殼聚糖-端羧基聚酰胺胺接枝物的合成與性能

張曉洋，趙 峻，姚芳蓮

(天津大學(xué)化工學(xué)院教育部生物工程系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300072)

殼聚糖(CS)是自然界唯一的堿性天然多糖，是由 β-(1→4)-2-氨基-2-脫氧-D-吡喃葡萄糖(GlcN)和 β-(1→4)-2-乙酰氨基-2-脫氧-D-吡喃葡萄糖(GlcNAc)重復(fù)單元組成的線型共聚物，化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)與纖維素相似。由于具備來源豐富、良好的生物相容性、低免疫原性、抗腫瘤性等生物活性，CS被廣泛用于藥物釋放和基因轉(zhuǎn)染領(lǐng)域［1］。然而，CS的低水溶性限制了它的使用［2］。改性后的水溶性 CS則可以增強(qiáng)CS在水中的穩(wěn)定性，同時(shí)減小了藥物緩釋載體和基因轉(zhuǎn)染過程中由于內(nèi)涵體酸化可能帶來的細(xì)胞毒性。

以乙二胺為核的聚酰胺胺樹枝狀大分子(PAM-AM)是一類新型的高支化大分子，具有納米級(jí)分子尺寸、結(jié)構(gòu)和尺寸可控、以及低分散性等獨(dú)特性能［3-4］。PAMAM內(nèi)部還有空穴以及表層有眾多功能性端基。因此，PAMAM可以用作低水溶性藥物的增溶劑和生物活性物質(zhì)的輸送載體［5-6］。但是樹枝狀大分子通常具有代數(shù)依賴性的細(xì)胞毒性，即代數(shù)越高，毒性越強(qiáng)［7］。將生物相容性好的天然高分子引入低代數(shù)PAMAM是降低其細(xì)胞毒性的一種理想手段［8］。

本研究目的是制備以CS和PAMAM為原料的接枝物，合成的接枝物具備自組裝成為核殼結(jié)構(gòu)納米粒的能力。這種新型的核殼結(jié)構(gòu)納米顆?？梢宰鳛樗幬锛{米載體，對(duì)生物活性分子進(jìn)行包覆以及釋放，可能在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有潛在的應(yīng)用前景。端羧基PAMAM對(duì)CS進(jìn)行接枝改性的合成路線為:

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料

殼聚糖(CS)，相對(duì)分子質(zhì)量20萬，脫乙酰度85%，青島海匯生物制品有限公司;EDC，分析純;NHS，分析純;上海吉爾生化有限公司;乙二胺(EDA)，除水后使用;丙烯酸甲酯(MA)，除水后使用;HCl，質(zhì)量分?jǐn)?shù)36% ～38%;甲醇，分析純;天津市江天化工技術(shù)有限公司;實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 CS-g-PAM AM的合成

本實(shí)驗(yàn)是以乙二胺和丙烯酸甲酯為原料，合成端酯基PAMAM樹枝狀分子，然后對(duì)其末端的酯基進(jìn)行水解反應(yīng)制得端羧基的PAMAM，最終通過CS與端羧基PAMAM之間的酰胺化反應(yīng)得到目標(biāo)產(chǎn)物CS-g-PAMAM。

1.2.1 端酯基PAM AM的合成

在0℃冰水浴，氮?dú)獗Ｗo(hù)，攪拌條件下，將91.2 g丙烯酸甲酯(1.06 mol)與 7.92 g乙二胺(0.132 mol)相互混合，攪拌10 min后，緩慢滴入125 m L無水甲醇。之后，將溫度升高至35℃，避光攪拌反應(yīng)21 h。反應(yīng)結(jié)束后，于50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去未反應(yīng)的丙烯酸甲酯與甲醇，得到端酯基PAMAM。

1.2.2 端羧基PAM AM的合成

稱取1.616 g端酯基PAMAM溶于50 m L超純水中，小心地滴加濃 HCl調(diào)節(jié) pH值至2.0，室溫下攪拌反應(yīng)3 d，反應(yīng)結(jié)束后，旋蒸除去多余水分，至淡黃色黏稠液體，然后加入5 mL超純水，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用三氯甲烷萃取提純，凍干即得端羧基PAMAM。

1.2.3 CS-g-PAM AM的合成

按照表1中的數(shù)據(jù)(表1中投料比為端羧基PAMAM分子與CS上的氨基的物質(zhì)的量之比)，分別稱量6種質(zhì)量的端羧基 PAMAM，EDC，NHS，都加入200 mg CS，再溶于100 m L超純水中。使用鹽酸調(diào)節(jié)溶液至pH值為3.7，在35℃水浴中攪拌3 d，然后對(duì)產(chǎn)物混合液透析3 d，透析完畢之后凍干即得不同投料比的CS-g-PAMAM。

表1 不同投料比CS-g-PAM AM的合成結(jié)果Table 1 The synthesis resu lts of CS-g-PAM AM at d ifferen t feeding ratios

2 結(jié)果與討論

2.1 核磁共振譜圖分析

如圖1為端酯基 PAMAM，端羧基 PAMAM和CS-g-PAMAM的核磁共振譜圖。

圖1 核磁共振譜圖Fig.1 1 H NMR spectra

由圖 1a)可見，CH2N(a)，NCH2(b)，NCH2CH2(c)和 CH2COOCH3(d)的化學(xué)位移分別是 3.66，2.80，2.53和 3.63，其中 4種氫的峰面積之比為:Sa∶Sb∶Sc∶Sd=1.00∶2.12∶2.06∶3.18≈1∶2∶2∶3，所有氫原子的數(shù)目與理論結(jié)構(gòu)幾乎一致。由圖1b)可見，CH2N(a)，NCH2(b)，NCH2CH2(c)和 CH2COOH(d)的化學(xué)位移分別為 3.74，2.88，3.48和 4.70，這些峰的位置和以前的研究結(jié)果［9］一致。水解后由于氫鍵效應(yīng)和溶劑效應(yīng)的影響，化學(xué)位移向高場(chǎng)移動(dòng)。在4.68處出現(xiàn)強(qiáng)峰，這是由于溶劑D2O中的D與COOH中的H發(fā)生活潑氫的快速交換作用［9］，羧酸氫在9～13范圍內(nèi)的氫峰被覆蓋，而生成的HOD中的質(zhì)子在化學(xué)位移為4.7左右出現(xiàn)信號(hào)峰，由此可知，端羧基PAMAM合成成功。

如圖1c)所示，CS-g-PAMAM接枝物與端羧基PAMAM相比較［圖2b)］，在化學(xué)位移3.84～3.40，2.90和1.80處分別出現(xiàn)了新峰，它們分別歸屬于CS結(jié)構(gòu)單元上的H-34，5，6，H-2和乙酰基團(tuán)產(chǎn)生的質(zhì)子峰，這些峰的位置和以前的研究結(jié)果一致［10］。值得注意的是與CS通過酰胺鍵相連的NCH2CH2(d)與沒有與CS通過酰胺鍵相連的NCH2CH2(c)相比，化學(xué)位移會(huì)向低場(chǎng)移動(dòng)，而NCH2CH2(c)與羧基相連，化學(xué)位移較高。而且由圖2 c)可見，CH2N(a，3.23)，NCH2(b，2.47)，NCH2CH2COOH(c，3.13)，NCH2CH2CONH(d，1.95)，4 種氫的峰面積之比為:Sa∶Sb∶Sc∶Sd=2.00∶4.12∶3.24∶0.96≈2∶4∶3∶1，所有氫原子的數(shù)目與理論結(jié)構(gòu)幾乎一致。根據(jù)NCH2CH2(d)處與NHCOCH3(7)處的峰面積計(jì)算出當(dāng)投料比(端羧基PAMAM分子與CS上的氨基的物質(zhì)的量之比)為1/15時(shí)，端羧基PAMAM對(duì)于CS的取代度為4.0%(若反應(yīng)時(shí)投入的端羧基PAMAM都被接枝到CS分子鏈上，其理論取代度為5.7%)。

2.2 TG與DTA分析

圖2為 CS和CS-g-PAMAM的TG，DTA曲線。

圖2 TG和DTA曲線Fig.2 TG and DTA curves for

從圖2a)中可以看出，CS失重過程主要分為2個(gè)階段，第1個(gè)階段從25℃到105℃，失重率為8.76%，這一階段的DTA曲線在69.7℃出現(xiàn)吸熱峰，這是由于 CS在該階段失去吸熱結(jié)晶水所致。第2階段是260℃～340℃，CS失重率達(dá)46.24%，在此階段，相應(yīng)的 DTA曲線在311.0℃出現(xiàn)放熱峰，應(yīng)該是CS發(fā)生氧化反應(yīng)而導(dǎo)致。

相對(duì)而言，CS-g-PAMAM的DTA曲線［圖2b)］在61.5℃處出現(xiàn)吸熱峰，開始失去結(jié)晶水。CS-g-PAMAM除了在313.1℃出現(xiàn)放熱峰，發(fā)生氧化反應(yīng)并放熱。在577.3℃處又出現(xiàn)放熱峰，這一放熱峰很有可能是由于所接枝的端羧基PAMAM被氧化分解引起的。

綜合圖2a)和圖2b)可以發(fā)現(xiàn)，CS以及 CS-g-PAMAM的熱行為曲線有顯著的差異，這也間接說明端羧基PAMAM被成功接枝到了CS分子鏈上。

2.3 投料比影響分析

室溫下，使用不同投料比制備而成的 CS-g-PAMAM配置成1 g·L-1的水溶液，其水溶性變化如表1所示。當(dāng)投料比低于1∶15時(shí)，接枝物不溶于水，這主要是引入的基團(tuán)(端羧基PAMAM)過少，不足以破壞CS分子鏈之間的氫鍵作用，因此對(duì)CS的水溶性沒有顯著的改變。隨后對(duì)于 1∶5，1∶10，1∶15這3種投料比條件下制備而成的具有良好水溶性接枝物進(jìn)行粒徑測(cè)試，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同投料比(端羧基PAMAM分子與CS上的氨基的物質(zhì)的量之比)制備的CM-g-PAM AM納米顆粒的尺寸分布Fig.3 Size distribution of CS-g-PAM AM nanoparticles p repared at different feeding ratios(m olar ratios of term inal carboxyl group-PAM AM to am ino group in CS)

從圖3可以看出，在合成 CS-g-PAMAM過程中，當(dāng)投料比為1∶15時(shí)，生成的納米粒子粒徑為90 nm。此時(shí)，接枝到CS的端羧基PAMAM恰好可以產(chǎn)生驅(qū)動(dòng)力(氫鍵作用和疏水作用)，自組裝成為核殼型納米粒子。投料比高于1∶15時(shí)，生成的納米粒子尺寸大于400 nm，這主要是由于PAMAM帶有多個(gè)可反應(yīng)的端羧基，所以過多的端羧基 PAMAM會(huì)導(dǎo)致這些分散的核殼型CS-g-PAMAM納米粒子進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，結(jié)果生成較大尺寸的納米粒子。有研究證明尺寸較小的納米粒子相對(duì)于那些尺寸比較大的納米粒子比較難被吞噬細(xì)胞吞入，作為藥物釋放載體更有優(yōu)勢(shì)［11-12］。所以我們確定合成CS-g-PAMAM的最適宜投料比為1∶15，實(shí)驗(yàn)測(cè)試中所用的 CS-g-PAMAM都為1∶15投料比條件下制備而成的。

2.4 CS-g-PAM AM納米粒子形態(tài)觀察

通過TEM觀察了CS-g-PAMAM納米粒的形貌，如圖4所示。

圖4 CS-g-PAM AM納米粒子的TEM圖片F(xiàn)ig.4 TEM images of CS-g-PAMAM dendrimer nanoparticles

從TEM照片可以清楚的看到CS-g-PAMAM接枝物形成了分散較好的球形納米粒。此外，我們也觀察到了個(gè)別納米粒的聚集現(xiàn)象。這是由兩方面造成的:第一，納米粒的表面能較高，相互聚集可以降低表面能，所以那些表面電荷較少的納米粒之間可能發(fā)生聚集;第二，CS外殼上有羥基和氨基的存在，因此帶來的分子間氫鍵作用也是納米粒聚集的重要原因。

2.5 CS-g-PAM AM納米粒子的成球機(jī)理

CS-g-PAMAM核殼結(jié)構(gòu)納米顆粒形成過程如圖5所示。

圖5 CS-g-PAM AM自組裝成核殼型納米粒子的示意圖Fig.5 Process of CS-g-PAM AM dend rim ers self-assem b le in to core-shell nanoparticles

在生理pH值的條件下(pH=7.4)，支鏈PAMAM上面大量的端羧基都不會(huì)電離，這些大量不電離的羧基相互之間會(huì)產(chǎn)生非常強(qiáng)的氫鍵作用，端羧基PAMAM樹枝狀大分子還會(huì)作為疏水核存在于納米粒子的內(nèi)部。所以端羧基PAMAM產(chǎn)生的疏水作用和氫鍵作用對(duì)于整個(gè)CS-g-PAMAM核殼結(jié)構(gòu)納米顆粒的形成起著非常關(guān)鍵的作用。

3 結(jié)論

1)合成了端羧基PAMAM，然后通過CS的胺基與端羧基PAMAM的羧基之間的酰胺縮合反，成功合成了CS-g-PAMAM接枝物。

2)通過考察不同CS-g-PAMAM接枝物溶解性和生成納米粒子的大小確定了合成過程的最適宜投料比。

3)TEM實(shí)驗(yàn)結(jié)構(gòu)表明，CS-g-PAMAM為球形納米顆粒，粒徑大約為90 nm。

4)提出了CS-g-PAMAM的成球理論，認(rèn)為通過氫鍵和疏水作用的驅(qū)動(dòng)，CS-g-PAMAM可以自組裝成以CS為殼，端羧基PAMAM為核的CS-g-PAMAM核殼結(jié)構(gòu)納米粒子。

［1］Xiao B，Wan Y，Wang X，et al.Synthesis and characterization of N-(2-hydroxy)propyl-3-trimethyl ammonium chitosan chloride for potential application in gene delivery［J］.Colloids and Surfaces B:Biointerfaces，2012，91:168-174

［2］Sajomsang W，Ruktanonchai U R，Gonil P，et al.Mucoadhesive property and biocompatibility of methylated N-aryl chitosan derivatives［J］.Carbohydrate Polymers，2009，78(4):945-952

［3］Esfand R，Tomalia D A.Poly(amidoamine)(PAMAM)dendrimers:From biom imicry to drug delivery and biomedical applications［J］.Drug Discovery Today，2001，6(8):427-436

［4］Tomalia D A.Birth of a new macromolecular architecture:Dendrimers as quantized building blocks for nanoscale synthetic polymer chemistry［J］.Progress in Polymer Science，2005，30(3):294-324

［5］Ma M，Cheng Y，Xu Z，et al.Evaluation of polyamidoamine(PAMAM)dendrimers as drug carriers of anti-bacterial drugs using sulfamethoxazole(SMZ)as a model drug［J］.European journal of medicinal chemistry，2007，42(1):93-98

［6］Balogh L，Swanson D R，Tomalis D A，et al.Dendrimer-Silver complexes and nanocomposites as antimicrobial agents［J］.Nano Letters，2001，1(1):18-21

［7］Boas U，Heegaard PM H.Dendrimers in drug research［J］.Chemical Society Reviews，2004，33(1):43-63

［8］Meyers SR，John F S，Griset A P，et al.Anionic amphiphilic dendrimers as antibacterial agents［J］.Journal of the American Chem ical Society，2008，130(44):14 444-14 445

［9］胡加娟，郭秀生，于德梅.半代聚酰胺-胺樹狀聚合物的酸性水解及性能研究［J］.工程塑料應(yīng)用，2011，39(1):4-8 Hu Jiajuan，Guo Xiusheng，Yu Demei.Acid hydrolysis and performance measurement of half generation polyamidoamine dendrimers［J］.Engineering Plastics Application，2011，39(1):4-8(in Chinese)

［10］Hitoshi S，Hirufumi Y，Seiichi A.Synthesis of a chitosan dendrimer hybrid and its biodegradation［J］.Biomacromolecules，2003，4:1 244-1 249

［11］Vonarbourg A，Passirani C，Saulnier P，et al.Parameters influencing the stealthiness of colloidal drug delivery systems［J］.Biomaterials，2006，27:4 356-4 373

［12］Vonarbourg A，Passirani C，Saulnier P，et al.Evaluation of pegylated lipid nanocapsules versus complement system activation and macrophage uptake［J］.Journal of Biomedical Materials Research PartA，2006，78:620-628