田基黃總黃酮抗CCl4復(fù)合因素所致大鼠肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究

王永剛，譚沛，李沛波，徐冰，蘇薇薇，陳周全，彭維

（1. 中山大學(xué)生命科學(xué)大學(xué)院，廣州現(xiàn)代中藥質(zhì)量研究開發(fā)中心，廣東省植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510275；2. 華潤三九醫(yī)藥股份有限公司，深圳 518110）

肝纖維化是機(jī)體對物理、化學(xué)以及生物方面刺激引起的各種慢性肝損傷的一種修復(fù)反應(yīng)，也是多種慢性肝病的共有病理變化[1]。

田基黃始載于《生草藥性備要》，為藤黃科植物地耳草（Hypericum japonicumThunb.）的干燥全草，民間多用其治療急、慢性肝炎?，F(xiàn)代藥理研究表明，田基黃具有保肝、抑菌、抗病毒、增強(qiáng)免疫、抑制腫瘤和防治心血管系統(tǒng)疾病等多種藥理學(xué)作用[2,3]。田基黃化學(xué)成分主要為黃酮、間苯三酚類等多種化合物及其衍生物[4]。田基黃總黃酮提取物是我們從中藥田基黃中提取的有效部位（黃酮含量大于50%）[5]，目前正在按中藥五類新藥進(jìn)行開發(fā)。筆者對田基黃總黃酮抗CCl4復(fù)合因素所致大鼠肝纖維化進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料

1.1 藥物及試劑

田基黃總黃酮（黃酮含量為63.5%）：系我們從田基黃中提取分離得到； TBIL、DBIL、ALT、AST、SOD、MDA、GSH-Px、Hyp、GSH檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；大鼠TNF-α ELISA試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；HA、LN、PC-Ⅲ放免試劑盒購自上海海軍醫(yī)學(xué)研究所生物技術(shù)中心；MMP-1 ELISA試劑盒購自上海凱博生化試劑有限公司；TIMP-1ELISA試劑盒購自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司。

1.2 動(dòng)物

SD大鼠，SPF級，(180～220)g，雌雄各半，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號：SCXK（粵）2008-0002。

1.3 方法

取SD大鼠，參照文獻(xiàn)方法[6]，復(fù)制CCl4復(fù)合因素致大鼠肝纖維化模型，具體方法為：除正常對照組10只外，其余大鼠第1周（首次）用純CCl4 5 ml/kg對大鼠背部皮下注射，第2～6周用40% CCl4-橄欖油3 ml/kg 對大鼠背部皮下注射，2次/周。同時(shí)第1～6周內(nèi)，并以20%乙醇作為大鼠的唯一飲水，連續(xù)6周。將復(fù)制CCl4肝纖維化模型至第6周而存活的大鼠，按性別及體重隨機(jī)分成4組，每組10只，加上正常對照組，共計(jì)5組。然后分別給予藥物或蒸餾水：田基黃總黃酮低、中、高劑量組每天分別按9 mg/kg、18 mg/kg、36 mg/kg的劑量灌胃給予田基黃總黃酮1次，連續(xù)12周；正常對照組和模型對照組灌服等體積蒸餾水。末次給藥1h后，各組大鼠用乙醚輕度麻醉，于腹主動(dòng)脈采血，取血清采用試劑盒檢測TBIL、DBIL、ALT、AST、HA、LN、PC-Ⅲ、TNF-α水平；然后打開腹腔迅速取出肝組織并在生理鹽水下清洗，勻漿后采用試劑盒檢測SOD、MDA、GSH-Px和Hyp，采用ELISA法檢測MMP-1和TIMP-1蛋白的表達(dá)。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差” 表示，采用的統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）法，P＜0.05 表示差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 田基黃總黃酮對血清中肝功能指標(biāo)TBIL、DBIL、ALT、AST的影響

由表1可見，與正常對照組比較，模型對照組大鼠血清中TBIL、DBIL、ALT和AST水平均顯著升高（P＜0.01），提示該模型大鼠的肝細(xì)胞明顯破壞。田基黃總黃酮低、中、高劑量組大鼠血清中TBIL、DBIL、ALT和AST的水平與模型對照組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或0.05），說明田基黃總黃酮能降低CCl4復(fù)合因素所致肝纖維化大鼠的肝損傷程度。

2.2 田基黃總黃酮對肝纖維化指標(biāo)PC-Ⅲ、HA、LN、Hyp的影響

由表2可見，與正常對照組比較，模型對照組大鼠血清中PC-Ⅲ、HA、LN含量和肝組織中Hyp含量均顯著升高（P＜0.01），提示該模型大鼠具有明顯的肝纖維化病理改變。田基黃總黃酮低、中、高劑量組大鼠血清中PC-Ⅲ、HA、LN含量和肝組織中Hyp含量與模型對照組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或0.05），提示田基黃總黃酮對CCl4復(fù)合因素造成大鼠肝纖維化具有抑制作用。

2.3 田基黃總黃酮對肝組織 SOD、GSH-Px、MDA及血清中TNF-α的影響

由表3可見，與正常對照組比較，模型對照組大鼠肝組織SOD、GSH-Px活性顯著降低（P＜ 0.01），而MDA含量明顯提高（P＜0.01），提示肝纖維化模型大鼠肝臟的抗氧化水平顯著降低，氧化損傷明顯。此外，可通過多種機(jī)制參與肝纖維化過程調(diào)控的重要細(xì)胞因子TNF-α也顯著升高（P＜0.01）。而田基黃總黃酮低、中、高劑量組大鼠肝組織SOD、GSH-Px、MDA及血清中TNF-α與模型對照組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或0.05），說明田基黃總黃酮能提高CCl4復(fù)合因素造成的肝纖維化模型大鼠肝臟的抗氧化能力，顯著降低肝臟的氧化損傷，也能抑制TNF-α的分泌。

表1田基黃總黃酮對血清中肝功能指標(biāo)TBIL、DBIL、ALT、AST的影響( ±s, n=10)

表2田基黃總黃酮對肝纖維化指標(biāo)PC-Ⅲ、HA、LN、Hyp的影響( ±s, n=10)

表3田基黃總黃酮對肝組織 SOD、GSH-Px、MDA及血清中TNF-α的影響( ±s, n=10)

2.4 田基黃總黃酮對肝組織MMP-1和TIMP-1蛋白表達(dá)的影響

由表4可見，與正常對照組比較，模型對照組大鼠肝組織TIMP-1蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.01），而肝組織MMP-1無明顯變化（P>0.05），提示肝纖維化模型大鼠肝臟的TIMP-1蛋白表達(dá)增加，肝臟中細(xì)胞外基質(zhì)分解減少。而田基黃總黃酮低、中、高劑量組大鼠肝組織TIMP-1蛋白表達(dá)與模型對照組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或0.05），說明田基黃總黃酮能抑制CCl4復(fù)合因素造成肝纖維化模型大鼠肝臟的TIMP-1蛋白表達(dá)，顯著促進(jìn)肝臟中細(xì)胞外基質(zhì)的分解。

表4田基黃總黃酮對肝組織MMP-1和TIMP-1蛋白表達(dá)的影響( ±s, n=10)

3 討論

肝纖維化是是多種慢性肝病的共有病理變化。在各種致病因素作用下，靜止期的肝星狀細(xì)胞（HSC）被激活并增殖、轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，其細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的合成和分泌上調(diào)，而降解減少，最終導(dǎo)致ECM積聚而發(fā)生肝纖維化乃至肝硬化[7]。氧化應(yīng)激是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的重要因素之一。多種致肝損傷的因素往往伴隨氧化水平的升高或者抗氧化能力的下降，氧化應(yīng)激與肝纖維化病理機(jī)制之間的關(guān)系受到越來越多的重視[8]。諸多臨床和實(shí)驗(yàn)性肝纖維化都被證實(shí)與氧化應(yīng)激有關(guān)，使用抗氧化劑有助于減慢或阻止肝纖維化的發(fā)展[9～11]。

本實(shí)驗(yàn)研究顯示，田基黃總黃酮能顯著降低CCl4復(fù)合因素誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠血清中TBIL、DBIL、ALT、AST、PC-Ⅲ、HA、LN的水平、肝組織中Hyp的含量和MMP-1和TIMP-1蛋白的表達(dá)，說明田基黃總黃酮具有良好的抗CCl4復(fù)合因素誘導(dǎo)的肝纖維化的作用。此外，田基黃總黃酮也能提高肝組織SOD、GSH-Px的活性，降低肝組織MDA及血清中TNF-α的含量，提示田基黃總黃酮抗肝纖維化作用可能與其抗氧化作用及抑制TNF-α的分泌有關(guān)。該實(shí)驗(yàn)為田基黃總黃酮抗肝纖維化的臨床試驗(yàn)提供藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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