體外細胞轉化的應用及其影響因素

鄭曉彤，陳薛釵，賀帥，鐘儒剛

（北京工業(yè)大學生命科學與生物工程學院，北京市環(huán)境與病毒腫瘤重點實驗室，北京100124）

癌癥由于其快速增長的發(fā)病率及高死亡率，已經成為人類生命健康的重大威脅，在世界上引起了廣泛的關注和重視。在人類日常接觸的約6萬種化學和生物性因子中，除了已被國際癌癥研究署（IARC）確定的Ⅰ和Ⅱ類致癌物外，還有很多是可疑或未知的人類或動物腫瘤啟動劑或促癌劑。在過去30年中，全球患腫瘤人數已經翻了一倍，而我國每年新發(fā)癌癥病例約有三百多萬[1]。因此如何快速篩選并鑒定出這些物質的致癌活性，對預防癌癥至關重要。

目前常用的哺乳動物致癌實驗有小鼠皮膚腫瘤誘發(fā)試驗、小鼠肺腫瘤誘發(fā)試驗、大鼠肝轉變灶誘發(fā)試驗、雌性SD大鼠乳腺癌誘發(fā)試驗等，但是試驗周期長，需利用大量實驗動物?；诖?，體外細胞轉化系統(tǒng)的建立為腫瘤病因學、腫瘤發(fā)病機制及其防治措施的研究提供了一個良好的實驗模型和有力的技術手段[2]。體外細胞轉化系統(tǒng)概念最早由Berwald等[3]提出，他們用碳氫化合物處理二倍體小鼠成纖維細胞，可得到具有癌變性質的多層細胞克隆。1966年，Borek等[4]首先應用X 射線成功誘發(fā)二倍體地鼠成纖維細胞惡性轉化。1977年，日本學者Kakunaga[5]首先應用甲基硝基亞硝胍（MNNG）和4-硝基喹啉-1-氧化物（4-NQO）體外誘發(fā)正常婦女口唇皮膚組織二倍體成纖維細胞惡性轉化。此時，體外細胞轉化系統(tǒng)開始逐漸形成。正常細胞經過適當刺激后發(fā)生細胞形態(tài)及生物學特性的改變，獲得接近于腫瘤細胞的性質，如呈上皮樣細胞形態(tài)、排列紊亂、失去方向性、形成交叉和旋渦、失去細胞密度調節(jié)作用、染色體核型異常、可以在半固體瓊脂培養(yǎng)基中形成集落等，這種細胞變化稱為細胞轉化[6]。細胞是腫瘤發(fā)生的基本單位，研究正常細胞如何演變成腫瘤細胞是腫瘤研究中的一個根本問題。體外細胞轉化是從細胞生物學和分子生物學水平上研究腫瘤的發(fā)生與發(fā)展的基本技術[7]，它能夠快速檢測有遺傳毒性的化學品在致癌中的作用，在研究腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、防止及治療等方面具有重要意義。

1 細胞轉化

體外細胞轉化非常近似地模擬了動物致瘤過程，是眾多方法中較有可能替代動物實驗的方法，其檢測效能得到了許多研究者和包括IARC和歐洲替代方法研究中心（ECVAM）等眾多機構關注。IARC根據早期數據認為體外轉化與體內致癌物間具有很好的相關性，一致率達69%～85%。ECVAM對Balb/c-3T3細胞轉化實驗的效能參數進行了總結[8]，表明該方法與體內實驗一致性為71%，靈敏性和特異性分別為80%和60%，陽性預測率為70%，陰性預測率為71%。因此，細胞轉化實驗能為鑒定人類可能的致癌因子提供非常有價值的信息。

1.1 細胞轉化

研究顯示，體外細胞轉化是一個多階段的過程：（1）在動物實驗中致癌的化學物質可誘導正常細胞轉化；（2）惡性轉化的細胞可在敏感動物體內致瘤，而非轉化細胞則不能致瘤；（3）在轉染活性癌基因的實驗中，正常細胞向惡性細胞發(fā)展的不同階段會表現出多個不同的表型；（4）促癌劑可增強經低濃度啟動劑處理過的細胞的轉化頻率[9]；（5）已在動物體內實驗中確認的幾種環(huán)境毒素，有90%以上可在兩階段體外細胞轉化檢測中得到陽性結果[10]。

1.2 細胞轉化的鑒定

在判別細胞轉化的標準中，通常所采用的指標有：細胞形態(tài)學及其生長狀況的改變；染色體核形異常；細胞轉化灶的形態(tài)；半固體瓊脂培養(yǎng)基中形成集落的能力；以及在免疫抑制動物或裸鼠體內的致瘤能力；此外，還可通過細胞突變、ConA 凝集反應進行鑒別。

通過細胞形態(tài)學及其生長狀況的變化判定細胞轉化實驗的結果主觀性太強，而細胞轉化實驗在致癌物的篩選和早期抗癌藥物的制備中具有重要意義，因此建立快速、簡便、可靠的體外檢測方法是毒理學研究中亟需解決的問題。近年來，從分子水平尋找基因標志物判定細胞轉化的終點成為改進細胞轉化檢測方法的一個方向。Sakai[11]等利用mRNA 差異顯示方法發(fā)現轉化時7個上調基因和7個下調基因，其中有5個為促癌劑TPA和崗田酸共有的改變。Maeshima[12]等利用基因芯片技術，鑒定出22種細胞轉化的基因標志物。這22種基因參與細胞周期、轉錄調節(jié)、抗細胞凋亡和細胞分裂正調節(jié)。基因標志物與細胞轉化實驗的結果具有相關性，表明以基因標志物為基礎的細胞轉化實驗技術可能成為促癌物篩選的有效方法。此外王穎[13]等成功建立了Bhas 42細胞轉化試驗的H2O2法并實現了高通量檢測，使細胞轉化實驗的周期縮短且提高了結果的準確性。隨著研究的不斷深入和改進，細胞轉化實驗能在致癌物的篩選、抗癌新藥的研制和藥物毒理學的驗證等方面發(fā)揮更加重要的作用。

2 細胞轉化的應用

2.1 檢測物質的致癌潛力

細胞轉化實驗具有檢測各種類型致癌物的潛力，包括基因毒性和非基因毒性致癌物。然而，目前用于評估的數據存在著致癌物和非致癌物數量不均衡問題，需增加非致癌物檢測數據，以提高特異性值可靠性。另外，還需增加數據庫中被檢測化學物的數量，以使評估數據更加準確。細胞轉化實驗方法最初建立的目的是從人類接觸的環(huán)境致癌物中篩選出可能具有致癌活性的物質[14]，早期的方法僅能用于啟動劑的檢測，主要為基因毒性致癌物；后來發(fā)展起來的兩階段轉化方法使其還可以用于促癌劑的篩選，及藥物對細胞的作用等方面。細胞轉化實驗的終點與體內腫瘤的形成十分接近，因而它是用來測試化學致突變物和致癌物的重要實驗方法。

2.2 檢測致癌因子間的相互作用

細胞轉化實驗也可被應用到多種致癌因子間相互作用檢測。檢測發(fā)現某些不具有致癌性，有時甚至可能具防癌作用的物質，在與致癌物相互作用時反而具協(xié)同促癌作用。Perocco[15]等在檢測十字花科蔬菜中水田芥甙對苯并[a]芘（B[a]P）促轉化作用影響時發(fā)現，具防癌作用的水田芥甙單獨作用時并不具促轉化作用，但與B[a]P共同作用時卻能使B[a]P的致癌活性增加約7 倍。具相同作用的還有β-胡蘿卜素，可顯著加強由B[a]P和香煙冷凝物引起的細胞惡性轉化[16]。王李偉[17]等利用Balb/c 細胞轉化方法發(fā)現三羥異黃酮也具加強B[a]P引起的細胞轉化作用。這種協(xié)同作用均發(fā)生在營養(yǎng)物質與B[a]P聯(lián)合作用上，具體機制可能與細胞色素氧化酶系激活有關，該酶系是B[a]P代謝為終致癌物的關鍵。而已經是終致癌物的MCA 對Balb/c-3T3 細胞的轉化作用則不受β-胡蘿卜素的影響。

2.3 篩選抑癌物

細胞轉化實驗亦逐漸被用于抑癌物的篩選。Tsuchiya[18]等在促癌階段應用抗壞血酸及其衍生物，觀察它們的抑癌作用。結果表明，抗壞血酸及其衍生物可以顯著抑制TPA、二癸酸佛波酯和腫瘤壞死因子對細胞轉化的促進作用。而β-胡蘿卜素對苯并[a]芘及香煙氣冷凝物的協(xié)同促轉化作用則可被維生素E和α-萘黃酮所抑制[19]。Tsujino[20]等采用Balb/c-3T3細胞研究新型人工合成無環(huán)視黃醇NIK/333的抗癌作用，發(fā)現其與全反式維甲酸有相似的抑制作用，并發(fā)現Balb/c-3T3細胞具有類維生素A 受體，可提高細胞間隙連接通訊水平。解瑞寧[21]等則利用Balb/c -3T3 細胞發(fā)現番茄紅素可以阻止苯并(a)芘誘導的細胞轉化作用，且維生素E 的存在能增強番茄紅素的抗轉化作用。Nishikawa[22]等首次報導了增補鉑納米顆粒的電解還原水可以在促癌階段抑制細胞的惡性轉化，從而發(fā)現一種新的具有抗癌功能的抗氧化劑。

綜上所述，細胞轉化實驗是檢測物質致癌活性的重要方法。最近的研究發(fā)現細胞轉化實驗還可用于研究癌癥中microRNA表達使耐藥性產生的機制[23]。細胞轉化實驗在基礎研究中發(fā)揮了重要作用。

3 細胞轉化的影響因素

致癌因子的范圍很廣，化學因子包括多環(huán)芳烴、烷化劑、金屬化合物及芳香胺類等物質，物理因子包括輻射，生物因子有病毒等。致癌物作用后能否引起細胞轉化、轉化率高低和潛伏期的長短等還要受其它內、外因素的影響。

3.1 細胞系的選擇

細胞在體外生長過程中，其生物學特性要穩(wěn)定，細胞對致癌因子的作用反應要敏感；細胞本身自發(fā)轉化率要低；對外界影響細胞轉化的因素要明確；應是正常細胞。目前國內外常用于體外細胞轉化實驗的細胞系主要有三種：（1）金黃地鼠胚胎細胞（GHE）、腎細胞或乳鼠肺細胞等；（2）小鼠胚細胞、成纖維細胞、前列腺細胞等；（3）大鼠胚胎細胞、肺成纖維細胞、氣管上皮細胞、肝上皮細胞等。

靶細胞還可以分為原代培養(yǎng)細胞和傳代培養(yǎng)細胞。原代培養(yǎng)細胞的代表是敘利亞地鼠的胚胎成纖維細胞（SHE）。該細胞容易制備和培養(yǎng)，自發(fā)轉化率較低，轉化后容易識別并能以定量的方式獲得數字結果。此外，它的測試周期較短，具有代謝多種化學致癌物，使其成為終末致癌物的能力，比較適于檢測環(huán)境中的各種可疑致癌物。但亦有研究表明，該系統(tǒng)對環(huán)境中的易變因素過于敏感，如容易受到小牛血清的不同來源和特定胚胎細胞池的影響[24,25]；另外，它的細胞群是異質的，在無飼細胞層的條件下，克隆形成率較低。傳代細胞系是原代培養(yǎng)細胞經首次傳代成功后獲得的細胞系，也可細分為有限細胞系和連續(xù)細胞系[26]。常用的Balb/c-3T3、 C3H10T1/2 和BHK-21均為連續(xù)細胞系。

傳代細胞系較原代培養(yǎng)細胞系具有細胞群落穩(wěn)定性高，試驗重復性良好，劑量反應關系明顯等特點[27]，常用于實驗研究。由于人類癌癥約70% 來自上皮細胞，因此以上皮細胞作為靶細胞更具備實際意義。但上皮細胞建系困難，而且轉化細胞的判定標準不如成纖維細胞那樣明確，因此對于轉化實驗體系的優(yōu)化尤為迫切[28]。

3.2 其它影響因素

細胞轉化還要受其它因素的制約：（1）受細胞來源的影響。與供體的種屬有關，小鼠、金黃地鼠胚胎細胞對化學致癌物致癌作用很敏感，而人的成纖維細胞則不敏感[29]；（2）與細胞性質相關。細胞分化程度與轉化潛伏期長短呈負相關，如妊娠12天的鼠胚細胞和20個月月齡金黃地鼠皮膚成纖維細胞誘發(fā)轉化的潛伏期分別為20.3和10.8 個細胞群體倍增時間（TD）。間質細胞較上皮細胞敏感，后者細胞轉化率低，潛伏期長[30,31]，可長達4 個月或更長；（3）受培養(yǎng)條件變化的影響。培養(yǎng)基內血清濃度降低，則細胞轉化率降低。在有滋養(yǎng)層細胞存在時，細胞轉化率提高。培養(yǎng)溫度降低(如由37℃ 降到32℃)、加入兩性霉素和長期缺氧則可使己轉化的細胞失去轉化細胞的生物學性質[32]；（4）與化合物對細胞作用的方式相關。多環(huán)芳香族碳氫化合物很快與靶細胞DNA 、RNA 和蛋白質結合，特別是與細胞核DNA 的結合[33]。DNA鏈結構受損，引起細胞遺傳信息改變，細胞首先發(fā)生突變，進一步染色體畸變和新型核組出現。在致癌物作用下，在前5～10 代細胞可發(fā)生突變，傳代至50～150個TD后能在軟瓊脂培養(yǎng)基中生長、增殖，形成細胞集落的轉化細胞在動物接種后可達100%惡性腫瘤形成率。胞漿內RNA、蛋白質等的改變在細胞轉化方面不起關鍵作用。如用3H-TdR和氖一尿嘧啶核苷（3H-U）分別摻入到胞核DNA和胞漿RNA 、蛋白質內，只有3H-TdR才能引起細胞突變和轉化[34]。

4 結語

細胞轉化實驗作為篩選致癌物一種有效方法已被廣泛地應用，然而構建更加穩(wěn)定敏感的細胞系，客觀和精準的檢測指標和檢測手段仍需進一步研究。人體細胞是最為理想的轉化實驗靶細胞，然人體細胞化學物質轉化最終形成癌細胞是一個相當復雜的過程，無法用常規(guī)方法篩選。因此在這方面進行更深入地研究將有助于學者發(fā)現未知的潛在致癌因子，進一步探知癌癥的致病機理，為藥物毒性的檢測提供一個強有力的手段。隨著分子生物學與生物化學、遺傳學及免疫學等學科的交叉發(fā)展，細胞轉化實驗將在研究腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、防止及治療等方面發(fā)揮重要作用。

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