丹紅注射液對大鼠50%同種異體肝移植影響的實驗研究

李翠芳，郭 萍，陳德森，李賢玉，姚 遠，郭俐宏

(1. 湖北省十堰市太和醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學院附屬醫(yī)院)，湖北 十堰 442000；2. 湖北醫(yī)藥學院，湖北 十堰 442000)

丹紅注射液對大鼠50%同種異體肝移植影響的實驗研究

李翠芳1，郭 萍1，陳德森2，李賢玉2，姚 遠1，郭俐宏1

(1. 湖北省十堰市太和醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學院附屬醫(yī)院)，湖北 十堰 442000；2. 湖北醫(yī)藥學院，湖北 十堰 442000)

目的 觀察丹紅注射液對大鼠50%減體積原位肝移植術后存活及酶活性的影響，為臨床合理用藥提供理論依據(jù)。方法 選擇30對大鼠，隨機分為模型組、丹紅小劑量組、丹紅大劑量組，采用改良雙袖套法建立50%大鼠同種異體減體積原位肝臟移植動物模型，另設10只為空白對照組，其中丹紅小劑量組、丹紅大劑量組經(jīng)尾靜脈注射丹紅注射液治療14 d，測定治療后各組大鼠肝微粒體5種細胞色素P450亞型酶(CYPIA2、CYP2C9、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4)活性及治療前后谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)和膽紅素(TBil)水平，統(tǒng)計肝移植術受體大鼠存活率。結果 丹紅小劑量組、丹紅大劑量組受體大鼠肝微粒體CYPIA2、CYP2C9、CYP3A4酶活性及ALT、AST水平均明顯降低，受體大鼠存活率為70%，與模型組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)，丹紅小劑量組、丹紅大劑量組組間比較差異無統(tǒng)計學意義。結論 丹紅注射液可提高50%減體積原位肝移植大鼠的存活率，抑制大鼠肝微粒體CYPIA2、CYP2C9、CYP3A4酶活性，促進肝功能恢復。

大鼠;丹紅注射液；肝臟移植動物模型；酶；肝功能

肝臟外科手術包括肝臟移植及部分切除術，術后除排異反應外，隨著血流再通，常常造成肝臟缺血再灌注損傷?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明，在器官移植中采用缺血預處理及藥物預處理能起到一定的保護作用，且藥物預處理的臨床效果要優(yōu)于缺血預處理方法[1]，目前藥物預處理常用于肝移植后減輕肝臟缺血再灌注損傷，可起到一定的減輕排斥反應、延長肝移植后存活時間的效果。近年來，丹紅注射液被應用到臨床防治缺血再灌注損傷，并取得肯定的臨床效果。大鼠原位肝移植于1973年由Lee等[2]報道，現(xiàn)已成為肝移植實驗研究中較為成熟的動物模型[3]。本實驗研究采用供、受大鼠50%減體積原位交叉配對肝移植術，系統(tǒng)觀察了丹紅注射液對肝移植術后大鼠存活及酶活性的影響，旨在為其臨床應用提供實驗及理論依據(jù)。

1 實驗資料

1.1實驗動物及分組 SPF級SD大鼠70只，8～10周齡，體質量(200±20)g，雄性，由湖北醫(yī)藥學院實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證SCXK(鄂)2014-0008，實驗動物設施使用許可證SYXK(鄂)2014-0031。選擇健康30只大鼠采用隨機數(shù)字表編號，隨機分為模型組、丹紅小劑量組、丹紅大劑量組，另30只為供體各10只對應各組進行本組交叉同種異體原位50%減體積肝移植手術(即對本組供、受體配對交叉原位50%減體積肝移植，以減少實驗用動物)，另取10只為空白對照組。每對供、受體大鼠體質量相差≤15 g。

1.2 藥品試劑及儀器 丹紅注射液(菏澤步長制藥有限公司，國藥準字Z20026866)；Waters2010型高效液相色譜儀(迪馬公司)，CAY-1型液體快速混合器(北京長安儀器廠)，SHA-C水浴恒溫振蕩器(江蘇金壇市億通電子有限公司)，GR22GⅡ型高速冷凍離心機(美國Beck-man公司)，KQ-500E型超聲清洗器(昆山市超聲儀器限公司)。

1.3 大鼠50%同種異體減體積原位肝臟移植方法 參照何勇等[4]改良的“4貫通、3結扎、2回折法”，對配對大鼠行50%同種異體減體積原位交叉肝臟移植術。供、受體術前禁食12 h，不禁水。術前15 min肌肉注射阿托品0.04 mg，采用10%的水合氯醛0.25 mL/100 g腹腔注射麻醉供、受體大鼠。供體采用4次貫通穿刺、3次結扎和2回折的肝臟縫扎方法取供肝的50%減體積。受體自身肝臟切除與供體50%減體積相同，原位置入受體腹腔進行配對交叉肝臟移植。分層關閉腹腔。造模后，丹紅小劑量組、丹紅大劑量組分別經(jīng)尾靜脈注射丹紅注射液2 mL/(kg·d)和4 mL/(kg·d)，其余組給予等量生理鹽水，連續(xù)治療14 d。整個實驗應盡量減少動物用量，術后保證動物福利，每日用碘伏消毒1次傷口，予頭孢克洛0.1 g/(100 g·d)肌肉注射預防感染，連用1周。動物房溫度18～25 ℃，濕度50%～75%，大鼠單籠飼養(yǎng)，12 h交替光照使之盡快復溫，動物蘇醒后自由飲水，普通飼料喂養(yǎng)，每日觀察動物進食情況，稱體質量，及時清理糞便，消毒護理時采取盡量減少動物的疼痛和不適等人道主義措施[5]。在實驗過程中倡導人道的使用和管理實驗動物，盡量滿足實驗動物倫理要求[6]。

1.4 檢測指標 于治療前及治療14 d后，分別經(jīng)大鼠眶靜脈取血0.5 mL測定谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、膽紅素(TBil)。采血完畢后斷頭處死大鼠取肝臟，參照文獻[7]，采用差速離心法制備鼠肝微粒體。按1∶4(質量體積比)加入勻漿緩沖液(50 mmol/L Tris，11.5 g/L氯化鉀，用鹽酸調節(jié)pH至7.4)制備勻漿，4 ℃下5 000 r/min離心20min，取上清液轉移至超速離心管中，4 ℃下5 000 r/min離心60 min，將沉淀重懸于0.25 mol/L的蔗糖溶液中即為肝微粒體，分裝，置-80 ℃冰箱內保存?zhèn)溆茫挝⒘ｓw體外37 ℃預孵育30 min取上清液進樣，用高效異相色譜儀檢測肝微粒體CYPIA2、CYP2C9、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4。

2 結 果

2.1肝移植大鼠一般情況 空白對照組大鼠體毛有光澤，反應敏捷，飲食正常，無死亡。模型組大鼠(10對20只)14 d后精神及自潔情況極差，體毛無光澤，卷縮，拒絕活動，舔足、攝食、飲水均減少，10只死亡，存活率為50%。丹紅小劑量組、丹紅大劑量組大鼠(共20對40只)精神及自潔情況較模型組稍好，部分大鼠體毛無光澤，舔足、活動減少，攝食及飲水量與正常大鼠無明顯差別，共12只大鼠死亡，存活率為70%。

2.2 各組大鼠肝微粒體CYPIA2、CYP2C9、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4表達情況 模型組CYPIA2、CYP2C9及CYP3A4表達增強，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)，但CYP2D6、CYP2E1的表達與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學意義；丹紅小劑量組、丹紅大劑量組治療14 d后CYPIA2、CYP2C9 及CYP3A4表達明顯低于模型組與空白對照組(P均<0.05)，但CYP2D6及CYP2E1的表達與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。丹紅小劑量組與丹紅大劑量組比較差異均無統(tǒng)計學意義。見表1。

2.3 各組大鼠肝功能ALT、AST、TBil比較 治療14d，模型組ALT、AST、TBil均明顯高于治療前及空白對照組(P均<0.05);丹紅小劑量組、丹紅大劑量組ALT、AST、TBil高于治療前(P<0.05)；丹紅小劑量組和丹紅大劑量組AST均明顯低于模型組(P均<0.05)，但TBil與模型組比較差異均無統(tǒng)計學意義。丹紅小劑量組和丹紅大劑量組各指標比較差異均無統(tǒng)計學意義。見表2。

表1 各組大鼠肝微粒體CYPIA2、CYP2C9、CYP2D6、 CYP2E1、CYP3A4表達情況

注：①與空白對照組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

表2 各組大鼠肝功能ALT、AST、TBil比較

注：①與治療前比較，P<0.05；②與空白對照組比較，P<0.05；③與模型組比較，P<0.05。

3 討 論

丹紅注射液是將中藥丹參、紅花按科學配方提取的復方制劑，主要有效成分包括丹參酮、丹參酚酸、紅花黃色素、黃酮類化合物等，其中《藥品化義》記載紅花味辛性溫，“善通利經(jīng)脈”；《吳普本草》記載丹參味辛性涼，“治心肌腹痛”[7]。二藥一溫一涼，具有調經(jīng)鎮(zhèn)痛、涼血消癰、活血通經(jīng)、散癖鎮(zhèn)痛之功效[8]，還可活血化瘀，通脈舒絡，改善微循環(huán)，能有效降低血液黏稠度，阻止血栓形成和促進血栓溶解，降低肝微粒體P450亞型酶活性[9]，并促進血管內皮生長因子分泌及血管重建，抑制炎癥因子表達進而改善血管內皮功能，對組織器官缺血再灌注損傷有保護作用[10]。現(xiàn)代醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)，丹參具有增強Ca2+-ATP酶活性,阻止Ca2+內流,減少細胞內鈣超載以改善肝臟組織能量代謝作用[11]。

在臨床使用的藥物大約有90%是經(jīng)過細胞色素P450亞型酶CYPIA2、CYP2C9、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4代謝的[12]。CYPIA2、CYP2C9及CYP3A4酶主要在肝臟組織中表達，占肝臟P450蛋白含量的13%以上，與許多的藥物代謝及藥物的相互作用密切相關[13]，這些酶的活性升高代表所使用的藥物臨床不良反應增加，療效降低，故在臨床使用時應盡量避免與經(jīng)P450亞型酶代謝的藥物聯(lián)合應用，以免影響療效。ALT、AST、TBil是臨床衡量肝功能的重要指標，故本實驗研究采用P450亞型酶及ALT、AST、TBil等指標評定丹紅注射液對大鼠50%減體積原位肝移植術后肝存活及酶活性的影響。結果顯示，丹紅小劑量組、丹紅大劑量組治療14 d后攝食及飲水量正常，存活率達70%；CYPIA2、CYP2C9及CYP3A4活性降低，說明丹紅注射液可抑制大鼠50%減體積原位肝移植術后藥物代謝的相互作用，減少不良反應并增加療效，與劉高峰等[14]研究結果一致；ALT、AST降低，提示丹紅注射液具有促進肝功能恢復的作用。這可能與丹紅注射液具有活血化瘀，減輕血管壁炎癥反應[8]，涼血消癰，進而改善微循環(huán)，增加組織供氧，促進側支循環(huán)重建及血管新生作用有關。但丹參大小劑量組各指標比較差異無統(tǒng)計學意義，還需進一步研究。

綜上所述，丹紅注射液能提高50%減體積原位肝移植的大鼠存活率，抑制大鼠肝微粒體細胞色素P450亞型酶(CYPIA2、CYP2C9及CYP3A4)活性，減輕藥物不良反應，促進肝功能恢復。

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Experimental study of Danhong Injection on rat after 50% allogeneic liver transplantation

LI Cuifang1,GUO Ping1,CHEN Desen2,LI Xianyu2,YAO Yuan1, GUO Lihong1

(1.Taihe Hospital(Affiliated Hospital of Hubei University of Medicine), Shiyan 442000, Hubei, China; 2.HuBei University of Medicine, Shiyan 442000,Hubei, China)

Objective It is to observe effect of Danhong injection on hepatic viability and enzyme activity in rats after 50% reduced size orthotopic liver transplantation, and provide a theoretical basis for clinical rational drug use. Methods 30 rats were selected and randomly divided into model group, small dose Danhong group, high dose Danhong group, using modified double cuff method to establish animal model of 50% rat orthotopic reduced size orthotopic liver transplantation, another 10 rats were chosen as blank control group. Small dose Danhong group and high dose Danhong group were treated with Danhong Injection by the tail vein injection for 14 days. Before and after treatment, the activities of 5 kinds of subtypes of enzyme in rat liver microsomal cytochrome (CYPIA2, CYP2C9, CYP2D6, CYP2E1, CYP3A4), the levels of alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST) and total bilTMGubin (TBil) were determined, survival rate of liver transplantation recipient rats were counted. Results The activities of rat liver microsomal CYPIA2, CYP2C9, CYP3A4 and the levels of ALT, AST were lower in small dose Danhong group and high dose Danhong grouop than those in model group, the survival rate was 70% in Danhong Injection groups, compared with the model group, the differences were all statistically significant (Pall<0.05), but there was no significant difference between the two Danhong Injection groups. Conclusion Danhong Injection can increase survival rate of the rats after 50% reduced size orthotopic liver, inhibit the activities of CYPIA2、CYP2C9、CYP3A4 in rat liver microsomes, promote the recovery of liver function.

rat; Danhong Injection; liver transplantation animal model; enzyme; liver function

李翠芳，女，主管技師，研究方向為肝移植、影像學及臨床藥理學。

陳德森，E-mail：cdscds1226@126.com

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.11.008

R-332

A

1008-8849(2015)11-1165-03

2014-12-10