豬SsBHMT基因的原核表達(dá)及條件優(yōu)化

余愛(ài)麗, 趙晉鋒, 張晏萌, 張 正, 郭二虎

1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院谷子研究所, 山西 長(zhǎng)治 046011;2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 河北 保定 071001

BHMT(betaine-homocysteine methyl transferase)基因存在于動(dòng)物和微生物體內(nèi)，用于編碼甜菜堿高半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，能夠催化甜菜堿的甲基轉(zhuǎn)移到高半胱氨酸上，形成二甲基甘氨酸和甲硫氨酸[1]。甲硫氨酸是合成蛋白質(zhì)的必需氨基酸，是構(gòu)成蛋白質(zhì)的“骨架”氨基酸，甲硫氨酸含量不足將影響其他氨基酸的利用效率，從而影響蛋白質(zhì)的合成[2]。甲硫氨酸是合成腺苷甲硫氨酸(SAM)的底物，SAM是生物體內(nèi)的重要甲基供體。甲基代謝在生物體內(nèi)具有十分重要的意義，很多生物大分子的合成代謝需要甲基的供給，多個(gè)基因的表達(dá)調(diào)控需要甲基參與[3,4]，如：蛋白質(zhì)、脂類的代謝，DNA、RNA的甲基化等。為此本研究在克隆了豬BHMT基因和構(gòu)建其原核表達(dá)載體的基礎(chǔ)上, 對(duì)其進(jìn)行原核表達(dá)分析和表達(dá)條件的優(yōu)化, 為進(jìn)一步目的蛋白的純化和表達(dá)研究提供素材。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料 pET30a-SsBHMT原核表達(dá)載體為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。大腸桿菌(Esherichiacoli)菌株ER2566、BL21為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥品 蛋白Marker、SDS、丙烯酰胺、胰蛋白胨、酵母提取物等化學(xué)試劑購(gòu)自上海生工生物工程公司；IPTG購(gòu)自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司；Ni-NTA Resin購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析 菌種的活化: 取實(shí)驗(yàn)室保存的菌株，在含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上“之”字劃線，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。自平板挑取單菌落，轉(zhuǎn)接于含卡那的液體培養(yǎng)基中，200 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。

取樣: 取培養(yǎng)過(guò)夜的菌液，按照1∶100比例轉(zhuǎn)接于含相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min培養(yǎng)2～3 h，當(dāng)其OD值達(dá)0.6～0.8時(shí)，取2 mL菌液作對(duì)照，記作0 h；剩余菌液分別加入IPTG至終濃度0.4 mmol/L，37℃，200 r/min繼續(xù)培養(yǎng)，誘導(dǎo)2 h、4 h、6 h、8 h、10 h，各取2 mL，12 000 r/min離心1 min，去其上清，保存于-20℃。

樣品制備: 取所收集菌體，分別加入100 μL 10 mmol/L的Tris-HCl(pH 8.0)，2% β-巰基乙醇2 μL，重懸細(xì)胞沉淀；冰浴條件下，超聲處理10 min，4℃，12 000 r/min離心15 min，分別取上清和沉淀物。沉淀中加入100 μL 10 mmol/L的Tris-HCl(pH 8.0)，2%β-巰基乙醇2 μL，重懸細(xì)胞沉淀。

分析：SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)蛋白。

1.2.2誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化 不同菌株的篩選：將重組載體分別導(dǎo)入菌株ER2566、BL21進(jìn)行表達(dá)分析，具體方法同1.2.1。

目的蛋白表達(dá)量最多的株系的篩選：從平板上挑取8個(gè)單菌落，IPTG濃度為0.4 mmol/L，進(jìn)行篩選，具體方法同1.2.1。

IPTG濃度的優(yōu)化：取篩選得到的目的蛋白表達(dá)量最多的菌株，分別加入IPTG至終濃度為0.3 mmol/L、0.4 mmol/L、0.5 mmol/L、0.6 mmol/L、0.7 mmol/L、0.8 mmol/L、0.9 mmol/L和1.0 mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)，具體方法同1.2.1。

IPTG誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化：取篩選得到的目的蛋白表達(dá)量最多的菌株，在IPTG誘導(dǎo)2 h、4 h、6 h、8 h和10 h取樣，具體方法同1.2.1。

超聲時(shí)間的優(yōu)化：設(shè)定冰浴超聲處理時(shí)間分別為5 min、10 min、15 min和20 min，方法同1.2.1。

1.2.3目的蛋白的純化 經(jīng)優(yōu)化條件誘導(dǎo)后，離心收集菌體，加入裂解液，超聲破碎，離心收集上清沉淀，沉淀用8 mol/L尿素溶解后，用Ni2+親和柱純化(參照說(shuō)明書(shū))，SDS-PAGE 鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析

含有外源基因菌株ER2566(pET30a-SsBHMT)和不含外源基因菌株ER2566(pET30a)在37℃，經(jīng)過(guò)IPTG(終濃度為0.4 mmol/L)誘導(dǎo)2 h、4 h、6 h、8 h和10 h后，SDS-PAGE分析見(jiàn)圖1和圖2，結(jié)果表明：沉淀和上清中，在蛋白Marker的45 kDa與66 kDa的條帶之間有一條明顯的條帶，與預(yù)測(cè)目的蛋白條帶的分子量(約為51 kDa)相吻合；沉淀中的目的蛋白的表達(dá)量明顯高于上清；目的蛋白以可溶性蛋白和包涵體兩種形式表達(dá)，但主要以包涵體的形式存在。

2.2 不同菌株對(duì)目的蛋白表達(dá)的影響

將構(gòu)建的原核表達(dá)載體pET30a-SsBHMT分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)和ER2566菌株，分析結(jié)果如圖3，目的蛋白在ER2566中明顯表達(dá)，且在沉淀中的表達(dá)量明顯高于上清液中的表達(dá)量。但目的蛋白在BL21中不表達(dá)或表達(dá)不明顯，說(shuō)明不同菌株也影響目的蛋白的表達(dá)。

圖1 目的蛋白在沉淀中的表達(dá)分析Fig.1 Analysis of target protein expression in precipitation.1.ER2566(pET30a)誘導(dǎo)6 h； 2.蛋白Marker； 3～8.ER2566(pET30a-SsBHMT)誘導(dǎo)0 h、2 h、4 h、6 h、8 h和10 h.

圖2 上清中目的蛋白的表達(dá)分析Fig.2 Analysis of target protein expression in supernatant.1.ER2566(pET30a)誘導(dǎo)6 h； 2.蛋白Marker； 3～8.ER2566(pET30a-SsBHMT)誘導(dǎo)0 h、2 h、4 h、6 h、8 h和10 h.

圖3 SsBHMT在大腸桿菌BL21(DE3)和ER2566菌株中的誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of SsBHMT protein in E.coli BL21(DE3)and ER2566.M.蛋白Marker；1.ER2566(pET30a-SsBHMT)沉淀；2.ER2566(pET30a-SsBHMT)上清；3.ER2566(pET30a-SsBHMT)未誘導(dǎo)；4.ER2566(pET30a)沉淀；5.ER2566(pET30a)上清；6.BL21(pET30a-SsBHMT)沉淀；7.BL21(pET30a-SsBHMT)上清

2.3 同一菌株不同株系對(duì)目的蛋白表達(dá)的影響

從平板上隨機(jī)挑8個(gè)單菌落，IPTG(終濃度為0.4 mmol/L)誘導(dǎo)2 h以后，分析結(jié)果表明：4號(hào)菌株在沉淀中目的蛋白表達(dá)量最多(圖4)；上清中除5號(hào)菌外，2、4號(hào)菌表達(dá)量略低，其余目的蛋白表達(dá)量接近(圖5)。

2.4 IPTG濃度對(duì)目的蛋白表達(dá)量的影響

沉淀中目的蛋白表達(dá)量最多的菌株，不同濃度的IPTG(0.3 mmol/L、0.4 mmol/L、0.5 mmol/L、0.6 mmol/L、0.7 mmol/L、0.8 mmol/L、0.9 mmol/L、1.0 mmol/L)誘導(dǎo)2 h，分析結(jié)果表明：在未加IPTG時(shí)，沒(méi)有目的蛋白的表達(dá)；在IPTG濃度為0.3 mmol/L時(shí)，目的蛋白表達(dá)；在IPTG濃度為0.4 mmol/L時(shí)，目的蛋白的表達(dá)量微量上調(diào)，之后隨IPTG濃度的增大，目的蛋白的表達(dá)量減少(圖6)。所以0.4 mmol/L為此菌株的最佳IPTG誘導(dǎo)濃度。

圖4 篩選在沉淀中表達(dá)最優(yōu)的菌株Fig.4 Screening optimal bacteria expressed in precipitation.M：蛋白Marker；1～8：從平板上挑的8個(gè)單菌落

圖5 篩選在上清中表達(dá)最優(yōu)的菌株Fig.5 Screening optimal bacteria expressed in supernatant.M：蛋白Marker； 1～8：從平板上挑的8個(gè)單菌落

圖6 不同IPTG濃度對(duì)目的蛋白在沉淀中表達(dá)量的影響Fig.6 Effects of IPTG concentration on the recombinant protein expressed in precipitation.M：蛋白Marker；1～9. IPTG濃度分別為0 mmol/L、0.3 mmol/L、0.4 mmol/L、0.5 mmol/L、0.6 mmol/L、0.7 mmol/L、0.8 mmol/L、0.9 mmol/L、1.0 mmol/L

2.5 IPTG誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)目的蛋白表達(dá)量的影響

沉淀中目的蛋白表達(dá)量最大的菌株，加入IPTG至終濃度為0.4 mmol/L，經(jīng)過(guò)不同時(shí)間誘導(dǎo)后，結(jié)果表明：沉淀中，IPTG誘導(dǎo)2 h時(shí)，目的蛋白開(kāi)始表達(dá)；并且隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量明顯增加；IPTG誘導(dǎo)10 h時(shí)，目的蛋白的表達(dá)量最大(圖7)。上清中目的蛋白的表達(dá)量隨時(shí)間變化無(wú)明顯變化(圖8)。

圖7 不同IPTG誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)目的蛋白在沉淀中表達(dá)量的影響Fig.7 Effects of induction time on the target protein expression in precipitation.1.ER2566(pET30a)誘導(dǎo)6 h； 2.蛋白Marker； 3～8. ER2566(pET30a-SsBHMT)誘導(dǎo)0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h

圖8 不同IPTG誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)目的蛋白在上清中表達(dá)量的影響Fig.8 Effects of induction time on the target protein expression in supernatant.1.ER2566(pET30a)誘導(dǎo)6 h；2.蛋白Marker；3～8.ER2566(pET30a-SsBHMT)誘導(dǎo)0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h.

2.6 超聲時(shí)間對(duì)目的蛋白提取量的影響

沉淀中目的蛋白表達(dá)量最多的菌株，0.4 mmol/L IPTG誘導(dǎo)2 h后，經(jīng)不同的冰浴超聲破碎時(shí)間5 min、10 min、15 min、20 min破碎，結(jié)果見(jiàn)圖9，超聲5 min時(shí)，沉淀中目的蛋白提取量略大；上清中目的蛋白表達(dá)量變化不明顯(圖10)。

圖9 不同超聲時(shí)間對(duì)目的蛋白在沉淀中提取量的影響Fig.9 Effects of different ultrasonic time on the target protein extraction in precipitation.1.ER2566(pET30a)對(duì)照；2～5.超聲5 min、10 min、15 min、20 min；M.蛋白Marker

圖10 不同超聲時(shí)間對(duì)目的蛋白在上清中提取量的影響Fig.10 Effects of different ultrasonic time on the target protein extraction in supernatant.M.蛋白Marker； 1.ER2566(pET30a)對(duì)照； 2～5.超聲5 min、10 min、15 min、20 min

2.7 目的蛋白的純化

上清和沉淀的純化結(jié)果如圖11所示，沉淀純化結(jié)果明顯，在45～66 kDa之間有一條帶，無(wú)雜蛋白，但上清純化無(wú)結(jié)果。

圖11 SsBHMT蛋白的純化Fig.11 Purification of SsBHMT protein.1.ER2566(pET30a-SsBHMT)沉淀純化；2.ER2566(pET30a-SsBHMT)沉淀；3.蛋白Marker; 4.ER2566(pET30a-SsBHMT)上清；5.ER2566(pET30a-SsBHMT)上清純化

3 討論

原核細(xì)胞表達(dá)體系是目前研究最深入、應(yīng)用最廣泛的表達(dá)系統(tǒng)，它具有真核表達(dá)體系無(wú)可比擬的優(yōu)點(diǎn)，成本低廉、外源基因表達(dá)量大等[5]。原核表達(dá)載體系統(tǒng)pET功能非常強(qiáng)大，可通過(guò)目的蛋白的特點(diǎn)、IPTG濃度的調(diào)節(jié)等方法來(lái)調(diào)控目的蛋白的表達(dá)水平，通過(guò)載體上的His-Tag標(biāo)簽純化蛋白，特別適用于那些以包涵體形式表達(dá)的蛋白，使蛋白純化過(guò)程變得簡(jiǎn)單高效。為此本研究中選用pET載體對(duì)外源基因BHMT進(jìn)行表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BHMT基因在原核細(xì)胞BL21(DE3)中不表達(dá)或表達(dá)不明顯，在ER2566中主要以包涵體的形式表達(dá)，而且在不同ER2566(pET30a-SsBHMT)株系中表達(dá)量不同。前期實(shí)驗(yàn)28℃和37℃兩個(gè)誘導(dǎo)溫度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，溫度對(duì)目的蛋白的表達(dá)差異不大(未列出)，于是進(jìn)行了IPTG誘導(dǎo)濃度、誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化，結(jié)果表明篩選到的沉淀中目的蛋白表達(dá)量最多的菌株，在37℃，IPTG濃度為0.4 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間為10 h時(shí)，沉淀中的表達(dá)量最多，但仍主要以包涵體的形式表達(dá)，分析其原因可能與菌株有關(guān)[6]，也可能與pH、溫度[7～9]、真核生物密碼子偏愛(ài)性及氨基酸的組成等有關(guān)[10]。本研究結(jié)果與已有研究結(jié)果一致，表明不同重組載體的最佳表達(dá)條件不同，不同重組載體在同一菌株的最適條件也不相同，每種重組載體的最適表達(dá)條件都需要進(jìn)行特定的優(yōu)化[11～15]，如黑山羊基因MSTN[BL21-pET-32a(+)-MSTN69]的最優(yōu)表達(dá)條件為31℃，IPTG 0.8 mmol/L誘導(dǎo)5 h[12]； 番茄谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因ShGSTU1在大腸桿菌BL21(pET28a)中的最佳表達(dá)條件為37℃，1 mmol/LIPTG誘導(dǎo)4 h；在BL21(pET32a)中最佳表達(dá)條件為30℃，1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)5 h[15]。另外對(duì)不同超聲破碎時(shí)間分析發(fā)現(xiàn)，超聲時(shí)間對(duì)目的蛋白的純化影響不大。本研究?jī)?yōu)化了目的基因在原核細(xì)胞中表達(dá)的條件，使得目的基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)量明顯增加，為進(jìn)一步純化目的蛋白、制備抗體奠定了基礎(chǔ)。

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