落葉型棉花黃萎病的生物學(xué)特征及藥劑防治分析

摘 要：【目的】比較研究新疆昌吉市和沙灣市落葉型棉花黃萎病病原菌的生物學(xué)特性，分析的多菌靈、乙蒜素、唑酮乙蒜素、枯草芽孢桿菌和哈茨木霉菌5種農(nóng)藥對棉花黃萎病的防治效果，篩選出高效的藥劑用于指導(dǎo)棉花病害防治。

【方法】采用菌絲生長速率法，通過不同離子、pH值、碳源及溫度生長的適應(yīng)，分析各病原菌的主要生物學(xué)特性，并對5種農(nóng)藥進(jìn)行室內(nèi)毒力測定。

【結(jié)果】昌吉市和沙灣市各病原菌生長最適溫度為20～25℃，最適離子培養(yǎng)基為Ca2+，最適pH值5～7，最適碳源是蔗糖。5種供試藥劑均對各病原菌具有明顯的抑制效果。多菌靈、枯草芽孢桿菌、哈茨木霉菌對病原菌的抑制作用極強(qiáng)，昌吉市多菌靈、枯草芽孢桿菌、哈茨木霉菌其抑制中濃度EC50值僅分別為0.292 3～0.819 3 μg/mL、0.016 61～0.026 95 μg/mL和0.101 5～0.884 6 μg/mL，沙灣市EC50值分別為0.358 8～5.694 μg/mL、1.813×10-2～2.727×10-2" μg/mL和0.181 0～0.608 8 μg/mL；而乙蒜素、唑酮乙蒜素對病原菌的防效最差，其EC50在昌吉市分別高達(dá)71.04 、111.6 μg/mL，沙灣市分別為79.22、171.7 μg/mL。

【結(jié)論】昌吉市、沙灣市的各病原菌最適生長的溫度為25℃，含Ca2+培養(yǎng)基為最適離子培養(yǎng)基。各病原菌在pH 值5～7時生長速率最快，最適生長環(huán)境為酸性環(huán)境，對偏堿性環(huán)境也有較好的耐受性。微菌核在偏堿性的環(huán)境下更易形成，在以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基上的生長速率最快。多菌靈、枯草芽孢桿菌、哈茨木霉菌對棉花黃萎病菌有強(qiáng)抑菌作用，可在昌吉市和沙灣市用于防治棉花黃萎病。

關(guān)鍵詞：落葉型棉花；黃萎病；生物學(xué)特性；菌絲生長速率法；毒力測定

中圖分類號：S435.62 ""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ""文章編號：1001-4330（2024）08-2034-09

收稿日期（Received）：2024-01-28

基金項目：農(nóng)業(yè)發(fā)展資金項目（20220126）；農(nóng)業(yè)創(chuàng)新資金項目（2020026528-1）

作者簡介：賴成霞（1972-），女，新疆烏魯木齊人，副研究員，研究方向為棉花抗逆分子育種，（E-mail）lchxia2001@163.com

通訊作者：馬君（1983-），男，甘肅民勤人，副研究員，研究方向為棉花種質(zhì)資源，（E-mail）xj.majun@163.com

0 引 言

【研究意義】棉花黃萎?。╒erticillium wilt）是由大麗輪枝菌（Verticillium dahliae Kleb）［1］侵染棉花維管束而發(fā)生的一種系統(tǒng)性的真菌病害，微菌核是該病發(fā)生的主要初侵染源，可在土壤中可存活14年之久，其數(shù)量及存活狀況直接影響著黃萎病發(fā)生的危害程度［2-3］。致病力分化是造成該病反復(fù)危害的主要原因［4-5］。新疆棉花黃萎病發(fā)病面積2021年占播種面積的50%以上［6］，新疆北疆地區(qū)棉花黃萎病的發(fā)生逐漸呈增加態(tài)勢，強(qiáng)致病性菌株以菌核型為主，占黃萎病菌株的 94.12%以上［7］，新疆生境特殊、棉花品種混雜導(dǎo)致大麗輪枝菌對生態(tài)環(huán)境具有多樣性、變異性的特點(diǎn)，從而讓抗病性育種更加困難。針對性研究該病的生物學(xué)特性及防治藥劑，對有效防治該病害有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】2004～2007年段維軍［8］等和張莉［9］等發(fā)現(xiàn)，新疆黃萎病菌存在強(qiáng)、中、 弱 3 種 致 病 類 型 ，其中中等致病力的菌株居多，并發(fā)現(xiàn)了落葉型菌株。2011～2023年，新疆北疆地區(qū)的黃萎病菌的強(qiáng)致病性菌株占比由51.2%［10］、73.3%［11］發(fā)展至76.5%［7］。劉海洋等［6］對新疆北疆石河子、奎屯、博樂等8市（縣）棉田棉花黃萎病進(jìn)行抽樣調(diào)查，發(fā)現(xiàn)棉田中落葉型黃萎病呈絕對優(yōu)勢，高達(dá)97.6%，目前已有多種農(nóng)藥被引入棉田用于防治棉花黃萎病，如乙蒜素［12］、枯草芽孢桿菌［13］、哈茨木霉菌［14］、多菌靈［15］等，并且通過多種藥藥結(jié)合、菌藥結(jié)合等方式可以將棉花黃萎病在發(fā)病初期控制在40%以下。【本研究切入點(diǎn)】大麗輪枝菌引起的棉花黃萎病是棉花最嚴(yán)重的病害之一，昌吉市和沙灣市是新疆北疆棉花主要種植區(qū)，需針對性研究昌吉市和沙灣市棉花黃萎病的生物學(xué)特性和篩選高效藥劑?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用菌絲生長速率法，研究昌吉市和沙灣市黃萎病病原菌溫度適應(yīng)性、離子適應(yīng)性、酸堿度適應(yīng)性、碳源需求特性以及等生物學(xué)特征，并針對生產(chǎn)上常用的殺菌劑，篩選出對黃萎病菌具有顯著效力的殺菌劑，為新疆北疆棉花黃萎病精準(zhǔn)防治提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 棉花黃萎病病原菌株的分離培養(yǎng)及命名

從昌吉市騰飛農(nóng)場和沙灣市四道河子試驗站的棉田中采集黃萎病發(fā)病植株，并將發(fā)病的棉花植株在70%的乙醇中消毒30s后，在15%的NaClO中消毒5min中，將植株的維管系統(tǒng)放置在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)。從昌吉市分離獲得4個大麗輪枝菌被命名為Vc-1，Vc-2，Vc-3，Vc-4；從沙灣市分離的6個大麗輪枝菌被分別命名為Vd-1，Vd-2，Vd-3，Vd-4，Vd-5，Vd-6。對照菌株V991（Verticillium daliae Kleb）由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物學(xué)院朱龍付課題組提供。

1.1.2 供試藥劑及農(nóng)藥

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基，馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（Potato dextrose，PD）英國Oxoid公司）。其他試劑均為國產(chǎn)試劑。

50%多菌靈可濕性粉劑（威海韓孚生化藥業(yè)有限公司），20.0×108/mL枯草芽孢桿菌劑（河北威遠(yuǎn)生物化工有效公司），80%乙蒜素乳油（開封大地農(nóng)化生物科技有限公司），32%唑酮乙蒜素乳油（開封大地農(nóng)化生物科技有限公司），5.0×108/g哈茨木霉菌粉劑（遼寧土木啟生物科技有限公司）。

1.2 方 法

1.2.1 培養(yǎng)基配制

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基為培養(yǎng)棉花黃萎病菌絲的固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基按照生產(chǎn)商提供的方法配制，即1 L水中加入39 g PDA干粉，煮沸完全溶解后，121℃高壓滅菌15 min，再倒板；固體查氏（Czapek）培養(yǎng)基：1 L水中加入葡萄糖30 g，NaNO3" 2 g，K2HPO4·3H2O 1 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，12 g瓊脂，121℃高壓滅菌15 min。

1.2.2 不同溫度對病原菌生長速率的影響

以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在純化培養(yǎng)好的各病原菌菌落邊緣利用直徑為5 mm的打孔器進(jìn)行打孔，并將病原菌菌餅接入培養(yǎng)基中央，分別置于10、15、20、25和30℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。并在培養(yǎng)14 d后觀察菌落特征，利用十字交叉法測量菌落直徑，計算生長速率，分析病原菌生長速率和最適生長溫度，每個處理設(shè)置3～5個重復(fù)。

1.2.3 不同離子對病原菌生長速率的影響

以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別加入Na+、K+、Mg2+和Ca2+等離子制成濃度為0.1 M的不同離子培養(yǎng)基，將菌餅放入平板中央進(jìn)行培養(yǎng)，以無菌水為對照，置于25℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于12 d觀察菌落特征，利用十字交叉法測量菌落直徑，計算生長速率，每個處理設(shè)置3～5個重復(fù)。

1.2.4 不同pH值對病原菌生長速率的影響

以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別將培養(yǎng)基用HCl或NaOH將pH值調(diào)節(jié)至用5、6、7、8和9，并將菌餅放入平板中央進(jìn)行25℃培養(yǎng)，在培養(yǎng)14 d后觀察菌落特征，利用十字交叉法測量菌落直徑，計算生長速率，每個處理設(shè)置3～5個重復(fù)。

1.2.5 不同碳源對病原菌生長速率的影響

以查氏（Czapek）培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以蔗糖，脫脂奶粉2個碳源對培養(yǎng)基中的葡萄糖進(jìn)行C量代換，其中蔗糖為20 g，脫脂奶粉為18 g，將菌餅放入平板中央進(jìn)行25℃培養(yǎng)，培養(yǎng)12 d后觀察菌落特征，利用十字交叉法測量菌落直徑，計算生長速率，每個處理設(shè)置3～5個重復(fù)。

1.2.6 不同農(nóng)藥對病原菌生長的影響

將各農(nóng)藥分別設(shè)置為5個濃度梯度，多菌靈設(shè)置成5.0、5.6、6.25、10和12.5 μg/mL，枯草芽孢桿菌設(shè)置成0.078、0.156、0.312、1.25和12.50 μg/mL ，乙蒜素設(shè)置成25.0、33.3、40.0、66.7和100.0 μg/mL，唑酮乙蒜素設(shè)置成25.00、33.00、66.67、100和200 μg/mL，哈茨木霉菌設(shè)置成2×10-4、6.25×10-3、2.5×10-3、5×10-3和10 μg/mL，以PDA為基本培養(yǎng)基，按照上述各農(nóng)藥濃度中制成含藥平板，以無菌水為對照。在含藥平板中央接種菌餅，25℃恒溫培養(yǎng)。每處理設(shè)3～5個重復(fù)，培養(yǎng)14 d后采用十字交叉法測量菌落直徑，計算抑菌率，由GraphPad Prism 8求得毒力回歸方程、抑制中濃度（EC50） 和相關(guān)系數(shù)（R2） ，根據(jù)EC50值評價各殺菌劑的抑菌效果

抑菌率%=［（對照菌直徑-處理菌落）/（對照菌落直徑-5）］×100%。

將藥劑濃度換算成濃度對數(shù)（X），菌絲生長抑制率換算成抑制機(jī)率值（Y），計算各藥劑的抑制中濃度的EC50值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用Microsoft Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，SPSS 26進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，利用GraphPad Prism 8計算各農(nóng)藥的EC50值，用Origin 2018 、Photoshop 2014進(jìn)行圖片處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度對病原菌生長速率的影響

研究表明，昌吉市、沙灣市棉花黃萎病病原菌在不同溫度下生長速率具有顯著差異，昌吉市菌具有一定的低溫耐性，當(dāng)溫度為10～25℃時，其生長速率比沙灣市的病原菌生長速率快，其中10℃時病原菌Vc-2為0.160 cm/d，15℃時Vc-1為0.289 cm/d，20℃時Vc-3為0.373 cm/d，25℃時Vc-2為0.426 cm/d，隨著溫度的升高，兩地菌的生長速率明顯放緩，但與昌吉市的菌系相比，沙灣市大麗輪枝菌的生長速度明顯增快，其中Vd-1和Vd-5兩個菌生長速率可達(dá)0.250 cm/d，而昌吉市生長最快的菌Vc-3也僅為0.135 cm/d，生長速率比沙灣市的菌降低了1.85倍，病原菌的最適生長溫度均為25℃，昌吉市病原菌具有一定的低溫耐性，沙灣市病原菌具有一定的高溫耐性。表1

2.2 不同的離子對病原菌菌絲的影響

研究表明，棉花黃萎病病原菌在Ca2+、Na+、Mg2+和K+等4種不同離子的培養(yǎng)基上的生長速率具有明顯差異，昌吉市和沙灣市的病原菌在K+培養(yǎng)基的生長速率基本接近，病原菌Vd-1、Vc-2、Vc-3的生長速率最快，生長速率分別為0.407、0.413和0.413 cm/d，在Ca2+、Mg2+培養(yǎng)基上，來自沙灣市的病原菌Vd-3和Vd-5的生長速率最快，分別可達(dá)0.457和0.395 cm/d。在Na+培養(yǎng)基上，菌生長速率均放緩，而沙灣市病原菌Vd-3，Vd-4的生長速率最快，速率僅為0.367和0.372 cm/d。Na+培養(yǎng)基上的病原菌生長最為緩慢，不適宜黃萎病病原菌的生長，Ca2+培養(yǎng)基上的生長最快，適宜黃萎病病原菌的生長。圖1

2.3 不同pH值對病原菌生長速率的影響

研究表明，棉花黃萎病病原菌在pH值5～9時均可生長，隨著 pH 值的增高，堿性增強(qiáng)，菌絲生長速度減慢，與沙灣市的病原菌相比，昌吉市的某些菌株具有較高的酸堿度耐性，病原菌Vc-3在pH值5、7和8時的生長速度最快可分別達(dá)0.406、0.400和0.374 cm/d，病原菌Vc-2 在pH值6、9 時的生長速率分別為0.400和0.332 cm/d。兩地的各病原菌在同一pH值條件下的生長速率也有明顯分化，在pH 值5～7時生長速率最快，最適生長環(huán)境為酸性環(huán)境，對偏堿性環(huán)境也有較好的耐受性。棉花黃萎病病原菌的微菌核在偏堿性的環(huán)境下更容易形成。表2

2.4 不同的碳源對病原菌生長速率的影響

研究表明，棉花黃萎病病原菌在脫脂奶粉和蔗糖為碳源的2種培養(yǎng)基上均能正常生長，病原菌在2種碳源培養(yǎng)基上的生長速率有顯著差異，其中棉花黃萎病病原菌在蔗糖為碳源的培養(yǎng)基上的生長速率最快，為最適碳源培養(yǎng)基，沙灣市的病原菌和昌吉市的病原菌Vd-3、Vd-6、Vc-4的生長速率最快，生長速率分別為0.453、0.449、0.453 cm/d，昌吉市的病原菌Vc-1的生長速率較慢，生長速率為0.375 cm/d。其次是以脫脂奶粉為碳源的培養(yǎng)基，沙灣市和昌吉市的病原菌Vd-2、Vd-4、Vc-1、Vc-2的生長速率最快，生長速率分別為0.454、0.445、0.448和0.439 cm/d，沙灣市的病原菌Vd-1，Vd-5的生長速率較慢，生長速率分別為0.380和0.370 cm/d。圖2

2.5 棉花黃萎病病原菌抑菌藥劑室內(nèi)篩選

研究表明，多菌靈、枯草芽孢桿菌及哈茨木霉菌對病原菌的生長具有較好的抑制作用。多菌靈對沙灣市的病原菌Vd-3和昌吉市的病原菌Vc-4以及內(nèi)地病原菌V991的抑菌率較好，EC50值分別為0.358 8、0.292 3及0.228 6 μg/mL，并且沙灣市和昌吉市的病原菌對多菌靈的敏感度大于V991。乙蒜素和唑酮乙蒜素僅對沙灣市的Vd-3和昌吉市的Vc-2及沙灣市的Vd-2和昌吉市的Vc-4具有良好的抑菌效果，EC50值分別為32.32和41.49 μg/mL及26.08和84.82 μg/mL，而對內(nèi)地的病原菌V991的抑菌率較差，EC50值高達(dá)88.65 μg/mL，枯草芽孢桿菌分別對沙灣市的病原菌Vd-2和昌吉市的病原菌Vc-3及內(nèi)地病原菌V991的抑菌率較好，EC50值分別為1.813×10-2 、1.661×10-2 和1.538×10-2 μg/mL，枯草芽孢桿菌

對內(nèi)地病原菌的敏感度大于沙灣市和昌吉市的病原菌。哈茨木霉菌分別對來自沙灣市的Vd-1和昌吉市的Vc-3及V991的抑菌率較好，EC50值分別為0.181 、0.1015 和0.2695 μg/mL。哈茨木霉菌藥劑對V991敏感度大于沙灣市和昌吉市的病原菌。多菌靈、枯草芽孢桿菌及哈茨木霉菌是能有效防治兩地棉花黃萎病的有效制劑，而乙蒜素及唑酮乙蒜素對棉花黃萎病防效較差，不適宜為防治棉花黃萎病的藥劑。圖3

3 討 論

多菌靈、乙蒜素、枯草芽孢桿菌、哈茨木霉菌等化學(xué)農(nóng)藥與生物制劑是棉花黃萎病防治有效農(nóng)藥，如滴施木霉菌劑18.0 kg/667m2，可有效控制黃萎的蔓延，其防效可高達(dá)68.16%［15］，10×108 g枯草芽孢桿菌葉面噴霧的最佳濃度為300～600倍液，防治效果可達(dá)54.35%～57.35%［16］。80%乙蒜素乳油 800倍液對棉花黃萎病的防效為76.36%［17］。生物制劑和多菌靈混合可有效防治棉花黃萎?。?8］。研究針對性研究沙灣市和昌吉市的棉花黃萎病生物學(xué)特性，發(fā)現(xiàn)昌吉市和沙灣市的棉花黃萎病病原菌在不同的離子、酸堿度、溫度和不同的碳源下的生長速率，形態(tài)，微菌核的形成，菌絲的生長密度均存在一定的差異性，對離子和碳源利用方面，昌吉市的病原菌Vc-2和沙灣市的d-2和Vd-4能較高利用Na+、K+、Ca2+、Mg2+。昌吉市的Vc-4和Vc-1和沙灣市的Vd-6和Vd-2對蔗糖和脫脂奶粉有較高的利用。昌吉市的病原菌有一定低溫耐性，而沙灣市的病原菌有一定的高溫耐性，且病原菌最佳生長溫度均為25℃，病原菌在同一pH值條件下的生長速率有明顯分化，其中昌吉市的部分菌株對酸堿度的耐性更高。5種殺菌劑對昌吉市、沙灣市大麗輪枝菌的毒力差異顯著，蒜素、唑酮乙蒜素對黃萎病菌的抑菌作用較差，在昌吉市和沙灣市EC50值分別高達(dá)71.04 、111.6和79.22 、171.7 μg/mL。試驗研究為室內(nèi)毒力試驗，其施用方式、施用時間、防病機(jī)理以及大田防病效果仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

昌吉市、沙灣市棉花各病原菌最適生長的溫度為25℃，Ca2+培養(yǎng)基為最適培養(yǎng)基，兩市的各病原菌在pH值5～7時生長速率最快，最適生長環(huán)境為酸性環(huán)境，對偏堿性環(huán)境也有較好的耐受性。微菌核在偏堿性的環(huán)境下更易形成，昌吉市、沙灣市病原以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基上的生長速率最快，為最適碳源培養(yǎng)基。5種殺菌劑對兩市大麗輪枝菌的毒力差異顯著，乙蒜素、唑酮乙蒜素對黃萎病菌的抑菌作用較差，5種藥劑對昌吉市和沙灣市棉花病原菌的毒力依次為枯草芽孢桿菌gt;哈茨木霉菌gt;多菌靈gt;乙蒜素gt;唑酮乙蒜素。

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Biological characteristics and chemical control of

defoliating cotton Verticillium wilt

LAI Chengxia1， YANG Yanlong1，LI Chunping1， Mayila Yusuyin1， WANG Yan2， YANG Dong3，

YANG Ni1， GE Fengwei4， WANG Penglong1， MA Jun1

（1.Research Institute of Economic Crops， Xinjiang Academy of Agricultural Sciences， Urumqi 830091， China; 2. College of Science and Technology， Xinjiang Agricultural University， Urumqi 830091， China; 3. Plant Protection Station of Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi 830049， China; 4.College of Life Sciences， Xinjiang Normal University， Urumqi 830054， China）

Abstract：【Objective】 To compare the biological characteristics of defoliating cotton verticillium wilt pathogens from Changji and Shawan and clarify the control effects of carbendazim， ethyl allicin， ethyl azolone， that is， Bacillus subtilis and Trichoderma harzicum， which were commonly used in local production， on cotton verticillium wilt will be determined， and efficient and effective agents selected to guide the control of cotton disease.

【Methods】 The mycelial growth rate method was used to investigate the main biological characteristics of various pathogenic bacteria through adaptive growth of different ions， pH， carbon sources， and temperature. Meanwhile，the toxicity of five pesticides was measured indoors.

【Results】 The optimal temperature for the growth of pathogenic bacteria in Changji City and Shawan City was 20-25 ℃， the optimal ion culture medium was Ca2+， the optimal pH was 5-7， and the optimal carbon source was sucrose. All the 5 tested drugs had significantly different inhibitory effects on various pathogenic bacteria. Carbendazim， Bacillus subtilis and Trichoderma harzianum had strong inhibitory effects on pathogenic bacteria. The EC50 of carbendazim， Bacillus subtilis and Trichoderma harzianum to Changji was respectively 0.292，3-0.819，3 μg/mL，1.661×10-2-2.695×10-2 μg/mL， 0.101，5-0.884，6 μg/mL， for Shawan， 0.358，8 -5.694 μg/mL， 1.813 ×10-2-2.727 ×10-2 μg/mL，0.181，0-0.608，8 μg/mL， respectively， while allicin and azolidinone had the worst control effect on pathogenic bacteria， with an EC50 of 71.04 μg/mL、111.6 μg/mL in the Changji area and in the Shawan area 79.22 and 171.7 μg/mL.

【Conclusion】 In Changji and Shawan， 25 ℃ is the ideal temperature for the growth of several pathogens， and the ideal ion medium is the one that contains Ca2+. Different infections develop fastest in pH values between 5 and 7， therefore acidic environments are ideal for their growth. Additionally， they can withstand alkaline conditions well. Microsclerotia develop quickest on culture media containing sucrose as the carbon source and are more likely to occur in alkaline settings. Carbendazim， Bacillus subtilis and Trichoderma harzianum have strong bacteriostatic effects on cotton Vverticillium wilt in Changji and Shawan， which can be used to prevent and control the cotton disease.

Key words：defoliating pathotype；Verticillium wilt；biological characteristics；mycelial growth rate method；toxicity determination

Fund projects：The Agricultural Development Fund Project （20220126） ； The Agricultural Innovation Fund Project （2020026528-1）

Correspondence author：MA Jun（1983-），male，from Minqin， Gansu， associate researcher， research directon：Cotton germplasm resources and related research， （E-mail）xj.majun@163.com