Gordonia sp. LAM0048的分離鑒定及其降解正十六烷的研究

陳小蓉, 阮志勇, 王彥偉, 王慧敏, 郭 翔, 孔德龍, 邵承斌

1.重慶工商大學(xué)環(huán)境與生物工程學(xué)院, 重慶 400060;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所, 農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)微生物資源收集與保藏重點實驗室, 北京 100081;3.農(nóng)業(yè)部農(nóng)村可再生能源開發(fā)利用重點實驗室, 成都 610041

隨著全球石油使用量的快速增加、長期不科學(xué)使用以及運輸開采過程中泄漏等問題，一些高毒、高殘留、難降解、致癌、致畸等烴類物質(zhì)進入土壤和地下水，對環(huán)境造成污染并嚴(yán)重危害人類健康[1]。烷烴作為石油的主要成分，在石油中的含量高達50%～95%[2]，同時也是石油污染物中的主要成分[3]。如何有效的減少或消除石油烴污染，已成為人們廣泛關(guān)注的重點問題。目前治理石油污染的方法主要包括物理修復(fù)法、化學(xué)修復(fù)法和生物修復(fù)法，其中生物修復(fù)法相比于其他兩種修復(fù)方法，具有高效、無二次污染、易操作和成本低等優(yōu)點，已成為石油污染修復(fù)的重要方法[4]。

如何快速高效降解烷烴是石油污染修復(fù)的關(guān)鍵技術(shù)，分離烷烴降解微生物并了解降解菌的生理生化特征及分類進化地位是實現(xiàn)生物修復(fù)石油污染環(huán)境的重要基礎(chǔ)。目前，已經(jīng)分離報道的烷烴降解菌有黃桿菌(Flacobacterium)[5]、戈登氏菌(Gordonia)[6]、假單孢菌(Pseudominas)、海桿菌(Marinobacte)[7]和迪茨氏菌(Dietzia)[8]等。

由于已公開報道的大多烷烴降解菌株可降解的烷烴濃度都較低，在實際應(yīng)用中易受到限制，因此考慮高烷烴濃度污染下的生物修復(fù)。本研究開展了從烴類污染土壤中富集高效烷烴降解菌的工作，以篩選出高烷烴濃度耐受性的菌株為目的，分離篩選到一株高耐受性烷烴降解菌LAM0048，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗、細(xì)胞化學(xué)組分分析和16S rRNA基因序列分析，初步確定其為戈登氏屬(Gordonia)的一個種，將其定名為Gordoniasp. LAM0048，并對其烷烴降解能力進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 試劑與培養(yǎng)基

所有試劑除特殊說明外均為市售分析純或色譜純。

富集培養(yǎng)基為營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(nutrient broth，NB，BD/Difco 234000，美國)。添加瓊脂15～20 g/L制成斜面或平板(NA)；無機鹽培養(yǎng)基：KH2PO40.50 g,Na2HPO4·12H2O 1.00 g,NH4Cl 1.10 g,MgSO4·7H2O 0.20 g, 微量元素液2 mL, 酵母提取物0.03 g,蒸餾水1 L，pH 7.3；微量元素液：EDTA 0.500 0 g,ZnSO4·7H2O 0.220 0 g, CaCl20.050 0 g, MnCl2·4H2O 0.051 0 g, FeSO4·7H2O 0.019 9 g,(NH4)6Mo2O24·4H2O 0.011 0 g, CuSO4·5H2O 0.015 7 g, CoCl2·6H2O 0.016 1 g, 蒸餾水 1 L，pH 6.0；脂肪酸分析培養(yǎng)基為TSA培養(yǎng)基(BD/Difco 236950,美國)。

1.2 烷烴降解菌株的分離

利用富集培養(yǎng)的方法篩選烷烴降解菌，所用土樣采自長期受烷烴及多環(huán)芳烴污染環(huán)境中的下層土壤。

取1.0 g土樣加入已滅菌的50 mL富集培養(yǎng)基中，30℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)。富集培養(yǎng)24 h后，取2 mL富集液接種至50 mL濃度為2 g/L的正十六烷無機鹽培養(yǎng)基中，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)3 d，重復(fù)3次。采用連續(xù)梯度稀釋法進行分離，取100 μL培養(yǎng)液均勻涂布于含200 mg/L正十六烷的無機鹽培養(yǎng)基平板上，30℃恒溫倒置培養(yǎng)3 d。根據(jù)菌落生長時間、形態(tài)及顏色的不同進行分離純化。挑取單菌落接種于含200 mg/L正十六烷的無機鹽液體培養(yǎng)基中，30℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)，以未接種的培養(yǎng)基作為對照，期間觀察菌株生長和正十六烷烴狀態(tài)變化情況。3 d后獲得6株生長迅速、正十六烷烴明顯變化的菌株。將分離得到的6株菌株經(jīng)多次純化后，15%甘油中-80℃低溫保藏。將篩選出的正十六烷烴狀態(tài)變化最明顯的菌株編號為LAM0048，并將其保存至中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心(保藏編號為ACCC 19754)。

1.3 菌株LAM0048的鑒定

對菌株LAM0048進行形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗、細(xì)胞化學(xué)組分分析以及16S rRNA基因序列分析，確定其分類地位；菌株的形態(tài)及生理生化特性參考Ruan等[9]的方法進行。

菌株的DNA提取與純化參照Marmur等[10]的方法進行。以提取的基因組DNA為模板，采用16S rRNA基因的通用引物27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R: 5′-ACGGHTAC-CTTGTTTACGACTT-3′對其進行16S rRNA基因擴增。PCR產(chǎn)物利用PCR產(chǎn)物回收試劑盒 (天根公司) 回收后，酶連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，通過藍白斑篩選，挑選陽性克隆子，由上海英駿公司測序。16S rRNA測序結(jié)果在EzTaxon-e Serveice中對比[11]，尋找具有較高同源性的16S rRNA基因序列；比對結(jié)果采用MEGA6[12]軟件包進行多序列對比分析，采用鄰近法(Neighbor-joining)構(gòu)建基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。

將菌株LAM0048接種到TSA培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)18 h，收集新鮮的菌體后，根據(jù)MIDI系統(tǒng)操作手冊提取脂肪酸，采用含MIS Library Generation Software的高效氣相色譜儀檢測其脂肪酸組成[9]。

將菌株LAM0048在NB培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)18 h，離心收集菌體并用生理鹽水沖洗2次，按照Xu等[13]的方法進行極性脂的提取與分析。

1.4 菌株LAM0048降解正十六烷烴能力的測定

將菌株在NB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期(OD600=0.6)，離心菌體并用無菌水沖洗，最后按1%(V/V)的接種量，分別接種至含0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.5%、0.8%和1.0%(V/V)正十六烷的50 mL無機鹽培養(yǎng)基中，30℃，160 r/min培養(yǎng)，設(shè)置3組平行，以不加菌的含烷烴培養(yǎng)基為空白對照，36 h后利用氣相色譜(GC)檢測正十六烷殘留量，計算菌株對正十六烷的降解率。

1.5 正十六烷殘留量的測定與分析方法

烷烴降解率的測定方法參照陸健等[14]的方法進行，具體操作步驟：在50 mL烷烴培養(yǎng)液中加入15 mL色譜純正己烷，輕輕振蕩以溶解表層烷烴相。將此混合液倒入250 mL分液漏斗中劇烈振蕩，靜置分層，吸取上清液至50 mL容量瓶中，在殘液中加入15 mL正己烷按以上步驟重復(fù)萃取2次，合并萃取液并用正己烷定容至50 mL。將此萃取液過0.22 μm濾膜除雜，取1 μL進行GC測定。色譜柱為DN-5MS石英毛細(xì)柱(30 m×0.25 mm)，色譜條件：80℃保持5 min，以5 ℃/min升至140℃保持1 min，以5 ℃/min升至280℃。進樣口和檢測器溫度分別為260℃和280℃。

1.6 正十六烷降解率的計算方法

在測定的正十六烷殘留量色譜圖中，計算殘留正十六烷的峰面積與空白對照中正十六烷的峰面積的比值，以百分之百減去峰面積比值，即得降解率。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株LAM0048的初步鑒定

菌株LAM0048在NA平板上菌落呈橘紅色、不透明、邊緣光滑、表面微粗糙。菌體形態(tài)如圖1(彩圖見封三圖版)所示，為短桿狀，大小為1.0～1.5 μm，革蘭氏陽性菌。生長溫度為15～48℃，pH范圍：5～9，耐受NaCl濃度為7% (W/V)，能利用吐溫-40、吐溫-80、麥芽三糖、鼠李糖、核糖、蔗糖、丙酮酸甲酯、丙酮酸和甘油。

圖1 菌株LAM0048的菌體形態(tài)Fig.1 Morphology of strain LAM0048.(彩圖見封三圖版)

通過PCR擴增，得到長度為1 433 bp的16S rRNA基因序列片段。將測得的16S rRNA序列在NCBI上進行對比，結(jié)果顯示菌株LAM0048與棒桿菌亞目(Corynebacterineae)、諾卡菌科(Nocardiaceae) 的GordoniaterraeNBRC 10016T、GordonialacunaeDSM 45085T、GordonianamibiensisNBRC 108829T和GordoniabronchialisDSM 43247T的進化關(guān)系接近，16S rRNA序列相似性分別為99.03%、98.73%、97.28%和97.21%。圖2為菌株LAM0048及相關(guān)菌株的16S rRNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，可以看出，菌株LAM0048與GordonialacunaeDSM 45085T處于同一亞支且與GordoniaterraeNBRC 100016T處于同一大支，穩(wěn)定性較高。結(jié)合16S rRNA序列比對結(jié)果以及系統(tǒng)發(fā)育樹的分析，將其歸為戈登氏屬(Gordonia)，并命名為Gordoniasp. LAM0048。

菌株LAM0048的主要脂肪酸為C16∶0、C18∶1、TSBA(10-methyl C18∶0)和Summed feature 3(C16∶1ω7c/C16∶1ω6c)，詳細(xì)脂肪酸含量見表1。同G.terreaNBRC 100016T相比，菌株LAM0048脂肪酸組成和含量的差異性較為明顯，主要體現(xiàn)在脂肪酸C16∶1cis9與Summed feature 3上，具體差異見表1。

菌株LAM0048的主要極性脂如圖3所示，主要為雙磷脂酰甘油(diphosphatidylglycerol，DPG)、磷脂酰乙醇胺 (phosphatidylethanolamine，PE)、磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol，PI)、兩種磷脂酰肌醇甘露糖苷(phosphatidylinositol mannoside，PIM)和四種糖脂(glycolipids，GL)。與菌株GordoniaterraeNBRC 100016T相比，其主要極性脂組成一致，而次要組成上存在較明顯差異，具體結(jié)果如表2所示。

圖2 利用NJ法構(gòu)建的基于16S rRNA的菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Neighbor-joining phylogenetic tree based on the 16S rRNA gene sequences of strain.

脂肪酸LAM0048G.terrea[15]C14∶02.52C16∶1cis9ND17C16∶034.133C18∶124.434C18∶02.51TBSA19.512Summedfeature313.4ND

注：Summed feature 3為C16∶1ω7c/C16∶1ω6c；ND：未檢測到。

圖3 菌株LAM0048的極性脂F(xiàn)ig.3 Total polar lipids of strain LAM0048.

表2 菌株LAM0048與相似菌株G. terrea的極性脂比較Table 2 Polar lipid comparation of strain LAM0048 and G. terrea NBRC 100016T.

通過菌株LAM0048的形態(tài)學(xué)特征、生理生化指標(biāo)以及16S rRNA基因序列的對比結(jié)果，表明該菌株屬于戈登氏屬(Gordonia)，但是該菌株與其系統(tǒng)進化最接近的菌株相比，在底物利用、脂肪酸組成與含量以及極性脂的組成等方面存在較為明顯的差異，推測其可能為戈登氏屬的一個新種，其確定的分類地位還需要通過DNA-DNA雜交或者基因組學(xué)分析進一步明確。

2.3 菌株LAM0048的烷烴降解特性

在30℃，培養(yǎng)36 h時，菌株LAM0048對不同濃度正十六烷(C16)的降解率如圖4所示，當(dāng)C16濃度為0.05%時，其降解率為100%，而隨C16濃度的增加，菌株對烷烴的降解率有所降低，但濃度升高至1.0%(V/V)時，降解率仍然能夠達到46.4%。實驗結(jié)果表明，菌株LAM0048對正十六烷(C16)具有良好的降解能力，且能耐受高濃度的烷烴，是一株具有良好應(yīng)用前景的高效烷烴降解菌。

圖4 菌株LAM0048在不同C16濃度下的降解率變化Fig.4 Degradation change of n-hexadecane with different concentrations by strain LAM0048.

3 討論

本研究以正十六烷為唯一碳源，從土樣中分離到一株高效烷烴降解菌LAM0048。經(jīng)過形態(tài)特征觀察、生理生化實驗、16S rRNA基因序列比對分析，將其劃分到戈登氏屬(Gordonia)。細(xì)胞脂肪酸和極性脂的比對分析結(jié)果表明，菌株LAM0048可能為該屬的一個新種。

在烷烴利用實驗中，菌株LAM0048表現(xiàn)出良好的烷烴降解能力，36 h內(nèi)能夠完全降解0.05%(V/V)的C16，且對烷烴的耐受濃度較高，在含1.0% (V/V) C16的無機鹽培養(yǎng)基中，36 h時的降解率仍高達46.4%，對烷烴降解效果明顯。

近年來已經(jīng)公開報道的烴類降解微生物較多，雖然其中大多數(shù)菌株的降解效果較為理想，如Wang 等[8]報道的烷烴降解菌株DietziaDQ12-45-1b 在含0.3%(V/V)C16的無機鹽培養(yǎng)基中，培養(yǎng)21 d 時，能降解81.17 mg正十六烷。張楠[16]報道的烷烴降解菌Pseudomonasaeruginosa在培養(yǎng)6 d時，對0.26%(V/V)的C16降解率為97.3%。吳佩春等[17]報道的石油降解菌Streptomycesexfoliatus，14 d時對原油[0.03%(V/V)]的降解為83%，但其菌株對正十六烷烴類濃度都有一定要求，一般濃度都在0.39%(V/V)以下。而本研究所分離的烷烴降解菌株LAM0048對正十六烷烴濃度耐受性較高，能夠在高濃度[1.0%(V/V)]下高效率降解烷烴。這一發(fā)現(xiàn)對石油污染的環(huán)境修復(fù)具有十分重要的意義，為高濃度污染源的修復(fù)提供了理論基礎(chǔ)，豐富了石油污染修復(fù)的菌種資源。

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