄1∶1比例分為6組，每組10只，其中一組為空白對照組，其余倍量5組。通過預(yù)試驗，找出最大致死量(Dm)和最小致死量(Dn)，根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，藥液各組日授時劑量為Dm/Dn值的2倍量、3倍量、4倍量、5倍量、10倍量,兩相鄰劑量組間的高低劑量比為1∶0.8，各小鼠均按0.4 mL/10 g分2次灌胃，2次間隔時間為6 h，空白對照組灌胃等量飲用水。灌胃前禁食不禁水15 h，間隔時間不給食，給藥后常規(guī)飼養(yǎng)，觀察小鼠體質(zhì)量變化及外觀、飲食、行為、排泄物、分泌物、中毒反應(yīng)(癥狀表現(xiàn)、起始時間、程度、持續(xù)時間、是否可逆等)及死亡情況,觀察14 d。對瀕死和死亡的動物及時尸檢,其他動物在觀察期結(jié)束后尸檢,觀察內(nèi)臟器官體積、顏色及質(zhì)地,若有肉眼可見病變進行病理組織學(xué)檢查。

1.3.2 感染動物保護實驗 參照文獻[8]方法。

1.3.2.1 預(yù)試驗 把金黃色葡萄球菌ATCC25923、肺炎克雷伯菌ATCC13883分別接種到肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后配制成1.0×109cfu/mL菌液，5個菌液稀釋組分別以5%干酵母肉湯5倍系列稀釋菌液(稀釋后濃度分別為2.0×108，4.0×107，8.0×106，1.6×106，3.2×105cfu/mL)4 ℃冷藏待用。各菌各選取體質(zhì)量18～22 g小鼠36只 , 雌雄各半分為5個菌液稀釋組和1個對照組,每組6只，對照組灌胃 5%干酵母肉湯0.5 mL/只，其余組灌胃相應(yīng)藥物0.5 mL/只 。觀察染菌后3 d內(nèi)動物的死亡情況 , 并選取感染病死率為90%～100%最小致死量作為正式實驗的感染菌液濃度。預(yù)試結(jié)果:對照組無動物死亡,金黃色葡萄球菌ATCC25923菌落濃度8×106cfu/mL致死率為100%，肺炎克雷伯菌ATCC13883菌落濃度1.6×106cfu/mL致死率為90%,確定為本次實驗感染的菌液濃度。

1.3.2.2 正式實驗 各菌選取體質(zhì)量為18～22 g健康SD小鼠60只,雌雄各半,分為5%干酵母肉湯組、頭孢拉定組、生理鹽水組、白花九里明水提物6.7 g/kg組、白花九里明水提物13.4 g/kg組、白花九里明水提物26.8 g/kg組，均灌胃給藥，容量為20 mL/kg，1次/d，連續(xù)7 d,末次給藥后1 h，后5組根據(jù)菌株毒力的預(yù)試情況分別選用使100%小鼠死亡的金黃色葡萄球菌(8×106cfu/mL)、90%小鼠死亡的肺炎克雷伯菌(1.6×106cfu/mL)的5%干酵母肉湯灌胃，0.5 mL/只,觀察和記錄各組小鼠感染后7 d內(nèi)的一般情況和死亡數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1急性毒性實驗 壯藥白花九里明水提物、醇提物灌胃后各組小鼠的主要中毒表現(xiàn)為呼吸困難或費力，喘息，用力深吸氣有明顯的吸氣聲，自發(fā)活動減少甚至不動；死亡動物死亡前有激烈的抽搐，抽搐后2～10 s內(nèi)迅速死亡，抽搐時伴急速蹬后腿、肌肉緊張、顫動、呼吸困難，死前無排尿。死亡時間，醇提物均出現(xiàn)在給藥后的40 min左右，水提物均出現(xiàn)在給藥后的60 min左右，若這段時間內(nèi)不死亡，將不會死亡，各種不適現(xiàn)象均逐漸消失，一切生理活動恢復(fù)正常。實驗后，對死亡及存活的小鼠進行尸檢，肉眼觀察小鼠的肝、腎、心臟等未出現(xiàn)體積、顏色、質(zhì)地等改變。說明壯藥白花九里明提取物未見明顯的內(nèi)臟損傷毒性，但會對呼吸系統(tǒng)等有短時的毒性影響。按序貫法公式進行計算，結(jié)果壯藥白花九里明水提物對小鼠灌胃的LD50為(134.17±9.043)g生藥/kg，LD50的95%可信區(qū)間為(125.127，143.213)；壯藥白花九里明醇提物對小鼠灌胃的LD50為(107.37±17.665)g生藥/kg，LD50的95%可信區(qū)間為(89.705,125.035)。

2.2 金黃色葡萄球菌感染小鼠死亡、存活情況 生理鹽水組動物病死率為100%，說明密度為8×106cfu/mL金黃色葡萄球菌的干酵母肉湯能明顯引起小鼠死亡。頭孢拉定組病死率顯著低于生理鹽水組(P<0.01)，且平均存活時間顯著延長(P<0.01);白花九里明水提物各組病死率顯著低于生理鹽水組(P均<0.05)，平均存活時間較生理鹽水組顯著延長(P均<0.05)，且隨劑量增加而病死率逐漸降低。見表1。

表1 各組金黃色葡萄球菌感染小鼠死亡、存活時間比較

注：①與生理鹽水組比較，P<0.01；②與生理鹽水組比較，P<0.05。

2.3 肺炎克雷伯菌感染小鼠死亡、存活情況 生理鹽水組動物病死率為90%，說明密度為1.6×106cfu/mL肺炎克雷伯菌的干酵母肉湯能明顯引起小鼠死亡。頭孢拉定組病死率顯著低于生理鹽水組(P<0.01)，且平均存活時間顯著延長(P<0.01);但白花九里明水提物各組病死率及平均存活時間與生理鹽水組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表2 各組肺炎克雷伯菌感染小鼠死亡、存活時間比較

注：①與生理鹽水組比較，P<0.01。

3 討 論

細(xì)菌耐藥性已成為世界性的難題，中藥包括民族藥呈現(xiàn)的抗菌作用越來越受到重視，開發(fā)和研究抗菌中藥對解決耐藥和抗菌藥物短缺的問題具有重要意義。廣西民間常用的壯藥白花九里明具有清熱解毒功效，治療癰腫瘡癤、皮膚瘙癢、產(chǎn)后出血繼發(fā)細(xì)菌感染[9]等效果較好，但其體內(nèi)抗菌的有效成分和作用機制等尚待進一步研究。

本實驗結(jié)果表明，壯藥白花九里明水提取物的LD50為(134.17±9.043)g生藥/kg，95%可信區(qū)間為(125.127，143.213)；醇提取物L(fēng)D50為(107.37±17.665)g生藥/kg，95%可信區(qū)間為(89.705，125.035 )。提示壯藥白花九里明提取物有輕度急性毒性，大劑量服用比較安全。壯藥白花九里明醇提物與水提物中毒后動物死亡表現(xiàn)基本一致，提示2種不同溶劑提取物中導(dǎo)致死亡的主要成分基本相同。但醇提物的死亡時間明顯短于水提物20 min左右，推斷有可能為主要成分在不同提取溶劑富集程度有所不同。

本實驗研究還顯示壯藥白花九里明水提取物對金黃色葡萄球菌有一定的體內(nèi)抗菌作用，而對肺炎克雷伯菌基本無體內(nèi)抗菌作用。這是由于G+菌與G-菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)明顯不同，這兩類細(xì)菌在抗原性、致病性及對藥物敏感性方面出現(xiàn)很大差別。G+菌細(xì)胞壁比較厚，由磷壁酸和肽聚糖組成，肽聚糖含量多達 50 層。G-菌細(xì)胞壁雖較薄，可結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，除含有1～2層的肽聚糖外，尚有外膜層位于肽聚糖層的外側(cè)，這種屏障結(jié)構(gòu)不僅使細(xì)菌不易受到人體的體液殺菌物質(zhì)、腸道的膽鹽及消化酶等的作用，還可阻止某些抗菌藥物的進入。中藥包括民族藥的抑菌原理可能比較復(fù)雜，壯藥白花九里明水提取物對金黃色葡萄球菌有不同程度的抑制作用，可能是因為破壞了細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖層致使結(jié)構(gòu)遭受破壞，再通過破損的細(xì)胞壁進入細(xì)胞內(nèi)部造成基質(zhì)及細(xì)胞器的損壞；或是藥物通過破損的細(xì)胞壁進入到細(xì)胞內(nèi)，致細(xì)胞內(nèi)的離子平衡失調(diào)，出現(xiàn)滲透壓、pH值等改變從而損傷基質(zhì)和細(xì)胞器，達到抑制細(xì)菌生長的作用。壯藥白花九里明水提取物對肺炎克雷伯菌基本無體內(nèi)抗菌作用，可能是由于兩類細(xì)菌的結(jié)構(gòu)和成分的差異使得藥物有不同通透性，以及革蘭陰性菌外膜的屏障結(jié)構(gòu)，使得藥物進入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)受阻;有研究認(rèn)為一般G+菌比G-菌對理化因子的敏感性要強[10]，本實驗結(jié)果也顯示，壯藥白花九里明水提取物對G+菌的作用比較強，而對G-菌幾乎無作用。

綜上所述，壯藥白花九里明提取物為低毒，大劑量服用比較安全；其對金黃色葡萄球菌感染的小鼠有一定的體內(nèi)保護作用，但其具體機制還不明確，這一抗菌作用明顯、用途廣泛、分布廣闊的植物資源，非常值得進一步深入研究和開發(fā)。

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Acute toxicity tests and in vitro antibacterial activity of the extracts from Blumea megacephala (Randeria) chamg et Tseng

NING Tian1，HUANG Weizhen2，NING Xiaoqing3，LI Junfang3，LIANG Hong1，ZHANG Qing2, HUANG Yifei4

(1.Guangxi Health Vocational & Technical College, Nanning 530023, Guangxi, China; 2.Guangxi Maternal and Child Health Hospital, Nanning 530003, Guangxi, China; 3.Guangxi University of TCM, Nanning 530001, Guangxi, China; 4.Nanning Maternal and Child Health Hospital, Nanning 530002, Guangxi, China)

Objective It is to study the acute toxicity and bacteriostasis in vitro of extracts from the Blumea megacephala (Randeria) chamg et Tseng. Methods Sequential method was used to determine the acute toxicity of aqueous extract and alcohol extract of Blumea megacephala (Randeria) chamg et Tseng in mice. Infected animal protecting experiment was used to determine the extract on staphylococcus aureus, klebsiella pneumoniae infection in mice. Results The LD50 and 95% confidence interval of aqueous extract and alcohol extract to the Mice IG were(134.17±9.043)g material/kg, (125.127，143.213) and (107.37±17.665)g material/kg, (89.705，125.035) respectively. High(26.8 g/kg), medium(13.4 g/kg),low (6.7 g/kg)dose group of of the aqueous extract of Blumea megacephala (Randeria) chang et Tseng could all depress the death rate leng then the average survival time of mice in fected by Staphylococcus aureus. Conclusion The aqueous extract and alcohol extract of Blumea megacephala (Randeria) chamg et Tseng is low toxicity， high doses of the aqueous extract of Blumea megacephala (Randeria) chamg et Tseng have remarkable protecting effect on mice infected by Staphylococcus aureus, so it deserves further research and development.

Blumeu megucephala(Randeria) chamg et Tseng；acute toxicity; anti-bacterial effects in the body；antibacterial action

寧天，男，教授，研究方向為中藥藥理學(xué)。

黃維真，E-mail：ningyu747@163.com

廣西衛(wèi)生廳自籌經(jīng)費科研課題(Z2013151)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.25.001

R-332

A

1008-8849(2015)25-2737-03

2015-04-05