異源轉(zhuǎn)氫酶NNT對(duì)釀酒酵母木糖代謝的影響

楊 柯，張國(guó)暢，陳 洵

(天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072)

近20年，生物乙醇作為最有前途的新能源之一受到廣泛關(guān)注，若能有效利用纖維素中的木糖生產(chǎn)乙醇，可至少降低25%的成本［1］。野生型釀酒酵母不利用木糖，通過導(dǎo)入畢赤酵母 XYL1、XYL2基因，構(gòu)建能利用木糖的重組釀酒酵母菌株。XYL1和XYL2基因分別編碼木糖還原酶(XR)和木糖醇脫氫酶(XDH)，XR還原木糖生成木糖醇，木糖醇又被XDH氧化生成木酮糖［2］，最后木酮糖被木酮糖激酶(XKS)磷酸化為5-磷酸木酮糖，進(jìn)入 PPP途徑進(jìn)行代謝。其中XR和XDH分別偏好輔酶NADPH和NAD+［3-6］，導(dǎo)致輔酶不平衡和副產(chǎn)物的積累，所以木糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇的效率很低。

已經(jīng)有很多措施被開發(fā)來改善釀酒酵母木糖代謝性能:在重組釀酒酵母中過表達(dá)PPP途徑中的4個(gè)關(guān)鍵酶 TAL1，TKL1，RPE1，RKI1，使木糖利用速率和乙醇產(chǎn)率得到提高，說明PPP途徑關(guān)鍵酶的高活性對(duì)木糖高效發(fā)酵是必需的［7-8］;通過定點(diǎn)誘變技術(shù)改變XR或XDH的輔酶偏好性來提高乙醇產(chǎn)率:XR的K270M點(diǎn)突變和K270R點(diǎn)突變，使XR對(duì)NADPH的Km值分別提高17倍和25倍，發(fā)酵結(jié)果顯示突變釀酒酵母菌株的木糖消耗速率和乙醇產(chǎn)率均提高，且木糖醇產(chǎn)率下降［9-10］，也有研究發(fā)現(xiàn)增加 XDH對(duì) NADP+的親和力，同樣提高乙醇產(chǎn)率［11-12］;也可以在釀酒酵母中導(dǎo)入不依賴輔酶的木糖異構(gòu)酶XI替代XR-XDH系統(tǒng)代謝木糖，能直接解決輔酶專一性不同的問題，但是XI在釀酒酵母中的活性較低，不能達(dá)到木糖的高效發(fā)酵需要［13］。

重組釀酒酵母木糖代謝過程中XR和XDH酶分別偏好輔酶NADPH和NAD+，但是由于釀酒酵母不含有轉(zhuǎn)氫酶，不能實(shí)現(xiàn)輔酶NADPH和 NADH之間的直接轉(zhuǎn)化。因此，本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)造性的將黑曲霉的轉(zhuǎn)氫酶基因NNT導(dǎo)入到重組釀酒酵母中，觀察轉(zhuǎn)氫酶NNT在釀酒酵母細(xì)胞中的定位和微好氧條件下對(duì)重組釀酒酵母木糖發(fā)酵的影響。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

釀酒酵母在30℃培養(yǎng)，用YPDA培養(yǎng)基，酵母轉(zhuǎn)化子用YSCD(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%葡萄糖)營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)化子的發(fā)酵在40 m L YSCX(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%木糖)的100 m L的搖瓶中進(jìn)行搖床發(fā)酵。E.coli DH5α和重組質(zhì)粒在LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)(根據(jù)條件可加入50 mg/L氨芐)，培養(yǎng)溫度是37℃。

1.2 基因的克隆和載體的構(gòu)建

轉(zhuǎn)氫酶在細(xì)胞有2種形式:分別為膜定位轉(zhuǎn)氫酶和可溶性轉(zhuǎn)氫酶［1，14］，本實(shí)驗(yàn)首先需確定 NNT蛋白在釀酒酵母細(xì)胞中的定位。POS5定位于線粒體中［15］，mRuby是紅色熒光蛋白，將 POS5 蛋白和mRuby偶聯(lián)可確定發(fā)紅色熒光的區(qū)域位于線粒體中，因此構(gòu)建重組質(zhì)粒 Y22-POS5-mRuby-CYCT;GFP是綠色熒光蛋白，若將GFP與NNT相偶聯(lián)則發(fā)綠光的區(qū)域是NNT蛋白的表達(dá)區(qū)域，所以需構(gòu)建質(zhì)粒 Y33-NNT-GFP-CYCT。

重組質(zhì)粒Y22-POS5-mRuby-CYCT的構(gòu)建過程包含3步克隆:將本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的質(zhì)粒Dev-clonemRuby與Y33-3*ha-CYCT同時(shí)用限制性內(nèi)切酶Sal1+Xbal1雙酶切，再將前者mRuby片段的686 bp與后者6 032 bp片段相連，得到質(zhì)粒 Y33-mRuby-CYCT;然后將上述質(zhì)粒再與質(zhì)粒YCplac22用限制性內(nèi)切酶 Pst1+Hin dⅢ雙酶切，分別取片段1 106 bp和 4 838 bp，連接構(gòu)建重組質(zhì)粒 Y22-mRuby-CYCT;最后以W 303酵母菌染色體為模板，POS5-U和POS5-D為引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增出的POS5基因片段與質(zhì)粒Y22-mRuby-CYCT用Sac1+Pst1雙酶切，連接構(gòu)建重組質(zhì)粒Y22-POS5-mRuby-CYCT。

重組質(zhì)粒Y33-NNT-GFP-CYCT的構(gòu)建過程:由生物公司合成NNT基因的載體質(zhì)粒PMD18-T-Simp le-NNT并與質(zhì)粒 pPGK1-noxE［16］用 Sal1+Bam H1雙酶切，2個(gè)質(zhì)粒分別取3 267 bp和6 559 bp片段連接構(gòu)建重組質(zhì)粒Y33-pPGK1-NNT，并進(jìn)行序列測(cè)定(引物為 Test-U和 Test-D);然后以 Y33-pPGK1-NNT質(zhì)粒為模板，PGK1p-U/NNT-D為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到片段 pPGK1-NNT，再與質(zhì)粒 YC-plac33-GFP-CYCT同時(shí)用 Sph1+Bam H1雙酶切，連接得到重組質(zhì)粒Y33-NNT-GFP-CYCT。

轉(zhuǎn)氫酶基因 NNT分別用啟動(dòng)子 pPGK1、pCCW 12、pHXT7過表達(dá)構(gòu)建木糖發(fā)酵的重組質(zhì)粒。質(zhì)粒Y33-pPGK1-NNT的構(gòu)建如上文所述，構(gòu)建重組質(zhì)粒 Y33-pCCW 12-NNT和 Y33-pCCW12-NNT的過程如下:以菌株KAM-6X的染色體DNA為模板，分別以pCCW 12-U/pCCW 12-D和pHXT7-U/pHXT7-D為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)得到pCCW12和pHXT7基因片段，再分別與質(zhì)粒Y33-pPGK1-NNT用Pst1+Sal1進(jìn)行雙酶切，替換 pPGK1片段，分別得到重組質(zhì)粒 Y33-pCCW 12-NNT和 Y33-pHXT7-NNT(質(zhì)?；蛐秃鸵镄蛄幸姳?和表2)。

表1 實(shí)驗(yàn)所用的質(zhì)粒Table1 Plasm id used in this study

表2 實(shí)驗(yàn)所用的引物Table 2 Prim ers used in this study

1.3 轉(zhuǎn)氫酶NNT在酵母細(xì)胞的定位實(shí)驗(yàn)

將重組質(zhì)粒Y22-POS5-mRuby-CYCT與Y33-NNT-GFP-CYCT共同轉(zhuǎn)化到釀酒酵母W303中，長(zhǎng)出的單菌落接種到Y(jié)SCD(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%葡萄糖)液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)活化細(xì)胞，再取適量菌液轉(zhuǎn)接到上述液體培養(yǎng)基中，到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，收集適量菌體離心并將菌體用無菌水進(jìn)行清洗，然后將菌液滴在載玻片上并在蓋玻片上滴1滴香柏油，放置在熒光顯微鏡下觀察共轉(zhuǎn)化酵母菌的熒光圖像。

1.4 重組質(zhì)粒的酵母轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的木糖發(fā)酵和色譜測(cè)定

將重組質(zhì)粒 Y33-pPGK1-NNT、Y33-pCCW 12-NNT、Y33-pHXT7-NNT與對(duì)照空質(zhì)粒 YCPlac33轉(zhuǎn)化到重組酵母KAM-6X［18］中，得到的轉(zhuǎn)化子分別被命名為 K6X(pPGK1-NNT)、K6X(pCCW 12-NNT)、K6X(pHXT7-NNT)和 K6X(Y33)(表 3)。

表3 實(shí)驗(yàn)所用釀酒酵母菌株基因型Table 3 The genotype of recom binant S.cerevisiae

以上轉(zhuǎn)化子在40 m L YSCX(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%木糖)液體培養(yǎng)基中進(jìn)行微好氧發(fā)酵。初始 OD為1左右，發(fā)酵初期，三角瓶用無菌錫箔紙封口進(jìn)行有氧發(fā)酵繁殖細(xì)胞，轉(zhuǎn)速220 r/min。菌體生長(zhǎng)到OD為10左右時(shí)，將三角瓶用封口膜進(jìn)行封口且用0.5 mm針頭在膜上扎一個(gè)微孔，進(jìn)行微好氧發(fā)酵，轉(zhuǎn)速110 r/min，每24 h取樣并測(cè)定 OD600的值。將樣品離心取上清用0.2μm濾膜進(jìn)行過濾并按順序放置于樣品瓶中進(jìn)行HPLC(高效液相色譜)檢測(cè)，所用色譜儀是Water Alliance 2695，流動(dòng)相為5 mM H2SO4，流速 0.6 m L/min，柱溫 45 ℃。

1.5 PT-PCR測(cè)定不同啟動(dòng)子的表達(dá)強(qiáng)度

本實(shí)驗(yàn)中NNT基因分別用pPGK1、pCCW 12和pHXY7啟動(dòng)子進(jìn)行表達(dá)，通過RT-PCR測(cè)定不同啟動(dòng)子的表達(dá)強(qiáng)度。具體過程如下:重組釀酒酵母菌株 K6X(NNT)、K6X(pCCW 12-NNT)、K6X(pHXT7-NNT)在YSCX(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%木糖)液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液(約20個(gè) OD)，然后用柱式真菌RNA out試劑盒(北京天恩澤基因科技有限公司)提取RNA。將提取的RNA抽取部分用無菌水稀釋60～100倍，利用分光光度計(jì)測(cè)定 OD260的值，按1OD260(RNA)=40μg/m L計(jì)算，再乘以稀釋倍數(shù)可得出RNA的濃度，cDNA第一鏈的反轉(zhuǎn)錄用羅氏 Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行，RT-PCR反應(yīng)用羅氏480 Real-Time PCR system，熒光染料為羅氏480 SYBR Green I，每株菌反轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度的測(cè)定都要有actin對(duì)照。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 NNT蛋白在釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)的定位結(jié)果

將重組質(zhì)粒Y22-POS5-mRuby-CYCT與Y33-NNT-GFP-CYCT共同轉(zhuǎn)化到釀酒酵母W303中，在熒光顯微鏡(OLYMPUS BX51)下觀察共轉(zhuǎn)化酵母的熒光情況。先將熒光顯微鏡的濾光片調(diào)在B檔(激發(fā)光為藍(lán)光)，觀察到酵母細(xì)胞發(fā)綠色熒光。之后保持載玻片不動(dòng)，再將濾光片調(diào)到G檔(激發(fā)光為綠光)，觀察酵母細(xì)胞發(fā)出紅色熒光。將兩張熒光照片擬合重疊得到圖1。顯示:偶聯(lián)有 NNT和GFP的重組釀酒酵母發(fā)出的綠色熒光沒有充斥在整個(gè)細(xì)胞質(zhì)中，而是和偶聯(lián)有POS5和 mRuby蛋白的重組酵母發(fā)出的紅色熒光區(qū)域重疊。由于POS5蛋白定位于粒體中［15］，所以轉(zhuǎn)氫酶 NNT和 POS5蛋白一樣也定位于線粒體中。

圖1 質(zhì)粒Y22-POS5-m Ruby-CYCT與Y33-NNT-GFP-CYCT共轉(zhuǎn)化酵母的熒光圖片F(xiàn)ig.1 The fluorescence p icture of co-transform ation yeast w ith p lasm id Y22-POS5-m Ruby-CYCT and Y33-NNT-GFP-CYCT

2.2 RT-PCT測(cè)定不同啟動(dòng)子的表達(dá)結(jié)果

RT-PCR測(cè)定結(jié)果顯示如圖2。在木糖發(fā)酵條件下，表達(dá)NNT基因的啟動(dòng)子pPGK1的表達(dá)強(qiáng)度最低，pCCW 12啟動(dòng)子表達(dá)強(qiáng)度最高，pHXT7表達(dá)強(qiáng)度稍低于pCCW12。

圖2 表達(dá)NNT基因的啟動(dòng)子pPGK 1、pCCW 12和pHXT7在木糖中的強(qiáng)度Fig.2 The transcriptional level of prom oters expressing NNT gene in m edium containing xylose

圖3 重組釀酒酵母的木糖發(fā)酵Fig.3 Xylose ferm en tation of recom binant S.cerevisiae

2.3 重組釀酒酵母的木糖發(fā)酵結(jié)果

重組轉(zhuǎn)化子 K6X(pPGK1-NNT)，K6X(pCCW 12-NNT)，K6X(pHXT7-NNT)和對(duì)照 K6X(Y33)的微好氧木糖發(fā)酵結(jié)果如下:菌株K6X(pCCW12-NNT)和K6X(pHXT7-NNT)與對(duì)照相比木糖消耗速率和生長(zhǎng)速率都降低［圖3a)和圖3e)］，乙醇產(chǎn)量也降低［圖3c)］，但是木糖醇和甘油的產(chǎn)量有明顯下降［圖3b)和圖3d)］;表 4顯示 K6X(pCCW12-NNT)和 K6X(pHXT7-NNT)的木糖醇產(chǎn)率比對(duì)照分別降低86.3%和49.3%，乙醇產(chǎn)率分別提高16.7%和12.7%。

表4 木糖發(fā)酵的乙醇終濃度和代謝產(chǎn)率Table 4 Final ethanol concentration and results of xylose ferm en tation

重組轉(zhuǎn)化子K6X(pPGK1-NNT)的木糖消耗速率、生長(zhǎng)速率和乙醇產(chǎn)量與對(duì)照相似，木糖醇沒有明顯降低，但是甘油產(chǎn)量明顯下降其產(chǎn)率降低了27.58%，同時(shí)乙醇產(chǎn)率提高6.6%，乙醇終濃度達(dá)到了13.82 g/L。

以上發(fā)酵結(jié)果顯示:1)NNT基因?qū)胫亟M釀酒酵母中使甘油的產(chǎn)量下降，說明在轉(zhuǎn)氫酶NNT的作用下NADH的產(chǎn)生降低，而甘油的形成需要消耗NADH因此甘油產(chǎn)量下降［20］;2)在 K6X(pCCW 12-NNT)和K6X(pHXT7-NNT)中木糖醇產(chǎn)量和產(chǎn)率都有明顯下降，說明NNT基因在酵母細(xì)胞內(nèi)催化輔酶NADH和NADPH之間的相互轉(zhuǎn)化，改善了木糖代謝的輔酶不平衡，降低了副產(chǎn)物木糖醇的產(chǎn)量［21］，但是在菌株 K6X(pPGK1-NNT)中木糖醇降低并不明顯，這可能是由于啟動(dòng)子pPGK1的表達(dá)強(qiáng)度過低;3)表達(dá)有NNT基因的重組釀酒酵母，雖然乙醇產(chǎn)量沒有明顯提高但是乙醇產(chǎn)率提高，副產(chǎn)物木糖醇和甘油的降低使更多的碳源流向乙醇，提高了乙醇轉(zhuǎn)化率。

3 結(jié)論

為了實(shí)現(xiàn)木碳代謝過程中輔酶NADH和NADPH之間的相互轉(zhuǎn)化，本實(shí)驗(yàn)在重組釀酒酵母中創(chuàng)造性的導(dǎo)入了黑曲霉的轉(zhuǎn)氫酶基因NNT。首先，通過共轉(zhuǎn)化釀酒酵母的熒光實(shí)驗(yàn)得到:NNT蛋白和POS5一樣定位于線粒體中。然后，NNT基因分別用啟動(dòng)子 pPGK1、pCCW 12和 pHXT7來表達(dá)，其表達(dá)強(qiáng)度為:pCCW12＞pHXT7》pPGK1;最后在微好氧的木糖發(fā)酵結(jié)果顯示:黑曲霉NNT基因的導(dǎo)入使木糖發(fā)酵的甘油和木糖醇產(chǎn)量降低，同時(shí)乙醇產(chǎn)率提高;尤其在使用強(qiáng)啟動(dòng)子pCCW 12和pHXT7過表達(dá)NNT基因的重組酵母菌株中，木糖醇產(chǎn)率明顯降低，說明了NNT基因高效表達(dá)能改善木糖代謝的輔酶不平衡;同時(shí)甘油產(chǎn)生的減少也說明在NNT基因作用下輔酶NADH的產(chǎn)生降低。

由于轉(zhuǎn)氫酶存在兩種形式:一種是膜定位的轉(zhuǎn)氫酶，需消耗 ATP，催化從 NADH到 NADPH的反應(yīng)［22-23］;另一種是可溶性轉(zhuǎn)氫酶，催化方向與上述反應(yīng)相反同時(shí)不需能量［1，14］。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推測(cè):NNT可能膜定位轉(zhuǎn)氫酶，催化從NADH到NADPH的反應(yīng)，依賴ATP，其反應(yīng)機(jī)理可能是質(zhì)子泵驅(qū)動(dòng)的類型(AB型)［14，24］。但是表達(dá)有 NNT基因的重組酵母菌株的木糖消耗速率和生長(zhǎng)速率均降低，其原因可能是:轉(zhuǎn)氫酶NNT在酵母細(xì)胞內(nèi)的活性比較低和NADH轉(zhuǎn)化生成NADPH導(dǎo)致了NAD+的缺乏，從而限制了木糖醇脫氫酶XDH催化的反應(yīng)。

在未來研究中，我們希望能進(jìn)一步了解轉(zhuǎn)氫酶NNT在重組酵母細(xì)胞內(nèi)的代謝機(jī)理，還可以利用蛋白工程方法提高 NNT的酶活或者適當(dāng)調(diào)整 XR、XDH和NNT的酶活比例，來提高釀酒酵母的木糖代謝能力和生長(zhǎng)速率。

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