兒童與成人慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒Core基因區(qū)準種特征及正選擇壓力差異分析

鄧海君，黃勇,2，黃愛龍，龍泉鑫

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兒童與成人慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒Core基因區(qū)準種特征及正選擇壓力差異分析

鄧海君1，黃勇1,2，黃愛龍1，龍泉鑫1

1. 重慶醫(yī)科大學，感染性疾病分子生物學教育部重點實驗室，重慶渝中 400016；2. 重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院檢驗科，重慶渝中 400010

兒童與成人慢性乙型肝炎患者的臨床特征差異明顯。乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)病毒準種特征與其致病特性緊密相連，HBV病毒Core 基因區(qū)富含免疫表位，該區(qū)域的準種特征直接反映病毒變異與病毒應對宿主免疫壓力間的動態(tài)過程。文章通過擴增170名兒童慢性乙型肝炎患者及121名成人慢性乙型肝炎患者病毒Core基因區(qū)，按照病毒基因型以及病毒e抗原(Hepatitis B virus e antigen, HBeAg)狀態(tài)進行分組，使用序列復雜度、多樣性、非同義突變率(Non-synonymous substitution ratio，)、同義突變率(Synonymous substitution ratios ,)等指標衡量不同組別之間的病毒準種特征；使用不同模型計算不同組別中受到正選擇壓力的位點，進一步結(jié)合HBV Core基因區(qū)免疫表位信息，進行正選擇位點的定位分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兒童乙型肝炎病毒患者體內(nèi)病毒Core基因區(qū)序列復雜性和多樣性低于成人患者，且前者Core基因區(qū)正選擇位點個數(shù)顯著低于后者，這說明兒童慢性乙型肝炎患者體內(nèi)病毒受到的選擇壓力低于成人患者。在兒童及成人慢性感染病人組中，HBeAg陽性病人體內(nèi)病毒受到的選擇壓力低于HBeAg陰性病人。兒童及成人慢性感染患者體內(nèi)病毒存在13個正選擇位點，大多數(shù)正選擇位點位于已知的抗原表位上。本研究從分子進化角度揭示了兒童與成人慢性乙型肝炎病例體內(nèi)病毒Core基因區(qū)序列準種差異，為兩類病人顯著不同的臨床表征提供了群體遺傳學的解釋。

乙型肝炎病毒；Core基因區(qū)；兒童病例；正選擇壓力

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)感染仍然是一個重要的公共衛(wèi)生問題，全世界大約有3.5億人口感染HBV。HBV感染的臨床癥狀多樣，從無癥狀攜帶者、急慢性肝炎到肝纖維化、肝癌以及肝衰竭[1]，嚴重威脅人類健康。

乙型肝炎病毒是一個部分閉合的環(huán)狀雙鏈DNA病毒，但與其他DNA病毒顯著不同的是，HBV病毒在復制過程依賴逆轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生的前基因組RNA(Pregenomic RNA)完成，而逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏校正活性(Proof-reading capacity)，故病患體內(nèi)HBV病毒以一種異質(zhì)性的種群形式存在(Quasispecies)。眾多研究證實HBV準種特征與其藥物反應性[2,3]、疾病進程[4~6]等重要臨床特征緊密相關(guān)。特定病理階段病毒準種特征反映的是病毒對特定免疫壓力的適應。細胞毒性T淋巴細胞(Cytotoxic T lymphocytes, CTL)在宿主清除HBV感染中起主要作用[7]，而HBV Core 區(qū)域的表位(Epitope)是主要的CTL識別靶區(qū)域[8,9]，且之前的研究證實HBV Core基因區(qū)具有最高的堿基取代率(Substitution rates)[10]，故HBV Core區(qū)病毒準種特征可能是病毒對宿主免疫壓力適應情況的最直接反應。兒童慢性乙型肝炎感染患者與成人患者相比，大部分病例e抗原呈陽性狀態(tài)[11,12]，大部分病患處于以高的病毒滴度與正常的肝功能為特征的免疫耐受期[13]，且兒童慢性乙型肝炎患者具有更多的HBV特異性的T淋巴細胞[14]，這些特征提示兒童慢性乙型肝炎患者與成人患者體內(nèi)病毒準種特征可能存在較大差異。本研究收集了兒童慢性HBV感染患者及成人慢性HBV感染患者的血清標本，通過PCR擴增的方法獲得Core基因區(qū)序列，通過一系列分子進化手段獲得兩病人群體在Core基因區(qū)的準種差異，以期從群體遺傳學角度為不同慢乙肝感染的臨床表征提供解釋。

1 材料和方法

1.1 研究對象

隨機選取2011~2013年間在重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院、附屬第一醫(yī)院及附屬第二醫(yī)院就診的170例慢性HBV感染兒童患者及121例成人患者血清樣本作為研究對象。所有患者血清均為乙型肝炎病毒表面抗原陽性(Hepatitis B virus surface antigen, HBsAg)，乙型肝炎病毒表面抗體陰性(Hepatitis B virus surface antibody, HBsAb)，并經(jīng)血清學等檢查排除甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus, HAV)、丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)、丁型肝炎病毒(Hepatitis D virus, HDV)、戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus, HEV)及人免疫缺陷病毒(Human immunodefi-ciency virus, HIV)重疊感染。

1.2 巢氏PCR擴增HBV Core基因區(qū)

取200 μL患者血清，利用Qiagen公司的QIAamp DNA Blood Mini kit按照說明書要求提取血清中的病毒DNA。根據(jù)GenBank已公布的HBV基因組序列，針對Core基因區(qū)兩段保守區(qū)域設(shè)計兩對引物，分兩輪巢氏PCR擴增HBV Core基因，引物序列信息見表1。PCR擴展方法參考文獻[15]。

表1 HBV Core基因巢氏PCR擴增引物

1.3 HBV Core基因PCR產(chǎn)物測序、基因分型及比對分析

PCR擴增陽性產(chǎn)物由Invitrogen公司直接測序。臨床樣本測序結(jié)果采用NCBI Genotyping工具(http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi)進行基因分型。從GenBank中下載784條B基因型及1289條C基因型HBV全基因組序列，采用ClustalW軟件分別進行比對分析，計算B基因型及C基因型每個核苷酸位點的多樣性，以各位點比率最高的核苷酸作為該位點的一致性序列，采用ClustalW分析軟件，將臨床樣本測序結(jié)果分別與B、C基因型一致性序列進行比對和分析。

1.4 Core基因病毒準種復雜度分析

采用ClustalW軟件將每組中的核苷酸和氨基酸序列進行比對，使用MEGA 6軟件計算序列兩兩之間的核苷酸進化距離(Nucleotide distance)和氨基酸進化距離(Amino acid distance)。利用KaKs_Calcul-ator軟件，采用GMYN方法計算序列兩兩之間的非同義突變率(Non-synonymous substitution ratio,)、同義突變率(Synonymous substitution ratios,)和/。用香農(nóng)熵(Shannon entropy,)來評估位點復雜度。香農(nóng)熵計算公式如下：

其中，代表每個位點堿基種類，f代表堿基的頻率。

1.5 Core基因區(qū)正選擇位點分析

采用ClustalW軟件，將臨床樣本測序結(jié)果進行序列比對，利用MEGA 6軟件包中的Neighbor- Joining(NJ)方法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，采用Bootstrap方法，重復1000次，檢驗系統(tǒng)進化樹的可靠性。然后采用PAML軟件中的Codeml包進行正選擇位點分析，對每對模型之間的對數(shù)似然比(Log likelihood values, LLR)采用似然比檢驗法(Likelihood ratio test, LRT)進行假設(shè)檢驗(=2)，評估氨基酸位點是否受到正選擇壓力的作用。選擇M0、M1、M2、M7和M8等5種模型，其中M0用于評估Neighbor-Joining法構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹的分支長度，同時該長度作為其余模型使用的進化樹長度的初始值。使用兩對模型進行比較：M1 vs. M2和M7 vs. M8，其中，M2和M8檢測均使用貝葉斯方法檢測正選擇位點，選用貝葉斯經(jīng)驗檢驗(Bayes empirical Bayes, BEB)為正選擇位點鑒定的結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計學分析，連續(xù)性變量參數(shù)資料的比較采用Wilcoxon-Mann-Whitney檢驗。離散變量資料率的比較采用卡方檢驗或Fisher精確檢驗。定義< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 病例基本臨床信息

病人臨床信息如表2所示，共收集到兒童病例170例，成人病例121例。兒童病例Alanine transaminase, ALT)水平顯著低于成人病例(53.451± 63.714 vs. 105.967±96.242,<0.001)，病毒DNA水平高于成人病例(6.770±2.091 vs. 6.324±1.356,=0.001)，兒童病例顯著呈現(xiàn)免疫耐受狀態(tài)。兩組病人的e抗原構(gòu)成比并不具有統(tǒng)計學差異，從而避免患者e抗原狀態(tài)構(gòu)成比影響實驗結(jié)果。

表2 本研究所招募的慢性乙型肝炎病人臨床信息

2.2 兒童HBV慢性感染病例和成人HBV慢性感染病例Core基因區(qū)異質(zhì)性分析

比較兒童慢性乙型肝炎及成人慢性乙型肝炎患者體內(nèi)病毒Core基因區(qū)序列，發(fā)現(xiàn)兩組病人病毒序列的復雜度在該區(qū)域并無統(tǒng)計學差異(>0.05)。比較兩組病人序列多樣性，發(fā)現(xiàn)無論在核酸水平還是在蛋白水平，兒童組序列平均遺傳距離(Mean genetic distance)均小于成人組(<0.001)；兒童組序列的非同義突變也小于成人組非同義突變數(shù)值，而兩組病人的并不存在統(tǒng)計學差異，兒童組/也低于成人組，說明在選擇壓力沒有放松的情況下，成人組顯然受到了更強的正選擇壓力(表3)。

考慮到不同基因型病毒序列之間存在較大的差異，為了排除群體序列復雜度和多樣性的計算中因為基因型差異帶來的假陽性結(jié)果，本文按照基因型進行分組。同時，考慮到e抗原狀態(tài)是一個重要的HBV慢性感染患者臨床指標，且e抗原狀態(tài)與患者體內(nèi)病毒準種變遷密切相關(guān)，因此本文進一步按照病人e抗原狀態(tài)分組，比較不同e抗原狀態(tài)下成人慢性感染病例和兒童慢性感染病例體內(nèi)病毒進化差異?？梢钥闯?，在各分組病例中，成人病例病毒準種的、、核苷酸平均遺傳距離、氨基酸平均遺傳距離等數(shù)值都顯著高于兒童病例，只有基因B型e抗原陽性病例中，兒童與成人病例體內(nèi)病毒序列復雜度并不存在顯著差異(>0.05)。HBeAg陰性病例病毒Core基因相對于對應HBeAg陽性病例病毒Core基因承受了更高的選擇壓力。

2.3 不同病例群體體內(nèi)病毒Core基因區(qū)正選擇位點統(tǒng)計

各組中正選擇位點檢測結(jié)果見表4。似然比檢測分析發(fā)現(xiàn)，對于B基因型患者，兒童組e抗原陽性患者中，正選擇模型M2與接近中性模型M1進行比較，LRT值在=2水平不顯著，且未發(fā)現(xiàn)有正選擇位點；M8(β和ω)模型與M7(β)模型比較，LRT在df=2水平同樣不顯著，沒有發(fā)現(xiàn)正選擇位點。在B基因型患者中，兒童e抗原陰性患者和成人e抗原陰性患者M2 vs. M1和M8 vs. M7比較LRT均差異顯著，分別檢測出8個和5個正選擇位點。成人e抗原陽性B基因型型患者中，M2 vs. M1和M8 vs. M7比較LRT差異不顯著，但M8模型仍檢測出4個正選擇位點(P5、P130、P135和G153)。在C基因型患者中，兒童e抗原陰性患者M2 vs. M1和M8 vs. M7的LRT檢驗均差異不顯著，且未發(fā)現(xiàn)正選擇位點；兒童e抗原陽性患者M2 vs. M1和M8 vs. M7的LRT檢驗也差異不顯著，未檢測到正選擇位點。在成人C基因型患者中，e抗原陽性患者的M2 vs. M1和M8 vs. M7比較LRT檢測不顯著，但檢測到P130一個正選擇位點；成人e抗原陰性C基因型患者組M2 vs. M1和M8 vs. M7比較LRT檢驗差異顯著，檢測到4個正選擇位點(L84、P130、Q151和S155)。對所有正選擇位點在各組中的頻率分析發(fā)現(xiàn)，正選擇位點的突變頻率都較高(圖1)。

表3 兒童及成人患者體內(nèi)病毒Core基因區(qū)準種復雜度及多樣性比較

注：*：<0.05；**：<0.01；***：<0.001。

在同一基因型病例中，e抗原陰性患者群體中正選擇位點數(shù)明顯多于e抗原陽性患者群體；除基因B型e抗原陰性患者群體外，其他3類患者群體中，成人病例中檢出的正選擇位點個數(shù)高于兒童病例。這提示e抗原陰性狀態(tài)以及較高年齡患者體內(nèi)HBV Core基因區(qū)承受了更高的選擇壓力。

按照病毒基因型，將不同患者群體正選擇位點進行“交匯”分析，結(jié)果如圖2所示。對于基因B型病毒序列而言，P135位點作為一個在e抗原陽性成人患者、e抗原陰性成人患者以及e抗原陰性兒童患者中都存在的正選擇位點，可能是一個重要的宿主免疫識別位點。

圖1 不同組別病人體內(nèi)HBV病毒Core基因正選擇位點突變頻率展示

圖中橫坐標各點表示本研究中篩選得到的正選擇位點，陰影方框表示該位點在特定組別病人中被確定為正選擇位點，且陰影深度表示該位點突變率，顏色越深，表示該位點突變率越高。

2.4 不同病人群體體內(nèi)HBV Core基因區(qū)正選擇位點免疫表位特性分析

對各病例群體的承受正選擇位點的氨基酸進行免疫表位的分析，結(jié)果見表5，免疫表位信息根據(jù)文獻來確認[16,17]。與文獻報道的確定HBV Core基因區(qū)免疫表位進行對比，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)正選擇位點都位于相應的免疫表位中。在B基因型乙型肝炎病毒感染樣本中，共篩選得到10個正選擇位點，其中6個位點位于已知抗原表位區(qū)段，2個位點(S49和I97)與已知抗原表位鄰接。在C基因型樣本中，共篩選得到4個正選擇位點，其中3個位點位于已知抗原表位區(qū)段。在各病例群體中篩選得到的正選擇位點，均超過60%的位點處于已驗證免疫表位之中，再次證明這些正選擇位點所受的選擇壓力往往是來自宿主免疫系統(tǒng)。

圖2 不同基因型HBV病毒正選擇位點“交匯”分析

A：B基因型正選擇位點；B：C基因型正選擇位點。

3 討 論

兒童慢性乙型肝炎患者在臨床表征上與成人慢性乙型肝炎患者區(qū)別較大區(qū)別，本文對兩患者群體體內(nèi)病毒基因組Core基因區(qū)的準種特征進行描述，并使用基于密碼子的最大似然法分析了該基因區(qū)的正選擇壓力。研究結(jié)果揭示兒童與成人患者在Core基因區(qū)的準種特征存在顯著差異，兩群體的該區(qū)域序列具有顯著不同的多樣性：成人患者群體序列多樣性顯著高于兒童患者群體。病毒的遺傳多樣性主要是受宿主免疫系統(tǒng)選擇壓力和病毒群體規(guī)模影響[18,19]。即使在兒童組病毒群體規(guī)模高于成人病例(入組的兒童患者數(shù)多于成人患者數(shù)，且兒童病毒載量高于成人組病毒載量)，通過計算得到的Core區(qū)域序列多樣性仍然是成人患者組高于兒童患者組，這充分證明了成人慢性乙型肝炎患者經(jīng)受了更高的免疫選擇壓力。強免疫壓力環(huán)境下病毒準種呈現(xiàn)高的復雜度與多樣性在急性肝衰竭病人(Acute-on-chronic liver failure, ACLF)與普通慢性乙型肝炎患者比較研究中也有發(fā)現(xiàn)。

表5 不同組別慢乙肝感染病例體內(nèi)病毒Core基因區(qū)正選擇位點免疫表位特性分析

注：“總計”表示特定病人群中位于免疫表位的正選擇位點個數(shù)，位于不同免疫表位的同一個正選擇位點只計算一次；百分比表示特定病人群中位于免疫表位的正選擇位點的百分比。

不同基因型病毒序列擁有不同的正選擇位點?；駼型和基因C型病毒Core基因區(qū)分別具有10個和4個正選擇位點。只有少數(shù)位點在兩種不同基因型乙型肝炎病毒都被正選擇壓力篩選,可能與乙型肝炎病毒流行所呈現(xiàn)的地域特性有關(guān)，這與之前文獻報道一致[20]。

本文進一步將各組患者人Core基因區(qū)正選擇位點進行分析，成人e抗原陰性患者Core基因區(qū)存在顯著多的正選擇位點(M2模型)。這說明兒童患者體內(nèi)病毒Core基因區(qū)域更多的處于中性進化(Natural evolution)，而成人患者體內(nèi)病毒該區(qū)域則更多的受正選擇壓力的影響，再次證明成人患者體內(nèi)病毒受更大的免疫選擇壓力影響。更為重要的是，大多數(shù)的這些正選擇位點都位于HLA-限制性表位之中，可能導致相關(guān)表位與對應HLA分子結(jié)合力下降。這些處于表位中的正選擇位點的存在，可能對于病毒逃逸宿主免疫監(jiān)視(Immune surveillance)，保持自身存活非常重要。另外一種解釋是，HLA限制表位發(fā)生突變后，會打破免疫耐受，促使發(fā)生T 淋巴細胞介導的組織免疫損傷。這也部分解釋兒童往往處于免疫耐受階段，即以高的病毒DNA滴度和正常的肝功能水平為體現(xiàn)，而成人處于免疫激活階段(通常具有肝功能損傷表現(xiàn))。另外，在e抗原陰性患者中篩選得到的正選擇位點顯著高于e抗原陽性患者。類似的現(xiàn)象在之前的縱向研究中也有報道[21]，推測可能是因為HBeAg血清學轉(zhuǎn)換前后CD8+ T細胞被激活后引起的選擇壓力增強[22]。這些正選擇位點的出現(xiàn)往往影響HBV相關(guān)表位肽與HLA分子結(jié)合進而引起T細胞識別位點發(fā)生改變[23]。此外，在P135位點在多組B基因型病毒感染患者群中被確定為正選擇位點，提示該位點可能對于宿主免疫識別的重要作用。有文獻顯示，P135所在PPAY結(jié)構(gòu)域的突變可能導致新生HBV核衣殼的裝配出現(xiàn)障礙[24]。

通過使用分子進化手段，本文首次從群體遺傳的角度闡述了兒童慢性乙型肝炎患者與成人慢性乙型肝炎患者在病毒Core基因區(qū)的差異，結(jié)果證實成人慢性乙型肝炎病患經(jīng)受了更高的免疫選擇壓力；成人患者群體體內(nèi)病毒受宿主免疫壓力篩選，獲得了更多的位于表位中的正選擇位點，一方面有利于病毒逃避宿主免疫監(jiān)視，獲得更多存活機會，另一方面也可能會打破免疫耐受，發(fā)生肝臟組織免疫損傷。

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(責任編委: 岑山)

Distinct quasispecies characteristics and positive selection within the core gene in chronic hepatitis B virus infected child and adult patients

Haijun Deng1, Yong Huang1,2, Ailong Huang1, Quanxin Long1

There are significant differences in clinical characteristics between chronic hepatitis B virus infected (CHB) child and adult patients. Viral quasispecies characteristics are associated with its pathogenic properties. For hepatitis B virus (HBV), its core region is the main immune recognition region for its enriched epitopes. In our study, we discuss the quasispecies characteristics and positive selection within core gene within chronic HBV infected child and adult patients. By analyzing 170 core gene sequences from child CHB patients and 121 core genes sequences from adult CHB patients, quasispecies characteristics were described by sequence complexity, diversity, non-synonymous substitution ratio () and synonymous substitution ratios (). In addition, positive selection sites were also determined by bioinformatics tools. Then, all these parameters were compared between child and adult CHB patient groups. Compared with child patients, adult patients with CHB showed distinct quasispecies characteristics within the core region, had a higher sequence complexity and diversity and more positive selection sites, suggesting that the adult CHB patients had a higher immune selection pressure on the HBV core gene. Reduced selection pressure on the HBV core gene in hepatitis B e antigen (HBeAg)-positive CHB patients than HBeAg negative CHB patients were observed in both adult and child patient groups. The majority of the screened positive selection sites lay within human leukocyte antigens (HLA)-restricted epitopes. In conclusion, this study analyzed the quasispecies characteristics discrepancy between child and adult patients with CHB, and revealed the possible reason for the distinct clinical characteristics in the perspective of population genetics.

hepatitis B virus; core region; child patients; positive selection

2015-02-02;

2015-03-20

十二五國家傳染病重大專項(編號：2013ZX10002002)和重慶市科委基礎(chǔ)與前沿研究計劃(編號：cstc2013jcyjC10002)資助

鄧海君，碩士研究生，專業(yè)方向：乙型肝炎病毒準種特征分析。E-mail: 164943607@qq.com

龍泉鑫，助理研究員，研究方向：乙型肝炎病毒準種特征分析。E-mail: longquanxin@gmail.com

10.16288/j.yczz.15-060

2015-4-13 9:26:01

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20150413.0926.001.html