椎間盤(pán)脫出模型大鼠脊髓血管生成因子mRNA的表達(dá)變化及電針對(duì)其影響

吳偉澎，李偉，程鵬，姜代勛，陳武

(1．北京農(nóng)學(xué)院獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;2．北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206)

椎間盤(pán)脫出是人和動(dòng)物常見(jiàn)病，針灸療法顯示了良好的療效。髓核脫出壓迫脊髓導(dǎo)致機(jī)能障礙與微循環(huán)障礙和微血管數(shù)量變化密切相關(guān)［1］。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明椎間盤(pán)脫出壓迫模型大鼠的脊髓微血管數(shù)量異常減少，而電針組能夠改善這種異常變化［2］，但其機(jī)理不明。血管生成因子與血管生成抑制因子、血管破壞因子之間的動(dòng)態(tài)平衡是維持微血管的數(shù)量和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的重要因素［3］，本研究通過(guò)觀察血管生成因子血管生成素1 (angiopoietin-1，Ang-1)、血管生成素2 (angiopoietin-2，Ang-2)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及它們的受體Tie-1、Tie-2、Flt-1，血管生成抑制因子凝血酶敏感蛋白1 (thrombospondin-1，Tsp-1)，細(xì)胞凋亡因子caspase-3 在脊髓受壓損傷后表達(dá)量的變化以及電針對(duì)其的影響，為針灸治療椎間盤(pán)病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

東華牌電針治療儀(WQ-6F);毫針(蘇州天協(xié)針灸器械有限公司，規(guī)格0.2 ×25 mm);微動(dòng)力儀(Surgic XT，NSK，Japan);Step One Plus 熒光定量PCR 儀(ABI);戊巴比妥鈉(北京化學(xué)試劑公司，德國(guó)進(jìn)口分裝);注射用青霉素鉀160 萬(wàn)單位、注射用硫酸鏈霉素50 萬(wàn)單位;TRIzol (Invitrogen);Revert Aid TM First Stand cDNA Synthesis Kit (Thermo);Trans Start Grenn qPCR Super Mix (Trans Gen Biotech)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

清潔級(jí)雄性SD 大鼠18 只，體重180 ～200 g，由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供【SCXK-(軍)2012-004】，實(shí)驗(yàn)在北京農(nóng)學(xué)院屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施進(jìn)行【SYXK (京)2010 -0003】，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R 原則給予人道的關(guān)懷。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分成三組，即電針治療組(n =6)、模型組(n=6)、假手術(shù)對(duì)照組(n =6)。電針組和模型組進(jìn)行脊髓壓迫，假手術(shù)組只暴露脊髓不壓迫。電針組進(jìn)行電針治療，對(duì)照組和假手術(shù)組不做任何治療。

1.3 椎間盤(pán)脫出模型制作

大鼠椎間盤(pán)脫出模型參考文獻(xiàn)［4］，腹腔注射戊巴比妥鈉40 mg/(kg·bw)進(jìn)行麻醉，俯臥保定，以胸腰段椎體為中心剃毛、消毒，以第一腰椎(L1)為中心，沿背正中線切開(kāi)皮膚約2 cm，分離筋膜、背最長(zhǎng)肌、多裂肌，充分暴露L1的棘突、椎板和關(guān)節(jié)突，微動(dòng)力儀小心打磨椎板，暴露脊髓背側(cè)，將自制的硅膠片從L1的左側(cè)填塞入至T13段脊髓的左腹側(cè)位，假手術(shù)組則只暴露脊髓，不進(jìn)行壓迫。分層縫合肌肉、皮膚關(guān)閉切口。術(shù)后每只大鼠肌肉注射青霉素鉀30 000 U/(kg·bw);硫酸鏈霉素15 mg/(kg·bw)，2 次/日，連用3 d。單獨(dú)分籠飼養(yǎng)，正常供給飲水和飼料，人工幫助排尿、排便，每日三次。

1.4 穴位選取與電針?lè)椒?/h3>

電針治療組，根據(jù)本課題組前期研究，選用以下三組穴位:左右膀胱俞(BL28);左側(cè)足三里(ST36)、趾間(EX-LE10);右側(cè)足三里(ST36)、趾間(EX-LE10)，每組分別接通電針儀，頻率2 Hz，幅度為5，每天一次，每次20 min，連續(xù)治療7 d。

1.5 運(yùn)動(dòng)機(jī)能評(píng)分

采用BBB 運(yùn)動(dòng)機(jī)能評(píng)分法［5］，于術(shù)前、術(shù)后每日，對(duì)大鼠左、右后肢分別進(jìn)行運(yùn)動(dòng)機(jī)能評(píng)分，其中第1 天在大鼠從麻醉狀態(tài)完全清醒后開(kāi)始評(píng)分。

1.6 標(biāo)本收集

術(shù)后第7 天，在麻醉狀態(tài)下，500 mL 生理鹽水進(jìn)行心臟灌注，在冰塊上快速取出脊髓，從壓迫正中向頭側(cè)取3 mm 用于RT-PCR 檢測(cè)，向尾側(cè)取3 mm用于病理學(xué)檢測(cè)。

1.7 病理學(xué)檢測(cè)

脊髓組織在4%多聚甲醛中固定24 h，常規(guī)脫水、組織包埋、切片、HE 染色，顯微鏡下觀察脊髓損傷情況。

1.8 RT-PCR 檢測(cè)

取50 mg 脊髓組織，用TRIzol 提取總RNA，按RevertAid TM First Stand cDNA Synthesis Kit 說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)文獻(xiàn)［6，7］選取與血管生成相關(guān)因子引物(見(jiàn)表1)，擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性2 min;94℃20 s;57 ～63℃20 s;72℃30 s，循環(huán)40 次。拷貝CT 值，采用2－ΔΔCt法進(jìn)行分析。

表1 血管生成相關(guān)因子基因引物Tab．1 The primers of the related-angiogenic genes

1.9 分析方法

2 結(jié)果分析

2.1 電針對(duì)椎間盤(pán)脫出模型大鼠后肢運(yùn)動(dòng)機(jī)能的影響

造模后大鼠的運(yùn)動(dòng)機(jī)能評(píng)分迅速降為零，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，后肢運(yùn)動(dòng)機(jī)能逐漸恢復(fù)(見(jiàn)圖1-A，B)。對(duì)第1、4、7 天數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，由圖1-C 和圖1-D 可知，在第4 天和第7 天，電針組大鼠的左、右后肢運(yùn)動(dòng)機(jī)能評(píng)分極顯著高于模型組(P ＜0.01)。電針組第7 天大鼠的左、右后肢運(yùn)動(dòng)機(jī)能評(píng)分極顯著高于第4 天(P ＜0.01);模型組第7 天大鼠的左后肢運(yùn)動(dòng)機(jī)能評(píng)分與第4 天相比差異無(wú)顯著性(P ＞0.05)，第7 天右后肢運(yùn)動(dòng)機(jī)能評(píng)分顯著高于第4 天(P ＜0.05)。表明電針能顯著改善椎間盤(pán)脫出模型大鼠的后肢運(yùn)動(dòng)機(jī)能。

2.2 組織病理學(xué)變化

電針組神經(jīng)元多完好，尼氏小體可見(jiàn)，灰質(zhì)與白質(zhì)分界明顯，軸索與髓鞘多完整排列有序，偶見(jiàn)空泡化。模型組，神經(jīng)元少見(jiàn)且多損傷，尼氏小體消失，灰質(zhì)與白質(zhì)邊界模糊不清，殘存的白質(zhì)中可見(jiàn)到不完整的軸索和髓鞘，多空泡化(見(jiàn)圖2)。

2.3 電針對(duì)血管生成相關(guān)因子的mRNA 表達(dá)的影響

由圖3 可知，模型組與假手術(shù)組相比Ang-1、Ang-2、Tie-1、Tie2、caspase-3、Tsp-1 極顯著升高(P ＜0.01)，VEGF、Flt-1 差異無(wú)顯著性(P ＞0.05);模型組與電針組相比Ang-2、Tie-1、Tie2、caspase-3、Tsp-1極顯著升高(P ＜0.01)，Ang-1、VEGF、Flt-1 無(wú)顯著性變化(P ＞0.05);電針組與假手術(shù)組各指標(biāo)差異均無(wú)顯著性(P ＞0.05)。結(jié)果顯示，模型組Ang-2、Tie-1、Tie2、caspase-3、Tsp-1 的mRNA 的表達(dá)量異常高于假手術(shù)組和電針組，電針組與假手術(shù)組各指標(biāo)差異均無(wú)顯著性，提示電針能維持血管生成相關(guān)因子的mRNA 表達(dá)的相對(duì)穩(wěn)定并使之接近機(jī)體正常水平。

圖1 電針對(duì)椎間盤(pán)脫出模型大鼠后肢運(yùn)動(dòng)機(jī)能的影響Fig．1 Effects of electroacupuncture on the hind limb motor function in the rat models of intervertebral disc herniation

圖2 電針組(A)，假手術(shù)組(B)，模型組(C)，脊髓腹角形態(tài)學(xué)觀察(標(biāo)尺=50 μm)Fig．2 Pathological changes in the anterior horn of spinal cord in the rats of the electroacupuncture group(A)，sham operation group (B)，and model group (C)．HE staining，bar=50 μm．

圖3 電針對(duì)血管生成相關(guān)因子mRNA 表達(dá)的影響Fig．3 Effects of electroacupuncture on the changes of mRNA expressions of angiogenesis-related factors

3 討論

脊髓血管能為脊髓組織運(yùn)送營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)移除組織代謝產(chǎn)物，對(duì)受損脊髓組織的修復(fù)意義重大。而血管結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定與血管生成因子和血管生成抑制因子與細(xì)胞凋亡因子關(guān)系密切［8］。

脊髓組織受到打擊、壓迫等損傷后，受損部位出血、水腫、缺氧，局部組織穩(wěn)態(tài)受到破壞，導(dǎo)致大量鈣離子內(nèi)流，自由基大量產(chǎn)生，單胺類物質(zhì)大量釋放，致使血管收縮，脊髓微血管灌注量顯著下降，進(jìn)一步加劇組織缺血缺氧的狀態(tài)［9］。在低氧環(huán)境下機(jī)體過(guò)量表達(dá)的缺氧誘導(dǎo)因子-1α (hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)與VEGF 基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，促進(jìn)VEGF 的表達(dá)［10］。VEGF 能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)血管的新生。新生血管由于缺少血管周細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性差，滲透性增強(qiáng)，加劇組織出血與水腫，造成脊髓組織二次損傷［11］。在本次試驗(yàn)中，模型組VEGF 和Flt-1 的表達(dá)量有所上調(diào)，但與電針組和假手術(shù)組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Tie-1、Tie-2 是一類酪氨酸受體，Tie-1 能維持血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能的完整性，促進(jìn)新生血管的成熟，其配體目前仍不十分清楚;Tie-2 的配體為Ang-1 和Ang-2［12］。Ang-1 和Ang-2 能競(jìng)爭(zhēng)性與Tie-2 結(jié)合并與VEGF 協(xié)同作用，參與血管新生，并且在維持新生血管的穩(wěn)定性中發(fā)揮重要作用。Ang-1 與Tie-2 結(jié)合時(shí)表現(xiàn)為維持血管結(jié)構(gòu)正常;Ang-2 與Tie-2 結(jié)合表現(xiàn)為打破血管的正常結(jié)構(gòu)，當(dāng)在VEGF高度表達(dá)的環(huán)境下，Ang-2 與Tie-2 結(jié)合有利于內(nèi)皮細(xì)胞遷移，促進(jìn)血管新生，反之則表現(xiàn)為血管的退變［13］。本研究結(jié)果中，模型組的Ang-2 與Tie-2 的mRNA 表達(dá)都顯著上調(diào)，VEGF 的mRNA 表達(dá)雖有上調(diào)，但與電針組和假手術(shù)組相比無(wú)顯著差異，提示模型組存在VEGF 低表達(dá)環(huán)境引起血管退變的因素。在VEGF 低表達(dá)環(huán)境中Ang-2 與Tie-2 的結(jié)合表現(xiàn)為血管退變，而在模型組Ang-2 與Tie-2 的表達(dá)顯著高于電針組(P ＜0.01)，提示電針能夠減少Ang-2 與Tie-2 的結(jié)合，從而有利于維持血管的正常結(jié)構(gòu)。另外，電針組與假手術(shù)組的Ang-1、Ang-2、Tie-1、Tie-2 均無(wú)顯著差異，提示電針能夠調(diào)節(jié)Ang-1、Ang-2、Tie-2、VEGF 之間的平衡使之接近正常機(jī)體水平，維持受損脊髓的血管生成相關(guān)因子的相對(duì)穩(wěn)定。本課題組前期研究表明，電針能顯著提高壓迫部位脊髓血流灌注量，促進(jìn)神經(jīng)機(jī)能的恢復(fù)［4］。本研究觀察到電針下調(diào)VEGF、Ang-1、Ang-2、Tie-2的表達(dá)，這可能與電針增加壓迫部位脊髓血流灌注量，緩解局部缺氧環(huán)境，減輕血管新生造成的二次損傷等相關(guān)［11］。

Tsp-1 作為強(qiáng)效血管生成的負(fù)性調(diào)節(jié)因子之一，能與血管內(nèi)皮細(xì)胞上的CD36 受體作用，影響血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放VEGF，抑制血管內(nèi)增殖、分化和遷移，從而抑制血管的生成;并能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮的凋亡，破壞血管結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定［14］。Caspase-3 處于凋亡有序級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游，是多種凋亡刺激信號(hào)傳遞的匯聚點(diǎn)，它的活化是凋亡進(jìn)入不可逆階段標(biāo)志。TSP-1 能與細(xì)胞膜上的CD47 受體結(jié)合，上調(diào)Caspase-3 的表達(dá)［15］，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示模型組Tsp-1 和Caspase-3 的表達(dá)顯著上調(diào)，而電針能極顯著降低TSP-1、Caspase-3 的mRNA 表達(dá)，提示電針能夠抑制血管生成負(fù)性調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，從而為血管的生成和穩(wěn)定提供有利環(huán)境。萬(wàn)賽英等［16］研究也表明電針可以上調(diào)Ang-1 及下調(diào)TSP-1的表達(dá)，促進(jìn)腦缺血區(qū)的血管的重建。余曉慧［17］等研究表明電針能通過(guò)抑制Caspase-3 在大鼠脊髓損傷神經(jīng)元中表達(dá)，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，減輕了脊髓繼發(fā)性損傷，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。

脊髓壓迫損傷后血管生成相關(guān)因子mRNA 表達(dá)異常，電針能夠下調(diào)Ang-2、Tie-2、Tsp-1 和Caspase-3 的表達(dá)，從而使血管生成促進(jìn)因子和抑制因子趨于正常水平，為受損脊髓組織修復(fù)提供有利條件。

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