順鉑聯(lián)合氟西汀對肺癌伴抑郁小鼠干預(yù)的研究

李密輝，吳曉，魏凱，林燕華，魏穎，孫婧，羅清莉，劉寶君，董競成

(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院，上海 200040)

腫瘤疾病作為一個重大的生活應(yīng)激事件對患者心理有著很大的影響。有研究表明，腫瘤患者抑郁發(fā)病率為15% ～29%，是正常人患病率的3 ～5倍［1］。并且腫瘤治療本身會增加患者患抑郁癥的風(fēng)險［2］。情感應(yīng)激可降低腫瘤患者的生活質(zhì)量、影響治療效果并且會增加致死率［3］。研究顯示，抑郁平均會使腫瘤患者生存期下降10% ～20%左右，一項為期17年的前瞻性研究結(jié)果表明，癌癥的死亡率和抑郁情緒密切相關(guān)，高度抑郁者的死亡率是非抑郁者的2 倍［4］。因此，腫瘤與抑郁相伴發(fā)生有著密切的病理生理關(guān)系。

本研究通過建立小鼠肺癌伴抑郁模型，使用抗抑郁藥物氟西汀聯(lián)合化療藥順鉑對其進行干預(yù)，通過觀察抑郁及腫瘤相關(guān)指標(biāo)的改善情況，評價其療效并探討其作用的內(nèi)在機制。

1 材料和方法

1.1 材料

SPF 級C57BL/6J 小鼠(簡稱“C57 小鼠”)40只，雄性，7 周齡，體重20 ～24 g，由中國科學(xué)院上海實驗動物中心提供【SCXK(滬)2012-0002】。SPF 級CD1 小鼠30 只，雄性，9 ～10月齡退役種鼠，體重35～40 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供【SCXK(京)2012-0036】。動物飼養(yǎng)于復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院實驗動物中心【SYXK(滬)2010-0099】;Lewis肺癌(Lewis lung cancer，LLC)細胞株惠贈于復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院;小鼠鼠籠帶孔有機塑料擋板;社交接觸曠場(42 cm × 42 cm × 42 cm);Noldus 動物行為學(xué)視頻跟蹤系統(tǒng)(Ethovision XT8.5，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腦科研究院提供);皮質(zhì)醇試劑盒:德國LDN 公司產(chǎn)品;IL-6 試劑盒美國R＆D 公司產(chǎn)品;抗VEGE 抗體英國Abcam 產(chǎn)品;抗NF-κB 抗體美國CST 產(chǎn)品;鹽酸氟西汀膠囊:蘇州禮來制藥有限公司產(chǎn)品;注射用順鉑:山東齊魯制藥有限公司產(chǎn)品。

1.2 小鼠社交應(yīng)激性抑郁及腫瘤模型的建立

社交應(yīng)激小鼠均采取單籠飼養(yǎng)，造模方法參考文獻［5－6］，首次應(yīng)激開始前將攻擊性較強的CD1 小鼠放置于透明擋板一側(cè)24 h;將C57 小鼠放置CD1同側(cè)社交應(yīng)激4 ～5 min，之后將C57 放置于透明擋板另一側(cè)，使之能觀察到CD1 并能嗅到對方氣味，相處24 h 后，開始下一輪應(yīng)激;連續(xù)應(yīng)激10 d，10 d之中CD1 小鼠位置不變，C57 小鼠每天變換鼠籠，使之不遇到同一只CD1 小鼠，應(yīng)激結(jié)束后進行社交接觸行為學(xué)實驗。(2)腫瘤組小鼠均在社交應(yīng)激結(jié)束后于右前肢腋后側(cè)皮下接種2 ×106個LLC 細胞。

1.3 實驗分組及處理

1.3.1 動物分組

將40 只C57 小鼠隨機分為正常對照組(正常組，10 只);肺癌伴抑郁模型組(模型組，10 只);模型+順鉑組(單藥組，10 只);模型+順鉑+氟西汀組(雙藥組，10 只)。正常組小鼠正常飼養(yǎng);模型組應(yīng)激結(jié)束后接種LLC 細胞，生理鹽水灌胃0.3 mL/d，共14 d，種瘤后每3 天1 次腹腔注射生理鹽水每次0.2 mL，共4 次;單藥組社交應(yīng)激結(jié)束后接種LLC 細胞，生理鹽水灌胃0.3 mL/d，共14 d，種瘤后每3 天1 次腹腔注射順鉑2 mg/kg，共4 次;雙藥組社交應(yīng)激結(jié)束后接種LLC 細胞，氟西汀20 mg/kg 灌胃，共14 d，種瘤后每3 天1 次腹腔注射順鉑2 mg/kg，共4 次。正常組小鼠5 只每籠，接受社交應(yīng)激小鼠單籠飼養(yǎng)，自由進食飼料與水，室溫20 ～25℃，相對濕度50% ～70%，光暗周期12 h。

1.3.2 小鼠行為學(xué)觀察

10 d 社交應(yīng)激結(jié)束后，采用社交接觸實驗對小鼠行為學(xué)進行評價，實驗分為兩個150 s，第一個150 s 期間CD1 小鼠不在曠場之內(nèi)，將C57 小鼠放置于社交接觸曠場中，曠場一側(cè)為透明有孔有機玻璃圍墻;中間間隔30 s，在30 s 內(nèi)將C57 小鼠從曠場轉(zhuǎn)移到飼養(yǎng)鼠籠內(nèi)，同時將未與該C57 小鼠有社交應(yīng)激接觸的CD1 小鼠放入到圍墻內(nèi)，同時將C57再次放入到社交曠場內(nèi)，記錄下一個150 s 內(nèi)C57小鼠在曠場內(nèi)的運動軌跡［5］。

1.3.3 血清標(biāo)本收集

接種腫瘤第15 天，所有小鼠眼眶動脈采血，4℃靜置2 h 后，3000 r/min，4℃離心15min，上清液－80℃保存，ELISA 方法檢測血清中皮質(zhì)醇及IL-6 水平，按照試劑盒說明書進行檢測。

1.3.4 RT-PCR 方法檢測海馬組織中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotropic factor，BDNF)mRNA 表達

取血后將小鼠置于冰上，頸后部開顱，分離海馬組織，迅速投放入液氮中，實驗結(jié)束后放入－80℃冰箱凍存待測。用Trizol 試劑盒對海馬組織中總RNA進行提取，將提取出的mRNA 進行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA 模板，以cDNA 為模板進行PCR 擴增。引物序列，BDNF 上游引物:5’GAG GTC TGA CGA CGA CAT CAC 3’，下游引物:5’GCT CCA AAG GCA CTT GAC TG 3’;β-actin 上游引物:5’CCT CTA TGC CAA CAC AGT 3’;下游引物:5’AGC CAC CAA TCC ACA CAG 3’?？偡磻?yīng)體系為20 UI，反應(yīng)過程為:95℃5 min;95℃5 s;60℃30 s(40 個循環(huán))，以β-actin 為內(nèi)參，進行吸光度比值分析，以此代表目的基因的表達水平。

1.3.5 免疫組織化學(xué)方法檢測腫瘤組織中NF-κB與VEGF 表達

小心剝離皮下腫瘤組織并稱重，將其置于4%多聚甲醛中進行固定，用石蠟包埋切片，一抗4℃孵育過夜，二抗37℃孵育1.5 h，DBA 顯色3 ～5 min，鏡下觀察，陽性產(chǎn)物呈棕黃色或黃色。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示(sˉx);符合正態(tài)分布和方差齊性，資料采用單因素方差分析(ANOVA)，兩兩比較采用LSD 檢驗，方差不齊采用秩和檢驗，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 社交應(yīng)激行為學(xué)評價

末次社交應(yīng)激結(jié)束24 h 后對各組小鼠進行社交接觸曠場實驗，CD1 小鼠未出現(xiàn)時各組小鼠在社交區(qū)活動時間差異無顯著性(P ＞0.05);CD1 小鼠出現(xiàn)后，接受過社交應(yīng)激三組小鼠在社交區(qū)活動時間明顯低于正常組(P ＜0.05);各組自身比較，正常組小鼠在CD1 出現(xiàn)后表現(xiàn)出更為活躍的社交水平，在社交區(qū)停留時間明顯延長，而接受社交應(yīng)激的各組小鼠則表現(xiàn)出社交回避行為，在社交區(qū)停留時間較CD1 未出現(xiàn)時明顯下降(P ＜0.05)。見圖1。

圖1 各組小鼠在CD1 小鼠出現(xiàn)前后在社交區(qū)停留時間Fig.1 The stay time in the interaction zone of mice of all groups before and after CD1 mice presence

2.2 血清皮質(zhì)醇及IL-6 水平變化

與正常組比較，模型組血清皮質(zhì)醇及IL-6 水平明顯升高(P ＜0.05);單藥組血清皮質(zhì)醇及IL-6 水平與模型組相比有降低趨勢但差異無顯著性(P ＞0.05);而雙藥組與模型組比較皮質(zhì)醇及IL-6 水平明顯下降，差異有顯著性(P ＞0.05)。見圖2。

2.3 海馬組織BDNF mRNA 表達

圖2 各組小鼠血清皮質(zhì)醇與IL-6 水平比較Fig.2 The levels of serum cortisol and IL-6 in the mice of all groups

使用RT-PCR 方法檢測海馬組織中BDNF mRNA 表達，與正常組比較，模型組小鼠海馬組織BDNF mRNA 表達水平下降(P ＜0.05);單藥組與模型組比較差異無顯著性(P ＞0.05);雙藥組與模型組和單藥組比較BDNF mRNA 表達明顯升高(P ＜0.05)。見圖3。

2.4 各組皮下腫瘤重量與模型組比較

單藥組和雙藥組皮下腫瘤重量明顯降低，差異具有顯著性(P ＜0.05);單藥組與雙藥組相比差異無顯著性(P ＞0.05)。見圖4。

圖3 各組小鼠海馬BDNF mRNA 表達水平Fig.3 BDNF mRNA expression levels in the hippocampus of mice in all groups

2.5 腫瘤組織中NF-κB 及VEGF 蛋白表達

與模型組相比，單藥組和雙藥組腫瘤組織中NFκB 及VEGF 表達水平明顯降低(P ＜0.01);單藥組與雙藥組比較差異無顯著性(P ＞0.05)。見圖5，6。

圖4 各組小鼠皮下腫瘤重量Fig.4 Tumor weight of the mice in all groups

圖5 各組皮下腫瘤組織NF-ΚB 與VEGF 免疫組化平均吸光度值Fig.5 The IOD of NF-ΚB and VEGF in tumor tissues determined by immunohistochemical staining.

3 討論

抑郁與腫瘤關(guān)系密切，許多臨床研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)激、慢性抑郁、社會支持和心理因素可能影響腫瘤的發(fā)生及進展，其主要機制可能為各種應(yīng)激性因素激活下丘腦-垂體-腎上腺軸和交感神經(jīng)系統(tǒng)兩條信號級聯(lián)途徑啟動應(yīng)激反應(yīng)［7］。本實驗通過社交失敗應(yīng)激誘導(dǎo)C57 小鼠建立社交應(yīng)激性抑郁模型，該模型被認為是應(yīng)激誘導(dǎo)抑郁相關(guān)情緒較為可靠的模型，與人類抑郁癥的若干行為學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)改變具有相似性［8］。通過社交接觸曠場實驗評價小鼠行為學(xué)，發(fā)現(xiàn)遭受社交應(yīng)激失敗的各組小鼠比正常組小鼠在社交區(qū)停留時間明顯縮短，這種社交回避行為在CD1 小鼠出現(xiàn)以后更加明顯，而正常組小鼠則表現(xiàn)出更為活躍的社交水平，實驗結(jié)果表明重復(fù)性的暴露于社交失敗應(yīng)激因素之下，會導(dǎo)致抑郁樣表型，表現(xiàn)為社交回避行為［9］。研究表明，下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA 軸)在抑郁癥的發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用［10］。在抑郁患者當(dāng)中，HPA 軸被激活，腎上腺分泌大量糖皮質(zhì)激素，導(dǎo)致血液中糖皮質(zhì)激素水平升高。亦有研究報道急性應(yīng)激能夠使小鼠體內(nèi)糖皮質(zhì)激素升高［11］。而糖皮質(zhì)激素可使某些腫瘤細胞抵抗凋亡并且下調(diào)機體的免疫反應(yīng)，這可能有助于腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移［12］。我課題組前期研究亦證實給予社交應(yīng)激能夠促進腫瘤生長［13］。研究發(fā)現(xiàn)IL-6 與抑郁和腫瘤的進展有較為明確的相關(guān)性，腫瘤伴抑郁患者血清IL-6 水平較不伴抑郁腫瘤患者明顯升高［14，15］。本實驗中肺癌伴抑郁模型組小鼠血清皮質(zhì)醇及IL-6 水平較正常組明顯升高，也印證這一觀點。經(jīng)氟西汀和順鉑藥物治療的雙藥組皮質(zhì)醇和IL-6 水平較模型組則明顯下降，單藥組皮質(zhì)醇及IL-6 水平經(jīng)治療后也有下降但較模型組差異不顯著。說明抗抑郁與抗腫瘤治療均能降低血清中炎癥因子IL-6 水平，但單純抗腫瘤治療不能改善HPA軸紊亂狀態(tài)，經(jīng)氟西汀治療后，皮質(zhì)醇及IL-6 水平明顯降低。臨床研究發(fā)現(xiàn)氟西汀能夠降低重度抑郁患者血清皮質(zhì)醇水平，調(diào)節(jié)HPA 軸紊亂狀態(tài)，且多種抗抑郁藥物具有抗炎作用，可改善抑郁患者血清IL-6 升高狀況［16，17］。

圖6 各組小鼠腫瘤組織NF-κB 與VEGF 蛋白表達(×200)Fig.6 Expression of NF-κB and VEGF in the tumor tissue of mice in all groups (×200)

BDNF 在抑郁癥發(fā)病機制及治療過程中有著重要的作用，本實驗中模型組小鼠海馬BDNF mRNA表達與正常組比較明顯降低，經(jīng)氟西汀治療后雙藥組小鼠BDNF mRNA 表達較模型組和單藥組明顯升高，差異有顯著性。抑郁癥發(fā)病學(xué)說之一就是腦內(nèi)BDNF 的缺乏，而腦內(nèi)BDNF 水平升高可能會起到抗抑郁效果［18，19］。研究發(fā)現(xiàn)抑郁模型小鼠存在海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡伴BDNF 表達水平下降，而外源性BDNF 微量注入大鼠中腦、海馬和側(cè)腦室可有效緩解抑郁癥大鼠的類抑郁行為［20，21］。本實驗表明口服氟西汀能夠增強抑郁小鼠海馬組織BDNF mRNA表達，從而發(fā)揮其抗抑郁作用，而單純抗腫瘤治療則并無此作用。

單藥組及雙藥組小鼠皮下腫瘤重量、腫瘤組織NF-κB 及VEGF 表達與模型組比較明顯降低，雙藥組與單藥組比較有下降趨勢但差異無顯著性，表明氟西汀抗抑郁治療并未對腫瘤的發(fā)展起到明顯抑制作用。NF-κB 是一類普遍存在的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，研究發(fā)現(xiàn)其可通過多種細胞因子的轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮抗凋亡、促進細胞增殖、血管發(fā)生、腫瘤轉(zhuǎn)移的作用［22］。VEGF 是目前已知的作用最強的促血管形成因子之一，它可以通過促進血管生成從而參與肺癌浸潤與轉(zhuǎn)移。而NF-κB 與VEGF 有著密切的聯(lián)系，在腫瘤血管形成中NF-κB 起著核心作用，它通過上調(diào)VEGF 的表達促進腫瘤血管的形成［23］。而NF-κB與抑郁癥也有著密切的聯(lián)系，文獻報道慢性社交孤立導(dǎo)致的氧化或硝化應(yīng)激可能是通過激活NF-κB及增加誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶表達實現(xiàn)的，文獻報道大多數(shù)抗抑郁藥物有著抗炎效果［24，25］。本實驗設(shè)想NF-κB 可能為抑郁與腫瘤相互作用的交互點之一，是否氟西汀可以通過抑制NF-κB 產(chǎn)生抗炎效果從而對腫瘤有抑制作用，然而通過氟西汀與順鉑聯(lián)合治療與順鉑單藥治療進行對比，雙藥組與單藥組相比腫瘤重量及相關(guān)蛋白表達雖有一定的下降趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異。分析可能為抗抑郁藥物治療時間較短，并且抑郁可通過多途徑、多靶點促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移［7］。氟西汀為選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑，能夠增加突觸間隙5-羥色胺水平從而產(chǎn)生抑郁作用，而具體可能機理有增加海馬BDNF水平、促進神經(jīng)類固醇合成等［26］。

綜上所述，本研究未發(fā)現(xiàn)氟西汀對NF-κB 有明顯的抑制作用，因此可能并未起到對腫瘤抑制作用。但服用氟西汀小鼠抑郁相關(guān)指標(biāo)有明顯改善，因此臨床腫瘤伴抑郁病人服用氟西汀能夠起到抗抑郁改善生活質(zhì)量的目的。但抗抑郁藥物能否對腫瘤有抑制作用，還需更多基礎(chǔ)及臨床試驗進行驗證。

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