酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法與免疫膠體金技術(shù)在沙眼衣原體檢測(cè)中的應(yīng)用比較

高毅云 劉傳桂

沙眼衣原體是一種特別常見的生殖系統(tǒng)病原菌，可以在男性尿道和女性陰道內(nèi)大量繁殖，在陰道炎或非淋球菌性及淋球菌性尿道炎中均有較高檢出率，是一種典型的性傳播疾病[1-2]?？谇?、直腸、生殖道和眼結(jié)膜等是主要的發(fā)病部位，可誘發(fā)沙眼、包涵體包膜炎、泌尿生殖道感染、性病淋巴肉芽腫等疾病，對(duì)患者危害極大[3]。沙眼衣原體感染常表現(xiàn)急性癥狀、低癥狀或無癥狀，急需一種快速、精確、靈敏的檢測(cè)方法。目前臨床上有很多種檢測(cè)沙眼衣原體的方法，其中細(xì)胞培養(yǎng)法是公認(rèn)的金標(biāo)準(zhǔn)，但是細(xì)胞培養(yǎng)耗時(shí)長(zhǎng)、條件高，不適合大樣本檢測(cè)，本研究通過臨床對(duì)比，探討酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）和免疫膠體金技術(shù)在沙眼衣原體檢測(cè)中的應(yīng)用情況，旨在為沙眼衣原體的檢測(cè)提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年1月-2014年1月來本院就診的90例疑似沙眼衣原體感染患者作為研究對(duì)象，其中男39例，女51例，年齡19~71歲，平均（38.2±3.7）歲，病程1~8周，大部分患者無明顯癥狀，少數(shù)出現(xiàn)尿頻、尿急現(xiàn)象甚至產(chǎn)生膿性分泌物，所有患者排除淋球菌感染的可能。

1.2 方法

1.2.1 取樣方法 女性患者宮頸標(biāo)本采集：首先以無菌大棉簽清潔宮頸口處的分泌物，再另取1根棉簽插入到宮頸1~2 cm處，緩慢旋轉(zhuǎn)數(shù)次，期間不能觸碰到陰道內(nèi)壁，取出棉簽后放入傳送管中[4]。男性患者尿道樣本采集：囑患者采樣前1 h勿小便。使用尿道拭子緩慢插入到尿道2 cm處，稍用力旋轉(zhuǎn)一圈后停留半分鐘取出，備用。如尿道中含有分泌物，應(yīng)先檢查淋球菌。所有患者同時(shí)采集3份標(biāo)本，且室溫下放置時(shí)間不超過4 h，并分別根據(jù)檢測(cè)方法的具體要求分類處理。

1.2.2 檢測(cè)方法 分別對(duì)3份標(biāo)本采用細(xì)胞培養(yǎng)法、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法和免疫膠體金技術(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)，其中細(xì)胞培養(yǎng)法和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法嚴(yán)格按照臨床要求、操作說明進(jìn)行。

ELISA檢測(cè)：將棉簽標(biāo)本放入加有1000 μL紅色裂解液的裂解管中，95 ℃水浴20 min，冷卻15 min后擠壓棉簽并取出，儀器自動(dòng)判別陰性或陽(yáng)性結(jié)果。采用Micro Track XL System全自動(dòng)酶免分析儀（購(gòu)自愛爾蘭Trinity Biotech Plc公司），試劑盒由上海科華生物工程股份有限公司提供，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作；免疫膠體金檢測(cè)：向裂解管中滴入無色裂解液A液5滴，立即放入棉簽，以手指擠壓裂解管中棉簽頭，轉(zhuǎn)動(dòng)棉簽15次并靜置2 min；再向同一裂解管中豎直加入裂解液B液6滴，以手指擠壓裂解管中棉簽頭，轉(zhuǎn)動(dòng)棉簽15次并靜置1 min。擠干裂解管中棉簽頭后棄去，旋緊裂解管滴頭加入加樣孔進(jìn)行測(cè)定。需要注意的是檢測(cè)時(shí)應(yīng)在10~20 min內(nèi)查看結(jié)果，超過20 min后結(jié)果無效，如果出現(xiàn)2條紅色條帶則表示患者為陽(yáng)性，如果僅出現(xiàn)1條紅色條帶表示患者為陰性[5]。

1.3 計(jì)算方法 以細(xì)胞培養(yǎng)的檢測(cè)結(jié)果作為“金標(biāo)準(zhǔn)”來計(jì)算酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法和免疫膠體金技術(shù)的靈敏度和特異度，靈敏度=真陽(yáng)性例數(shù)/（真陽(yáng)性例數(shù)+假陰性例數(shù)）×100%。特異度=真陰性例數(shù)/（真陰性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù)）×100%[6]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料采用 字2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法檢測(cè)結(jié)果的比較 采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)90例疑似沙眼衣原體感染的患者，結(jié)果陽(yáng)性患者12例，陽(yáng)性檢出率為13.3%，其中男性陽(yáng)性檢出率為17.9%（7/39），占總數(shù)的7.8%（7/90），女性陽(yáng)性檢出率為9.8%（5/51），占總數(shù)的5.6%（5/90）。免疫膠體金檢測(cè)出陽(yáng)性患者10例，檢出率11.1%，其中男性陽(yáng)性檢出率為12.8%（5/39），占總數(shù)的5.6%（5/90），女性陽(yáng)性檢出率為9.8%（5/51），占總數(shù)的5.6%（5/90）。兩種方法在檢測(cè)女性患者沙眼衣原體陽(yáng)性率方面比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），在檢測(cè)男性患者沙眼衣原體陽(yáng)性率方面比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 兩種方法靈敏度和特異度的比較 采用細(xì)胞培養(yǎng)作為檢測(cè)沙眼衣原體感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”，結(jié)果90例患者中陽(yáng)性13例，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)結(jié)果中假陽(yáng)性患者1例，假陰性患者2例，靈敏度91.7%，特異度97.4%；免疫膠體金技術(shù)檢測(cè)結(jié)果中假陽(yáng)性患者1例，假陰性患者4例，靈敏度90.0%，特異度95.0%。兩種方法在檢測(cè)沙眼衣原體陽(yáng)性率的靈敏度和特異度上比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3 討論

沙眼衣原體屬于一種極為常見的性傳播疾病，平均感染潛伏期為1~3周，具有發(fā)病率高、危害大、易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)[7-8]。目前全世界范圍內(nèi)由沙眼衣原體引起的性傳播疾病發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[9]。沙眼衣原體主要易感部位包括口腔、直腸、生殖道和眼結(jié)膜等，可使患者產(chǎn)生沙眼、包涵體包膜炎、泌尿生殖道感染、性病淋巴肉芽腫等疾病。泌尿生殖系統(tǒng)被沙眼衣原體感染的患者會(huì)出現(xiàn)尿急、尿痛等癥狀，女性患者還會(huì)并發(fā)宮頸內(nèi)膜炎，表現(xiàn)為黃色黏液膿性分泌物增多、觸之易出血、水腫、充血及腹部不適等癥狀，亦有相當(dāng)數(shù)量患者癥狀輕微或無任何臨床癥狀[10]；男性患者常并發(fā)尿道炎，表現(xiàn)為尿痛、刺癢、尿道分泌物增加等癥狀[11]。如果沙眼衣原體寄生在男性尿道或者前列腺上皮細(xì)胞內(nèi)，會(huì)破壞患者的產(chǎn)精和排精功能，造成男性不育等情況。因此，找到更為簡(jiǎn)便、快捷的檢測(cè)方法來盡早的確診沙眼衣原體的感染情況具有重要的意義。目前臨床上檢測(cè)沙眼衣原體的方法有很多種，主要包括細(xì)胞培養(yǎng)法、ELISA法、熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)、免疫膠體金技術(shù)等。因?yàn)榧?xì)胞培養(yǎng)法的敏感度和特異度非常高，培養(yǎng)結(jié)果無假陽(yáng)性，常作為國(guó)際上檢測(cè)沙眼衣原體的實(shí)驗(yàn)室診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是細(xì)胞培養(yǎng)周期長(zhǎng)、操作復(fù)雜、需要侵入性取材及成本高，不適合作為基層醫(yī)院的常規(guī)檢測(cè)方法[12]。熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)敏感性及準(zhǔn)確性高，但檢測(cè)成本及適用條件較高，基層醫(yī)院應(yīng)用較少。ELISA法和免疫膠體金技術(shù)條件要求不高，一般實(shí)驗(yàn)室即可滿足，故應(yīng)用較為廣泛。

免疫膠體金技術(shù)是以膠體金為標(biāo)記物，利用特異性抗原抗體反應(yīng)對(duì)抗原或抗體進(jìn)行定性、定量分析的標(biāo)記方法，按抗原抗體反應(yīng)原理可分為雙抗體夾心法、雙抗原夾心法、捕獲法以及競(jìng)爭(zhēng)抑制法，屬于一種常見的固相標(biāo)記免疫標(biāo)記技術(shù)。免疫膠體金標(biāo)記可用于常規(guī)光鏡、透射電鏡及掃描電鏡，可同時(shí)檢測(cè)多種物質(zhì)，對(duì)組織細(xì)胞非特異性吸附作用小，具有高敏感性及高特異性。膠體金本身為鮮艷橘紅色，是高電子密度顆粒性標(biāo)記物，可根據(jù)金顆粒數(shù)目于不同視野中對(duì)抗原進(jìn)行本定量分析，極少遮蓋超微結(jié)構(gòu)，定位能力精確。金顆粒激發(fā)電子能力強(qiáng)，用于X射線衍射及掃描電鏡分析，可對(duì)多糖、多肽、蛋白質(zhì)、凝集素及抗體葡萄球菌蛋白A等生物大分子物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。研究表明，免疫膠體金技術(shù)在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。郭建等[13]采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法驗(yàn)證糧食中玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇兩種真菌毒素的膠體金快速測(cè)試卡效果，證實(shí)了膠體金檢測(cè)在糧食中的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性、適用性及重復(fù)性。另外，真菌毒素及違禁藥物檢測(cè)中亦顯示出它的優(yōu)勢(shì)。李月越等[14]對(duì)同一份標(biāo)本甲型及乙型流感病毒采用間接免疫熒光法和膠體金免疫層析法進(jìn)行檢測(cè)，顯示一致性較好，表明免疫膠體金技術(shù)操作簡(jiǎn)單，可單份檢測(cè)，結(jié)果直觀，敏感性及特異性高。

另外，該檢測(cè)方法不需要任何儀器設(shè)備和試劑，幾分鐘即可得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果并用肉眼可以觀察到，試驗(yàn)結(jié)果可隨時(shí)保存，適合于大面積普查、大批量時(shí)間緊及野外作業(yè)人員檢測(cè)，可在基層醫(yī)院及單位推廣。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法是一種在免疫酶技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新型特殊試劑分析方法，屬于將抗原抗體免疫反應(yīng)及酶高效催化作用原理有機(jī)結(jié)合起來的檢測(cè)技術(shù)，基本原理為借助于酶的高效性使某種固相載體與具有免疫活性的抗原或抗體結(jié)合，檢測(cè)時(shí)加入受檢樣品和酶標(biāo)記物，洗滌后加入酶催化底物，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)物質(zhì)的定性及定量檢測(cè)。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法中酶活性易受反應(yīng)條件影響，因此存在重復(fù)性及準(zhǔn)確性差等問題。此外，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法需低溫保藏，試劑壽命短，但操作方便，在疾病預(yù)防、食品檢測(cè)及臨床檢驗(yàn)診斷中意義重大，具有重復(fù)性好、特異強(qiáng)、敏感性高及漏檢率低等顯著優(yōu)勢(shì)。宿俊彪等[15]采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法對(duì)乙肝病毒患者標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè)，得到各項(xiàng)血清標(biāo)志物檢測(cè)較好，人為干擾因素較少，提示酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法有助于提高檢測(cè)特異性及靈敏度。研究表明，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法與免疫膠體金技術(shù)靈敏度基本相近，多數(shù)試驗(yàn)敏感度均可達(dá)到1 ng/mL或更低水平[16]，證實(shí)了兩種檢測(cè)方法較高的應(yīng)用價(jià)值。

為了找到更為簡(jiǎn)便、快捷的檢測(cè)方法，本研究選取2012年1月-2014年1月來本院就診的90例疑似沙眼衣原體感染患者作為研究對(duì)象，探討酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法與免疫膠體金技術(shù)在沙眼衣原體檢測(cè)中的應(yīng)用情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法與免疫膠體金技術(shù)對(duì)于沙眼衣原體檢測(cè)均為非常有效的方法，兩種方法在檢測(cè)沙眼衣原體陽(yáng)性率靈敏度及特異度上無顯著差異，但酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法男性陽(yáng)性率明顯高于免疫膠體金技術(shù)，表明酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法在檢測(cè)男性沙眼衣原體感染方面更具優(yōu)勢(shì)，與此同時(shí)，免疫膠體金技術(shù)耗時(shí)時(shí)間較酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法明顯縮短。因此臨床上兩種方法靈活運(yùn)用，患者較少而且急需結(jié)果時(shí)可以選用免疫膠體金技術(shù)檢測(cè)，患者較多時(shí)，用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)。對(duì)于不急于要求檢驗(yàn)結(jié)果的男性患者，可以積攢到一定數(shù)量后集中進(jìn)行檢驗(yàn)，不但可以保證男性患者的感染檢出率，也可以大大節(jié)省成本、提高效率。

綜上所述，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法和免疫膠體金技術(shù)均是檢測(cè)沙眼衣原體較為快捷、有效的方法，基層醫(yī)院可以根據(jù)實(shí)際情況靈活應(yīng)用。

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